近距离接触感染叙利亚仓鼠模型中SARS-CoV-2传播和嗅觉细胞谱系损伤的证据
鲁米Ueha
1、2 *，
Toshihiro Ito
3.，
Satoshi Ueha
4，
Ryutaro古3.，
Masahiro Kitabatake
3.，Noriko Ouji-Sageshima3.，
Tsukasa Uranaka
2，
Hirotaka田中
2、5，
Hironobu缝合
2，
吴克群近藤
2而且
达Yamasoba
2
- 1东京大学附属医院吞咽中心，日本东京
- 2东京大学医学系耳鼻喉与头颈外科，日本东京
- 3.日本奈良奈良医科大学免疫学系
- 4日本千叶东京理科大学生物医学研究所炎症和免疫疾病分子调控部
- 5日本东京，产经大学医学院耳鼻咽喉科
目的:据推测，与COVID-19患者密切接触是病毒传播的最常见原因，但密切接触感染COVID-19的发病机制尚不清楚。此外，尽管嗅觉障碍是COVID-19的一种独特并发症，但SARS-CoV-2对嗅觉细胞系的影响尚未得到充分验证。本研究旨在阐明SARS-CoV-2对鼻子和肺部的密切接触病毒传播，并研究SARS-CoV-2对嗅觉受体神经元(ORN)谱系的暂时性损伤。
方法:将叙利亚仓鼠口服SARS-CoV-2非变异nCoV-19/JPN/TY/WK521/2020作为直接感染模型。接种后第3天，将感染鼠和未感染鼠置于同一笼中饲养30分钟。这些未受感染的仓鼠随后被分配到密切接触组。首先，在感染组和密切接触组中，在几个时间点验证了病毒在鼻子和肺部的存在。接下来，组织学上检查了对嗅觉上皮的影响，包括嗅觉祖细胞、未成熟的orn和成熟的orn。然后比较直接感染组和密切接触组之间的病毒传播状态和组织损伤的时间变化。
结果:在密切接触组中，第3天在鼻子和肺部都检测不到病毒，第7天在两个组织中都检测到病毒。在直接感染组，病毒载量在第3天在鼻子和肺部最高，在第7天下降，在第14天不再检测到。组织学上，在直接感染组，成熟orn在第3天消耗最多(p <0.001)，并在第14天出现恢复趋势，嗅觉祖细胞和未成熟orn也有类似的趋势。密切接触组在第3天无明显组织损伤，但在第7天，所有ORN谱系细胞数量显著减少(p <0.001)。
结论:SARS-CoV-2即使在短暂接触后也会传播，并且在感染触发后3天以上发生嗅觉上皮和肺损伤。目前的研究还表明，SARS-CoV-2会损害所有的ORN谱系细胞，但这种损害可以在感染后大约14天开始恢复。
简介
由严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒病(COVID-19)自2019年12月底以来已被宣布为大流行(关等，2020年；Castagnoli等人，2020年)尚待控制的;相反，全世界的感染人口正在增加。据报道，从接触SARS-CoV-2到出现COVID-19症状的潜伏期约为6天，在COVID-19患者出现症状前几天，飞沫中的病毒载量会增加(贝克等人，2020年；他等人，2020年；劳尔等人，2020年)．因此，如果病毒携带者在无症状期没有采取适当的感染控制措施，他们可能在COVID-19的无意传播中发挥重要作用(Oran和Topol, 2020年；尼古拉等人，2020年)．最可能的无症状感染者被认为是密切接触者，定义为与感染者在1米距离内接触超过15分钟且未正确佩戴口罩的人，这些人被认为是接触SARS-CoV-2并发生感染的高危人群(WH, 2022年；CDC, 2022年)．然而，在与感染者短暂密切接触后，病毒如何在体内传播和繁殖尚未得到充分研究。
