重组PRRSV GP3和GP5 DNA疫苗的免疫学评价在活的有机体内
武圣赵
1，
林嘉绮张2，Wenchao太阳2，
Changzhan谢
2，
他张
2，
严高
2，Shubo温2，
卓哈哈
2，
福南
2，
象屿朱
2，盛冯2，
鑫曹
2，应张1 *，Yanzhu朱3、4 *，
Ningyi金
1、2 *而且
Huijun陆
2 *
- 1吉林大学动物科学学院动物医学院，长春
- 2中国农业科学院长春兽医研究所，长春
- 3.中国农业科学院特产研究所，长春
- 4吉林农业科技大学动物科技学院，吉林
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对全世界猪的健康构成威胁，但市售疫苗对PRRSV感染的保护有限。有必要研制一种更有效的DNA疫苗。在猪身上检测了含有三种佐剂的DNA疫苗的免疫效果(Susscrofa释放有)感染PRRSV。这些DNA疫苗编码PRRSV GP3和GP5，用A1, A2和A3配制。血清特异性和中和抗体，IL-4, IFN-γ， IL-2, IL-10, CD4+和CD8+测定t淋巴细胞、健康状况、组织病理学和病毒载量。结果表明，与其他佐剂相比，A3佐剂的使用导致猪体内更高水平的中和抗体和更低的病毒载量。pVAX-GP35+A1组和pVAX-GP35+A3组中和抗体滴度在35 dpi时达到1:19的峰值。pVAX-GP35+A3组IL-4最大浓度为136.77 pg/mL。在35 dpi时，pVAX-GP35+A1组的IFN-γ浓度为227.4 pg/mL。pVAX-GP35+A3组IL-2和IL-10表达量最高，分别达到597.6 pg/mL和189.1 pg/mL。我们发现一种配方显示出有益的免疫结果。这项研究提供了一种替代疫苗来保护猪免受PRRSV的感染。
简介
二十多年来，猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)一直被认为是世界上最具商业价值的猪疾病之一。在美国，PRRS每年对美国养猪业造成至少600万美元的损失(Neumann等人，2005年)，此外，在世界各地(伦尼等人，2010年)．由于呼吸窘迫引起的缺氧使耳朵变蓝，PRRS最初被称为蓝耳猪病(Wensvoort等人，1991年)．在东南亚，PRRS病毒(PRRSV)感染最初被认为与高热有关，表现为严重的呼吸道疾病，并导致所有年龄的猪大量死亡(田等，2007)．由于PRRSV具有抑制宿主免疫系统的能力，它增加了继发感染的易感性，随后，更严重的慢性疾病(Van Reeth等人，1996年)．最近最广泛使用的PRRSV修饰活疫苗(mlv)能够对同源病毒提供中等程度的保护，对其他基因类型的PRRSV (基曼等人，2009年)．此外，MLV的使用与一些危害有关。该病毒可使暴露在环境中的猪患上严重疾病。MLV接种物可能含有外来感染因子，使PRRSV在整个畜群中传播并传播到其他畜群(门格尔,2005；门格尔,2005 b)．此外，已发现接种减毒活疫苗后有病毒脱落的危险，可导致健康动物潜伏感染(Zhu等，2022)．安全性高是灭活疫苗的特点。由于细胞免疫效果较弱，许多人很难在灭活疫苗和MLV之间做出选择。因此，由于其优越的安全性，全面的体液和细胞免疫效应DNA疫苗已在全球范围内获得批准(Renukaradhya等人，2015)．禽流感DNA疫苗获准在中国上市(蒋等，2007)，印度紧急批准使用SARS-CoV-2 DNA疫苗(Mallapaty 2021)，这是DNA疫苗首次应用于人类。
DNA疫苗转移编码病毒抗原的基因通过DNA载体质粒。这种策略有效地激活体液和细胞免疫反应(西尔韦拉等人，2017年)．与传统的活疫苗或减毒疫苗相比，DNA疫苗有几个优点，包括能够诱导广泛的细胞和体液免疫反应，而没有病毒复制的风险，以及在需要改变抗原编码基因时易于修改(徐等，2014)．
在本研究中，猪用DNA疫苗与各种佐剂联合免疫，以评估其在刺激保护性免疫反应方面的功效。这项研究为未来避免高致病性PRRSV暴发和减少与此类暴发相关的经济损失提供了实用的技术基础。
材料与方法
病毒细胞和实验动物
高致病性PRRSV GD株由华南农业大学赠送。PRRSV在含有10%胎牛血清(FBS, Gibco)的Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)中培养的MARC-145细胞中繁殖。36头长白-约克杂交仔猪(28日龄断奶)来自长春(中国吉林)无prrsv农场。猪经PCR和ELISA检测，PRRSV均为阴性。将猪分为6组(n = 6，阴性组为pVAX载体组，阳性组为4个疫苗接种组，灭活疫苗组)，每组分别圈养。
DNA疫苗和佐剂
在初步调查中，DNA疫苗pVAX-GP35被开发出来(图1一个)．佐剂A1是皂苷提取物，而佐剂A2是水-油-水混合物。佐剂A1和A2的组合构成佐剂A3。
图1免疫后抗体水平的变化。(一)本研究中使用的DNA疫苗。(B)重组DNA疫苗接种猪的中和抗体。(C)GP3蛋白通过35 dpi的IRPC。除阴性组外，免疫后14 d及以上各组均为阳性。(D)GP5蛋白通过35 dpi的IRPC。除阴性组外，7 dpi及以上各组均为阳性。(* P < 0.05, * * * * * P < 0.01, P < 0.001, * * * * P < 0.0001)。各组均显示3项资料的均数±标准差。折线图上折线上方的符号表示当前dpi相对于7 dpi，颜色表示免疫组。线下的彩色符号表示与商业疫苗相比的免疫组。Ns，没有显著差异。
重组DNA疫苗组和PRRSV挑战
采用重组DNA疫苗pVAX-GP35、pVAX-GP35+A1、pVAX-GP35+A2、pVAX-GP35+A3免疫4组，每组6头猪。阴性对照组接种pVAX空载体，阳性对照组接种商业疫苗(上海和乐生物科技有限公司)。每只免疫组猪接种500 μg疫苗质粒。接种后每7天采集一次猪血，共35天。第一次接种后21天开始第二次接种(加强剂)。所有小组都接受了2×10的挑战5TCID50计算免疫后35 d的PRRSV (dpi)和攻毒后14 d的病毒载量。
中和抗体检测
从猪身上采集的血清样本在56°C下热灭活0.5小时。检测中和抗体，150tcid50将PRRSV /mL加入2% FBS的DMEM中，然后将测试血清连续稀释2倍(Fu等，2022)，在37℃下孵育1小时。然后将混合物应用于MARC-145细胞单层，在37°C、5% CO下培养4天2．采用斯皮尔曼-卡伯方法(芬尼,1985)，计算每个血清样本的稀释度，以提供能够保护50%的细胞免受细胞病变效应(CPE)的中和抗体效价。
特异性抗体检测
按照试剂盒厂家说明书(Porcine PRRSV- gd GP3 Ab ELISA kit ZR183和Porcine PRRSV- gd GP5 Ab ELISA kit ZR181, HCB, China)检测PRRSV GP3和GP5抗体。IRPC通过OD计算450IRPC=(OD .样本——OD负÷ (od)标准——OD负)×100。IRPC值超过20则为阳性。
细胞因子检测
按照制造商说明，ELISA试剂盒检测血清IL-4、IFN-γ、IL-2和IL-10 (eBioscience, San Diego, CA, USA)。
CD4+和CD8+t淋巴细胞流式细胞术分析
外周血淋巴细胞(1×106从血液样本中提取细胞100 ul)，用抗猪CD3处理+，抗猪CD8+，抗猪CD4+用于染色的抗体(BD生物科学，圣地亚哥，美国)。采用流式细胞仪检测结果。
监测猪感染PRRSV后的存活情况
健康状况