鼻腔是SARS-CoV-2复制的重要组织，SARS-CoV-2可引起化学感觉功能障碍和影响嗅觉(Biadsee等人，2020年；Butowt和von Bartheld, 2021年)．在COVID-19大流行的早期，嗅觉功能障碍往往是COVID-19的首要表现(Saniasiaya等人，2021)．自omicron变体流行以来，与COVID-19相关的嗅觉功能障碍的患病率和严重程度有所下降，但作为COVID-19的后遗症，它仍然是一个重要问题(Boscolo-Rizzo等人，2022)．尽管鼻子是一个重要的感觉器官，但短期接触引起的感染是否会导致鼻上皮细胞的损伤尚未完全阐明。在之前使用动物模型的研究中，给动物注射了高剂量的SARS-CoV-2，在病毒暴露后几天内发现了严重的鼻上皮损伤(金登等人，2020年；Bryche等人，2020年；Urata等人，2021年；Seo等人，2021；Kishimoto-Urata等人，2022)．然而，由于在现实环境中不太可能一次性吸入大剂量的病毒，这些SARS-CoV-2感染模型中鼻子嗅上皮(OE)的损伤可能与实际情况不符。因此，验证与日常生活中感染情况相似的近距离接触感染模型势在必行。此外，SARS-CoV-2可经鼻和口腔传播，需要评估经鼻和口腔注射病毒后的纵向组织损伤。
OE由支持细胞(支撑细胞)、基底祖细胞、未成熟嗅觉受体细胞(orn)和成熟嗅觉受体细胞(Ueha等人，2016)．基底细胞和支持细胞特别容易受到SARS-CoV-2感染的损害，整个OE可能会被剥蚀，这取决于部位(Butowt和von Bartheld, 2021年；Urata等人，2021年；Seo等人，2021；Ueha等人，2022)．这种OE损伤随着时间的推移而改善，并且在SARS-CoV-2感染后约1个月内OE几乎恢复正常，尽管再生动力学可能因鼻子区域(如鼻中隔和侧鼻甲)而异。Urata等人，2021年)．虽然有报道称，随着时间的推移，OE上皮厚度发生了时间组织学变化，但SARS-CoV-2对组成OE的各种细胞群的影响尚未得到证实。由于对损伤的敏感性和再生进展取决于鼻子的位置(图尔迪等人，2018；Ueha等人，2020年)，以特定地点的方式研究SARS-CoV-2对OE，特别是对ORN谱系的影响将具有重要意义。此外，研究SARS-CoV-2感染在短期密切接触传播后对不同细胞类型的影响也值得关注。
在这项研究中，为了阐明与SARS-CoV-2感染者短期密切接触的生物学效应，我们创建了短期接触模型，并检测了鼻子和肺部随时间的组织学和分子生物学变化。接下来，我们以SARS-CoV-2感染仓鼠的鼻腔部位特异性方式检测了OE的时间变化。最后，我们比较了病毒在直接感染和密切接触模型组织中传播的时间过程。
材料与方法
动物
我们选取了叙利亚仓鼠(Mesocricetus auratus)作为本研究的动物模型，因为叙利亚金仓鼠已被用于各种与SARS-CoV-2相关的研究中，被认为是一种优秀的SARS-CoV-2感染小动物模型(Imai等人，2020年；Lee和Lowen, 2021年)和传播(Furukawa等人，2021)．6周大的雄性叙利亚仓鼠购自日本SLC(滨松，静冈县，日本)，并在奈良医科大学动物研究中心的特定无病原体环境中饲养。动物实验方案遵循arrival指南，并由奈良医科大学动物护理和使用委员会批准(批准号12922)。所有程序均遵守《实验动物护理和使用指南》、奈良医科大学和动物研究以及东京大学动物护理和使用委员会的相关指导方针。
动物模型制备
SARS-CoV-2感染动物模型按照先前报道的方法接种(Furukawa等人，2021；Ueha等人，2022)．简而言之，使用了SARS-CoV-2菌株(非变异nCoV-19/JPN/TY/WK521/2020，由日本国立传染病研究所提供)。使用VeroE6/TMPRSS2细胞(日本JCRB细胞库，JCRB1819)进行病毒培养，随后制备病毒提取物。使用先前报道的空斑测定方法(PMID34880383)对病毒液进行滴定，以确定VeroE6/TMPRSS2细胞中的pfu。将24只仓鼠分为3组:阴性对照组4只，经口感染组(感染组)12只，短期密切接触组(接触组)8只。所有使用SARS-CoV-2的实验均在日本奈良医科大学生物安全3级实验设施进行。时间过程如图所示图1一个．