研究人员随机选择了五头猪，每天同时测量它们的直肠温度，体温计放置5分钟。直肠温度被用作评估PRRSV感染后疾病进展的指标。此外，PRRSV挑战后的健康状况使用日常生活活动(ADL)评估(Romero-Ayuso等人，2021)．以每餐采食量评估食欲;通过对刺激的反应来评估精神状态;观察头部皮肤颜色;通过咳嗽和喘气的声音来判断呼吸。在0-3的范围内，0代表严重症状，1代表中度症状，2代表轻微症状，3代表无明显症状。
组织病理学分析
挑战后14天，采集新鲜肺组织。组织切片固定，水洗，脱水，蜡包埋，切片加热，苏木精和伊红染色(H&E)，显微镜下病理检查(200×)。
猪组织病毒载量测定
每组随机选取3头猪。挑战后14天，从肺、下颌下淋巴结和腹股沟淋巴结获得组织标本，以量化病毒载量。RNA提取使用RNA提取试剂盒(上海生工生物技术有限公司)，按照制造商的说明进行。采用一步RT-qPCR (ABI 7500系统，ThermoFisher, MA, USA)对PRRSV ORF7基因进行扩增，建立了检测组织中PRRSV病毒载量的定量荧光检测方法(绝对定量)。引物参照PRRSV ORF7基因序列设计，引物对5 ' -ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3 '和5 ' -TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3 '(95°C 5min;95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s, 35圈;72°C 5分钟)。
数据分析
使用GraphPad Prism (Version 5.0)对数据进行分析，数据显示为平均值加上学生的S.D.t本研究采用检验进行统计学分析。一个P以<0.05为差异有统计学意义。
结果
血清中和抗体和GP3/GP5抗体的检测
每7天评估猪血清中的中和抗体滴度(图1 b)．21 dpi后，pVAX-GP35组和pVAX-GP35+A2组中和抗体滴度分别为1:15和1:16，高于阴性对照组(NC组)(P<0.05)。pVAX-GP35+A1组和pVAX-GP35+A3组中和抗体滴度在35 dpi时达到1:19的峰值，高于NC组(P<0.01)和pVAX-GP35组(P<0.01)。结果表明，pVAX-GP35+A1、pVAX-GP35+A2和pVAX-GP35+A3均促进猪体内中和抗体的产生。
发现重组DNA疫苗可诱导靶向PRRSV GP3和GP5蛋白的特异性抗体。发现GP3抗体水平在35 dpi后有所增加(图1 c)．7 dpi后，只有pVAX-GP35和商业灭活疫苗组对GP3产生抗体应答。pVAX-GP35+A3组的GP3抗体水平在21 dpi时显著升高。35dpi时，pVAX-GP35组IRPC为46.36,pVAX-GP35+A1组IRPC为48.93,pVAX-GP35+A3组IRPC为58.36 (P<0.05)。GP5抗体在7 dpi开始出现，数据显示在35 dpi内整体呈上升趋势(图1 d)．在28 dpi时，pVAX-GP35+A2组的GP5抗体水平波动。在35 dpi时，每组的IRPC都达到了最显著的点，所有辅助剂组都优于pVAX-GP35组。所有疫苗组的效果均略低于市售灭活疫苗(p> 0.05)。
血清细胞因子分析及t淋巴细胞分型
在21和35 dpi时，检测各组血清IL-4 (图2一个)．在35 dpi时，所有疫苗组的表现均优于NC组，pVAX-GP35+A2组与市售灭活疫苗组相当。pVAX-GP35+A3组IL-4最大浓度为136.77 pg/mL，是pVAX-GP35组的2.4倍(P<0.01)，是商业灭活疫苗组的2.13倍(P<0.01)。在21和35 dpi时，IFN-γ检测到(图2 b)．pVAX-GP35、pVAX-GP35+A1和pVAX-GP35+A3组在21 dpi时IFN-γ浓度均高于NC组(P<0.05)。在35 dpi时，pVAX-GP35+A1组的IFN-γ浓度为227.37 pg/mL，高于NC组(P<0.01)，是商业灭活疫苗组的2.17倍(P<0.05)。