图1实验时间轴和鼻结构。(一)仓鼠口服严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2) (1.0×103.空斑形成单位)。为制备短期密切接触模型，将未感染的仓鼠与感染SARS-CoV-2的仓鼠共关30分钟(接种后3天)，然后分离。(B)对照仓鼠嗅觉上皮的代表性图像。方框表示鼻中隔背侧(NS)和鼻甲外侧(LT)区域。
注射病毒前腹腔注射戊巴比妥(10 mg/mL, 0.8 mL/只)麻醉。SARS-CoV-2经口感染组，用生理盐水(含1.0×10)稀释病毒液50 μL3.如先前报道的那样，口服SARS-CoV-2的pfu (Furukawa等人，2021；Ueha等人，2022)．对照组给予50 μL生理盐水。分别于接种后第3、7、14天，腹腔注射戊巴比妥钠1.0 ml (10 mg/ ml)，心脏放血处死。
为制备短期密切接触模型，在给药第3天将未感染的仓鼠转移到感染仓鼠的笼子中并同笼。同居30分钟后，将短期密切接触的仓鼠与直接感染的仓鼠分开。接触后3天和7天，对密切接触组的仓鼠实施安乐死。取鼻样本进行组织病理学检查，取肺样本进行组织病理学检查(左叶)和定量聚合酶链式反应(qPCR，右叶)。
RNA提取和RT-qPCR
我们验证了每只仓鼠肺部的SARS-CoV-2病毒RNA，以确认其SARS-CoV-2感染状态。用NucleoSpin从肺中分离总RNA®RNA (machery - nagel, Düren，德国)，然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，按照之前的协议(Furukawa等人，2021；Ueha等人，2022)及制造商说明。RT-qPCR分析采用StepOnePlus实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)。使用的基因特异性引物和探针为:Gapdh作为内源对照(TaqMan assay Cg04424038)和SARS-CoV-2核衣壳基因(正向:5 ' - AAATTTTGGGGACCAGGAAC -3 '，反向:5 ' - TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC -3 '， TaqMan探针:FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-BHQ)。将各基因的表达量归一化至Gapdh每个样本的表达式。
组织准备
组织采集后，立即对肺和鼻组织进行组织学分析，轻轻冲洗并在4%多聚甲醛中固定14天，然后对鼻样本进行脱钙。然后，每个样品在分级乙醇溶液中脱水，并包埋在石蜡中。对于鼻组织，我们从嗅球前端的所有样本中获得冠状切片，用于嗅黏膜的组织学分析(Ueha等人，2016；Ueha等人，2016；Ueha等人，2018；Ueha等人，2018)．4微米厚的石蜡切片在二甲苯中脱蜡，在乙醇中再水化后染色。肺组织采用肺左叶进行组织学评估，制备2微米厚的石蜡切片。
组织学分析
采用苏木精和伊红染色评价组织整体结构。免疫染色时，抗原提取后，脱蜡切片用3%过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶活性，然后在Blocking One溶液(Nacalai Tesque，京都，日本)中孵育以阻断非特异性免疫球蛋白结合。然后，用一抗和二抗孵育样本。