图2检测各组血清细胞因子分泌水平及CD3+CD8+和CD3+CD4+ t细胞亚型。(一)IL-4的平均浓度(pg/ml)(B)干扰素-γ(C)2,(D)血清中的IL-10。(E)PBMC中CD3+CD4+ t淋巴细胞亚群的百分比。(F)PBMC中CD3+CD8+ t淋巴细胞亚群的百分比。数据以各组3项数据的均数±标准差表示。(* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001)。Ns，没有显著差异。
在21和35 dpi时检测血清IL-2 (图2 c)．在21 dpi (P<0.05)和35 dpi (P<0.01)时，pVAX-GP35+A3组均优于NC组。pVAX-GP35组(P<0.01)和pVAX-GP35+A1组(P<0.01)也优于pVAX-GP35组(P<0.01)。对于IL-10 (图2 d)，在35 dpi时，pVAX-GP35+A2组和pVAX-GP35+A3组均优于pVAX-GP35组(P<0.05)和NC组(P<0.05)。
的CD3+CD4+和CD3+CD8+在35 dpi时检测猪外周血淋巴细胞的T细胞亚群。图2 e描述了CD4的结果+T淋巴细胞亚群分析。pVAX-GP35+A1组CD4比例更高+T细胞(32.2%)高于NC组(P<0.01)，且略高于商业疫苗组(P>0.05)和pvx - gp35组(P>0.05)。pVAX-GP35+A3组血液分析显示，33.56%的T淋巴细胞为CD4+T细胞，高于NC组(P<0.01)。该组也优于市售灭活疫苗组(P>0.05)和pVAX-GP35组(P>0.05)。图2 f描述CD8的结果+T淋巴细胞亚群分析。pVAX-GP35+A3组的血液中CD8的含量更高+T淋巴细胞(30.27%)与NC组(P<0.001)和商业疫苗组(P<0.001)比较;这也高于pVAX-GP35组(P<0.01)。CD8的百分比+pVAX-GP35+A2组T淋巴细胞明显多于NC组(P<0.001)。
PRRSV攻毒后猪的健康状况、病毒载量和组织病理学
PRRSV感染猪后，每日测量猪直肠温度(图3一)．pVAX-GP35、pVAX-GP35+A1、pVAX-GP35+A2和pVAX-GP35+A3组的直肠温度均不超过40.0℃。商业疫苗组记录的直肠温度低于40.0°C，但高于pVAX-GP35+A1和pVAX-GP35+A3组记录的直肠温度。在挑战两天后，NC组的记录温度上升到40.0℃以上，并且在14天内从未低于40.5℃，在8 dpi时最高达到41.7℃。
图3重组候选疫苗攻毒后保护效果评价。(一)猪感染PRRSV后，每天监测猪的体温。所有免疫组均未超过40摄氏度。(B)猪组织中的病毒载量受到PRRSV的挑战。(碳氢键)PRRSV感染后肺病理切片。中度间质性肺炎观察到疫苗猪实变。阴性组猪出现间质性肺炎和严重的肺泡间隔增厚。(C)pVAX-GP35组的肺。(D)肺pVAX-GP35+A1组。(E)pVAX-GP35+A2组的肺。(F)肺pVAX-GP35+A3组。(G)商业疫苗组的肺。(H)NC组肺。所有图像放大200倍。(数据以3个数据的平均值±标准差表示。* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001)。对于折线图，彩色符号表示与商业疫苗相比的免疫组。
日常生活活动评估测量了PRRSV攻击后猪的健康状况(表1)．在PRRSV攻击后，NC组表现出很少或没有进食活动，喜欢聚集在一起爬行，并表现出咳嗽和皮肤潮红。pVAX-GP35+A3组猪进食正常，呼吸正常，有规律运动意愿。
表1采用PRRSV攻毒法对猪14 dpi后ADL进行评估。