本研究中使用的一抗列于表1．采用抗SARS-CoV-2核衣壳抗体鉴定新型冠状病毒。使用以下抗体评估ORN神经发生:性别决定区Y-box 2 (SOX2)，由OE基底层增殖的干细胞或祖细胞表达;生长相关蛋白43 (GAP43)，由OE中未成熟的orn表达;嗅觉标记蛋白(OMP)，由OE中成熟orn表达。
表1本研究中使用的是一抗。
气味受体根据其区域表达模式分为四组，气味受体由分布在四个限定区域之一的感觉神经元表达(吉原等人，1997；Mori等人，2000年；Imamura和Hasegawa-Ishii, 2016)．其中，1区由NQO1表达共定位决定，2-4区由OCAM表达决定(吉原等人，1997；Mori等人，2000年；Gussing和Bohm, 2004；Imamura和Hasegawa-Ishii, 2016)．我们之前的研究表明，鼻中隔背侧区OE代表OCAM-/ NQO1+表达式(区域1)和外侧区域的表达式表示OCAM+/ NQO1-表情(区域2-4)。因此，为了分析OE，我们将OE的冠状切面沿带状组织分为两个区域:背侧鼻中隔(NS)区和外侧鼻甲(LT)区(图1 b)．
使用数码显微镜相机(Keyence BZ-X700，大阪，日本)，10×和40×物镜拍摄图像。经济新闻+菜,SOX2+ORN祖细胞和GAP43+在每个样品的左右两侧分别计数300 μm区域内的未成熟orn。每种抗原免疫染色切片和苏木精反染色切片定量分析每种细胞类型的数量。
统计分析
使用GraphPad Prism软件(6.7版;GraphPad软件公司，美国加州圣地亚哥www.graphpad.com)．qPCR数据在分析前进行对数变换。结果与p< 0.05为差异有统计学意义。
结果
鼻腔和肺部口服病毒接种后SARS-CoV-2感染的时间过程类似，有在感染后7天消退的趋势
为确认SARS-CoV-2感染的建立，我们在口服接种SARS-CoV-2感染仓鼠后第3天，用免疫组织化学和RT-qPCR初步评估病毒在鼻和肺中的存在情况。病毒通过免疫组化和RT-qPCR在肺中鉴定，仅通过免疫组化在鼻中鉴定。病毒在鼻腔的各个部位均有发现，但在鼻黏膜分布不均匀。在感染后第7天，病毒在鼻子和肺部的存在都减少了，根据qPCR分析，肺部的病毒载量减少到第3天病毒载量的1/1000以下。在鼻腔中，病毒在鼻中隔附近的区域很少观察到，但在外部区域仍然存在病毒。在感染的第14天，组织学上在鼻子或肺部均未发现病毒(图2A、B)， qPCR检测不到病毒基因(图2 c)．
图2鼻腔和肺部的暂时性SARS-CoV-2感染情况。(一)严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)在对照(CT)仓鼠和SARS-CoV-2仓鼠第3、7、14天免疫组织学染色的代表性图像。SARS-CoV-2以棕色显示。(B)肺内SARS-CoV-2免疫组化染色。(C)采用RT-定量聚合酶链反应检测CT仓鼠和SARS-CoV-2仓鼠在第3、7、14天的SARS-CoV-2基因。SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
综上所述，在病毒直接接种模型中，大约在第3天感染情况较严重，给药后第7天病毒载量下降;到第14天，病毒几乎完全从鼻子和肺部清除(图2)．
在短期密切接触后的最初几天没有出现新冠病毒感染症状，但在接触后一段时间后出现明显症状
接下来，我们研究了SARS-CoV-2是否可以通过与受感染的动物短暂接触而感染鼻子和肺部。短期接触后的第3天，在鼻子或肺部没有发现SARS-CoV-2，但在密切接触后的第7天，所有仓鼠的鼻子和肺部都广泛发现了病毒。在鼻腔中，病毒在LT区比在NS区更明显。至于肺部，在第7天，密切接触组的病毒载量高于直接感染组，与直接感染组的第3天水平几乎相似(图3)．与直接感染组相比，病毒在组织中被识别的时间明显延迟。
图3与感染SARS-CoV-2的动物短期密切接触后，鼻和肺部出现代表性的SARS-CoV-2感染。(A, B)鼻内SARS-CoV-2染色的代表性图像(一)和肺(B)在与SARS-CoV-2感染动物短期密切接触后(共第3天，共第7天)的第3天和第7天，统计每个样本左右两侧300 μm区域内每种类型细胞的数量(每组n = 4)。(C)RT-定量聚合酶链反应检测CT仓鼠和接触仓鼠第3、7天SARS-CoV-2基因。SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
经口SARS-CoV-2感染会在不同的分化阶段影响orn
随后，我们在直接感染模型中研究了SARS-CoV-2感染对ORN谱系的时间影响。我们发现NS区和LT区的组织损伤存在差异;在NS区，在感染第3天，基底层以上的浅表细胞几乎全部缺失，尤其是严重受损的区域，但OE的细胞结构在感染第14天趋于恢复正常水平，提示OE再生。相反，在LT区，在病毒注射后的第3至14天内，OE没有从基底层分离(图4一)．图4说明了OE受影响最严重地区的代表性调查结果。
图4SARS-CoV-2感染对嗅觉受体神经元谱系的影响。(一)对照(CT)仓鼠和SARS-CoV-2仓鼠嗅觉上皮的代表性苏木精和伊红染色(HE)图像，分别在第3、7和14天。(罪犯): CT和SARS-CoV-2仓鼠免疫组织学染色的代表性图像。放大图显示鼻中隔(NS)区和侧鼻甲(LT)区。性别决定区Y-box 2 (SOX2)+祖细胞(B)生长相关蛋白4 (GAP43)+未成熟嗅觉受体神经元(orn)(C)，以及嗅觉标记蛋白(OMP)+菜用(D)用棕色表示。基底层以箭头表示。组织切片用核染料苏木精(蓝色)反染色。SOX2数量+每300 μm基底层有ORN祖细胞，GAP43+不成熟的orn和OMP+在CT和SARS-CoV-2仓鼠中，每300 μm嗅上皮中成熟的orn计数。**P< 0.01;＊＊＊P< 0.001;＊＊＊＊P< 0.0001。SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
此外，我们还根据OE区域检查了SARS-CoV-2对所有ORN谱系细胞的影响。SOX2+嗅祖细胞在第3天和第7天几乎没有在NS区发现，但在第14天恢复到与对照组相同的水平。相比之下，在LT区域，SOX2的数量+细胞在第3天和第7天减少，但在第14天与对照组相比，细胞数量增加了(图4 b)．GAP43+在第3天和第7天，NS和LT区域几乎看不到未成熟的orn，而与对照组相比，这些细胞的数量在第14天有所增加(图4 c)．经济新闻+在第3天和第7天，NS区很少能观察到orn，但在第14天，细胞计数有明显的恢复趋势，但未达到对照组的水平。在LT区，OMR+在第3、7和14天，OE中存在一定程度的orn，但数量低于对照组(图4 d)．因此，在NS和LT地区，ORN谱系受到SARS-CoV-2感染的不同影响。
与SARS-CoV-2感染模型的短期密切接触会导致所有ORN谱系细胞的晚期损伤
最后，我们研究了与受感染动物短期密切接触后晚发性SARS-CoV-2感染如何随着时间的推移影响OE。虽然在短期密切接触后的第3天未观察到OE的结构变化，但在第7天观察到NS区域的OE明显中断(图5一个)．免疫组织学检查显示，在接触后第3天，OE的所有ORN谱系细胞数量与对照组相比无明显差异，这支持了组织中未发现病毒的观察。相反，在OE第7天接触后，既不SOX2+嗅觉祖细胞和GAP43+NS和LT区有未成熟的orn，只有少量的OMP+LT地区的成熟orn (图5罪犯)．因此，短期的密切接触显然会损害ORN谱系，而且与直接给药相比，这种损害的时间延迟了。