我们在prrsv攻毒后14天采集各组猪的肺、下颌下淋巴结和腹股沟淋巴结，用qPCR方法评估病毒滴度。结果表明，与NC组相比，免疫组的主要器官病毒载量较低(图3 b)．与NC组相比，pVAX-GP35+A3组病毒载量最低(P<0.001)。与商业疫苗组相比，该组在肺和腹股沟淋巴结标本中也表现出较低的病毒载量。此外，与商业疫苗组相比，pVAX-GP35+A1组肺部病毒载量较低。因此，这些发现表明重组DNA疫苗可以降低接种猪在PRRSV攻击后的病毒载量。
病毒感染后14天，对肺病理切片进行评估(图3碳氢键)．攻毒后，pVAX-GP35+A3组猪肺功能正常，且优于pVAX-GP35组。反之，NC组肺间质增宽，肺泡壁增生，炎症细胞浸润明显。
讨论
PRRSV可引起流产和呼吸道疾病，并使猪更容易感染其他猪病毒。接种疫苗可为猪提供良好的预防PRRSV感染的保护;然而，MLV和灭活疫苗将无法实现预期的目标，因为它们存在一些局限性，包括无法授予灭菌免疫(Renukaradhya等人，2015)．DNA疫苗有可能刺激针对PRRSV挑战的体液和细胞免疫，可能为养猪业节省数百万美元(霍伯尼克和兄弟，2018年)．
质粒DNA在环境温度下相对稳定，在运输过程中无需冷链(夏尔马等，2020年)．用于DNA疫苗的质粒的生产消除了对感染性病原体蛋白纯化的需要，进一步提高了它们的安全性。此外，DNA疫苗在临床中具有出色的安全记录(Li和Petrovsky, 2016)．关于DNA疫苗最重要的问题之一是，转染的DNA可能整合到体细胞和生殖细胞的基因组中，从而导致基因表达和突变的不平衡(霍伯尼克和兄弟，2018年)．然而，Wang和同事计算出整合频率远低于自发基因改变的数量(Wang et al.， 2004)．另一项研究表明，注射到小鼠骨骼肌的质粒DNA大部分停留在注射部位，在其他器官(包括性腺)中检测到的比例很小，但没有纳入基因组(Manam等人，2000年)．在反复肌肉注射荧光素酶编码报告载体后，灵长类动物获得了长期的报告基因表达，但没有产生抗dna抗体(焦等，1992)．在最近的人体研究中，DNA疫苗是有效的(Kim et al.， 2014；范·迪彭等人，2019年；Tebas等人，2021年)，包括针对埃博拉病毒、H5N1型流感病毒、H1N1型流感病毒和寨卡病毒，并进行了I期或II期临床试验(Rauch等人，2018)．
与特定抗原结合选择的佐剂的免疫刺激特性决定了DNA疫苗的效率(Leroux-Roels 2010)．基于其激活先天性免疫反应的能力，定义为专业APC和b细胞的激活，CpG ODN被认为是一种合适的疫苗佐剂(克里格等人，1995年；Klinman等人，1996年)．在非人类灵长类动物中使用CpG ODN的试验中，没有记录到有害的健康影响(Klinman等人，1997年；Verthelyi等人，2002年)．在本研究中，评价了两种佐剂。A1佐剂为皂苷提取物。皂苷由一个具有三萜结构的疏水核心和一个附着在碳水化合物链上的张力活性糖苷(Reichert等人，2019年)．皂苷可影响动物的免疫系统及神经系统活动(Reichert等人，2019年)．A2佐剂是一种连续水乳状油包水佐剂。双相乳剂既可提供亲脂性化合物，又可轻易释放水溶性化合物(Sawant等人，2021)．重要的是，它们可以触发即时和长期的免疫反应。复合乳液通过油膜包裹一些溶解在水中的活性成分，缓慢而稳定地释放到外部水相(Benichou等，2004)．本研究评估的A3佐剂是佐剂A1和A2的组合。