图5SARS-CoV-2对短期密切接触后嗅觉受体神经元谱系的影响(一)代表苏木精和伊红染色(他)对照(CT)仓鼠和接触仓鼠在第3天和第7天(共第3天，共7天)的嗅觉上皮图像。(罪犯):免疫组织学染色代表性图像。放大视图显示鼻中隔(NS)区和侧鼻甲(LT)区。性别决定区Y-box 2 (SOX2)+祖细胞(B)生长相关蛋白4 (GAP43)+未成熟嗅觉受体神经元(orn)(C)，以及嗅觉标记蛋白(OMP)+菜用(D)用棕色表示。基底层以箭头表示。组织切片用核染料苏木精(蓝色)反染色。SOX2数量+每300 μm基底层的ORN祖细胞和GAP43+不成熟的orn和OMP+用CT或接触仓鼠计数各区域嗅上皮每300 μm成熟的orn。＊＊＊＊P< 0.0001。SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2。
讨论
本研究表明，与感染的仓鼠短期密切接触，在第3天不会造成鼻腔或肺部损伤，但在第7天内会导致鼻腔和肺部广泛感染。相比之下，直接注射SARS-CoV-2会在3天内检测到病毒，导致鼻子和肺部组织损伤。此后，组织中的病毒载量随着时间的推移而下降，感染后14天，在鼻子或肺部没有发现病毒。我们还证明，SARS-CoV-2广泛损害了OE，并且随着时间的推移，OE损害的程度因OE部位而异。在所有谱系细胞中，orn相关细胞的数量随着时间的推移而减少，然后趋于恢复(图6)．
图6肺部SARS-CoV-2病毒载量和不同鼻区嗅觉受体神经元相关细胞数量的时间变化假设。图中显示各时间点嗅觉受体神经元谱系细胞数与对照组细胞数之比随时间的变化。虚线表示推测的未来趋势。此外，SARS-CoV-2在肺部的估计病毒载量被覆盖在每个图表上。NS，鼻中隔;LT，侧鼻甲;经济新闻,经济新闻+成熟的嗅觉受体神经元;GAP43, GAP43+未成熟的嗅觉受体神经元;SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2;SOX2, SOX2+嗅觉祖细胞。
临床上，COVID-19症状出现所需的潜伏期约为6天(贝克等人，2020年；Cheng等人，2021)，而SARS-CoV-2 RNA在上呼吸道的脱落持续约17天(Fontana等人，2021年；Cevik等人，2021)．使用SARS-CoV-2感染模型的动物研究报告称，病毒载量在给药后2-5天最高(Lee等人，2020年；Urata等人，2021年；Reyna等人，2022年)以及病毒在给药后8-10天从组织中清除(Urata等人，2021年；Reyna等人，2022年）;本研究中直接感染模型的病毒载量也有类似的趋势。在本研究中，接触模型仓鼠的SARS-CoV-2病毒载量在1周后增加，尽管接触时间很短，只有30分钟。因此，当与SARS-CoV-2感染者接触时，即使只是短时间(约30分钟)，也有病毒传播的风险。对于短期接触组和直接感染组暴露的病毒载量，我们推测直接感染组暴露的病毒载量更高，导致两组感染的时间进程不同。尽管在密切接触后的第3天无法在鼻子或肺部识别出病毒，但在接触后的第7天观察到这两个组织的严重损伤，这表明与受感染动物接触后的第4至第6天是病毒繁殖的时间，同时病毒仍处于潜伏状态。虽然目前的验证只能检测近距离接触后7天的时间，但在第7天，近距离接触组动物肺部的病毒载量高于直接感染组动物，这意味着可能还需要一周或更长时间才能使病毒载量降低到无法检测到的水平。密切接触后病毒载量和组织损伤的时间变化仍是未来研究的主题。
对于短期近距离接触模型的传播形式，由于没有覆盖仓鼠的口鼻，可以考虑多种感染途径，包括接触、飞沫和空气传播。因此，如果新冠病毒感染者在不戴口罩的情况下与他人交谈或吃饭30分钟，就有可能将病毒传染给他人。感染SARS-CoV-2且无症状的人的百分比估计在1.2至12.9%之间(萨德克和纳斯鲁拉，2020年；Jabs等人，2022年)．COVID-19流行至今已有2年多时间，感染的传播尚未得到很好的控制。如果无症状感染者不采取适当的感染控制措施，可能会在不知不觉中传播新冠病毒。