本研究选择PRRSV GP3和GP5作为抗原。在蛋白序列前引入Kozak序列以增加靶蛋白表达，在蛋白序列下游引入CpG序列以提高免疫效果。pVAX-GP35+A3激活的中和抗体水平最高在活的有机体内，滴度为1:19。pVAX-GP35+A1、pVAX-GP35+A2和pVAX-GP35+A3的中和抗体效价在35dpi时比pIR-VR2385-CA-dORF2 (Pujhari et al.， 2013)．同样，本研究中的疫苗也高于DNA疫苗pEGFP-IL18-GP5和pEGFP-GP5 (Zhang等，2013)．同样，本研究中的疫苗显示出比DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5、pcDNA3.1-PoIFN-1-SynORF5和BPEI/PLGA-SynORF5更好的中和抗体滴度，其中和抗体滴度分别为1:8、1:12和1:14 (Du等，2017)．本研究中，市售灭活疫苗组的中和抗体高于pVAX-GP35+A3组，但病毒载量和病理切片结果显示保护作用有限，对PRRSV攻击的保护作用弱于pVAX-GP35+A3组。这些结果表明，抗PRRSV攻击的体液免疫不仅依赖抗体，而且细胞免疫也是提供保护的关键。
pVAX-GP35+A3有可能通过增加CD4来增强接种猪的细胞免疫反应+和CD8+t细胞数量。结果显示，GP3和GP5不仅可以增强体液免疫，还可以增强对PRRSV的细胞免疫。采用PRRSV病毒载量测定法在35 dpi时进行攻毒保护实验，以确定各组的免疫效果。pVAX-GP35+A3组肺组织的病毒载量低于接种DNA疫苗pcDNA3.1-SynORF5、pcDNA3.1-PoIFN-1-SynORF5和BPEI/PLGA-SynORF5 (Calvet等人，2014)．鉴于这些结果，pVAX-GP35+A3可能对猪提供更有效的保护。虽然在实验结束时，猪的组织中仍能检测到病毒，但pvx - gp35 +A3组猪的肺部、下颌下淋巴结和腹股沟淋巴结中的病毒载量明显低于NC组的相同组织。证据表明pVAX-GP35+A3可以成功地抑制病毒在猪体内的复制。
然而，PRRSV可在DNA疫苗免疫的猪中检出，DNA疫苗的有效性有待进一步提高。还应修改给药方式以增强免疫反应。不同的疫苗传递方法，包括可溶性微针贴片、表面电穿孔和针皮内接种，都是有效的猪DNA传递方法(伯林-科特等人，2019年)．部分非烧蚀激光治疗也可改善DNA免疫原性(王等，2015)．施药器有涂层微针阵列，是弹簧负载(费尔南多等人，2018年)，并能微创组织穿透和局部滞留。这可以导致DNA疫苗的持续输送，也延长了疫苗的保护时间。DNA疫苗在抗原选择、佐剂匹配和传递机制等方面仍有待改进。
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。
道德声明
该动物研究由IACUC (AMMS- 11 - 2021 - 012)审查并批准。
作者的贡献
GZ, HL和NJ构思了这项研究。GZ、WS和CX为数据收集、分析做出了贡献。SW贡献了解释。JZ, HZ, YG, XC和FN帮助数据可视化。GZ, YiZ和YaZ完成了稿件的起草。JZ、XZ对稿件进行了修改。旧金山大学监督了这项研究。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
资金
本文由国家重点研究计划项目[2018YFD0500104]、[2018YFD0500803]、国家高技术研究发展计划项目[2011AA10A208]、[caas - astp -2017- isaps]资助。
利益冲突
作者声明，在研究过程中没有可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
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关键词:PRRSV, GP3, GP5，免疫应答，DNA疫苗，猪
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收到:2022年8月11日;接受:2022年9月5日;
发表:2022年10月6日。
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