由SARS-CoV-2引起的嗅觉功能障碍非常常见，现在已经很清楚病毒如何传播到各种与嗅觉相关的组织，如嗅觉粘膜、嗅球和嗅觉皮层(焦等，2021；Vidal等人，2022；Yu等人，2022)．关于SARS-CoV-2对OE的影响，据报道，OE的上皮损伤程度和恢复率因鼻腔中的位置而异(Urata等人，2021年)．然而，SARS-CoV-2对每个ORN谱系细胞的影响尚未得到充分验证。我们之前报道过，所有的ORN谱系细胞都受到SARS-CoV-2的损害(Ueha等人，2022)，在本研究中，我们首次验证了相关的纵向效应。
在NS区，SARS-CoV-2感染导致OE几乎所有细胞脱落，OE宽度减小。OE支持细胞表达高水平的ACE2 (Brann等人，2020年；Seo等人，2021；Ueha等人，2021年)，这些人可能容易被SARS-CoV-2感染。支持细胞的SARS-CoV-2感染可能干扰了它们的结构支持，导致广泛的上皮脱落。ACE2也在基础嗅觉祖细胞中表达(Brann等人，2020年；Butowt和von Bartheld, 2021年)，感染后第3天sox2阳性细胞数量较低，提示SARS-CoV-2感染可能直接损害了嗅觉祖细胞。此外，作为SARS-CoV-2的另一种受体，neuropilin-1几乎在OE的所有细胞中都有表达(Cantuti-Castelvetri等人，2020年；Ziuzia-Januszewska和Januszewski, 2022年)，那么所有的ORN谱系细胞都可能受到SARS-CoV-2的影响就不足为奇了。此后，到第14天，嗅觉祖细胞和未成熟的外耳道细胞已经发育，上皮再生开始活跃，但成熟的外耳道细胞尚未充分再生，这表明从SARS-CoV-2感染诱导的外耳道损伤中全面恢复可能需要超过14天(图6)．事实上,Urata等人(2021)而且Reyna等人(2022)报道在NS中，OE厚度恢复正常需要21天以上。基于这一验证和以往报告的结果，我们关于SARS-CoV-2对ORN谱系的时间影响的假设提出在图6．
在LT区域，omp阳性细胞的数量并没有随时间发生显著变化，这可能是因为一些orn被病毒破坏了，而未受损的orn仍然存在于OE中。因此，可以想象，该区域细胞的SARS-CoV-2受体表达可能因嗅觉上皮部位而异。此外，考虑到GAP43的增加+第14天LT区未成熟的orn，受损的OMP数量+预计成熟orn在第14天或之后会增加。如图6由于LT区ORN祖细胞和未成熟ORN的数值峰值出现的时间比NS区晚，因此LT区成熟omp的恢复时间可能比NS区要长。短期密切接触后的长期感染过程有待进一步观察。
综上所述，本研究表明，SARS-CoV-2即使在短暂接触后也可以传播，随后的OE损伤发生在感染触发后3天以上。此外，SARS-CoV-2可能会损害嗅觉受体系统，但这种损害可以在感染后大约14天开始恢复。对于新冠病毒感染控制，有必要在全球范围内讨论应实施的感染控制措施，并制定全球通用的规则。
数据可用性声明
支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。
道德声明
动物实验方案遵循arrival指南，并由奈良医科大学动物护理和使用委员会批准(批准号12922)。所有程序均遵守《实验动物护理和使用指南》、奈良医科大学和动物研究以及东京大学动物护理和使用委员会的相关指导方针。
作者的贡献
RU提出了概念，设计并进行了实验，分析了数据，制作了数字，并写了手稿的初稿。TI提出了这个概念，准备了动物模型，进行了一些实验，并分析了数据。SU提出了概念，设计了实验，并修改了手稿。RF、MK和NO-S制备动物模型，进行部分实验，并分析数据。TU、HT和HN进行了一些实验并分析了数据。KK和TY提出了这个概念，并对手稿进行了批判性的修改。所有作者都对数据的解释和手稿的写作做出了贡献。
资金
这项工作得到了JSPS KAKENHI科学研究资助基金(C)[资助号19K09841]和MSD生命科学基金会的支持。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
参考文献
萨德克，d.w.，纳斯鲁拉，G. K.(2020)。新型冠状病毒SARS-CoV-2在无症状患者中的发病率:一项系统综述Int。j .感染。说。98年,372 - 380。doi: 10.1016 / j.ijid.2020.06.098
预防COVID-19,附录．可以在:https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/php/contact-tracing/contact-tracing-plan/appendix.html．
贝克，J. A.，克林肯伯格，D.，瓦林加，J.(2020)。2020年1月20日至28日来自中国武汉的旅行者2019年新型冠状病毒(2019- ncov)感染的潜伏期。欧元监控看涨。欧洲传染性疾病=欧元。这是胡说八道。25 (5). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.5.2000062
Biadsee, A.， Biadsee, A.， Kassem, F.， Dagan, O.， Masarwa, S.， Ormianer, Z.(2020)。COVID-19的嗅觉和口腔表现:性相关症状-早期诊断的潜在途径。耳鼻喉头颈外科。163(4)， 722-728。doi: 10.1177 / 0194599820934380
Boscolo-Rizzo, P.， Tirelli, G.， Meloni, P.， Hopkins, C.， Madeddu, G.， De Vito, A.等(2022)2019冠状病毒病(COVID-19)相关的嗅觉和味觉障碍，严重急性呼吸综合征-冠状病毒2 (SARS-CoV-2)欧米克隆变体广泛扩散。Int。论坛过敏犀牛。12(10), 1273 - 1281。doi: 10.1002 / alr.22995
Brann, D. H.， Tsukahara, T.， Weinreb, C.， Lipovsek, M.， Van den Berge, K.， Gong, B.等人(2020)。嗅觉系统中SARS-CoV-2进入基因的非神经元表达提示了covid -19相关嗅觉缺失的潜在机制。科学。睡觉。6(31)。doi: 10.1126 / sciadv.abc5801
布莱切，B.，圣阿尔宾，A.， Murri, S.， Lacote, S.，普利多，C.， Ar Gouilh, M.等人(2020)。在金色叙利亚仓鼠中，与SARS-CoV-2支撑细胞感染相关的嗅觉上皮的大规模短暂损伤。大脑行为Immun。89年,579 - 586。doi: 10.1016 / j.bbi.2020.06.032
布托，R.，冯·巴特尔德，C. S.(2021)。COVID-19中的嗅觉缺失:大脑感染的嗅觉途径的潜在机制和评估。>。j牧师带来了神经生物学。神经。精神病学27(6)， 582-603。doi: 10.1177 / 1073858420956905
Cantuti-Castelvetri, L.， Ojha, R.， Pedro, L. D.， Djannatian, M.， Franz, J.， Kuivanen, S.等人(2020)。神经蛋白酶1促进SARS-CoV-2细胞进入和感染。科学370(6518)， 856-860。doi: 10.1126 / science.abd2985
Castagnoli, R.， Votto, M.， Licari, A.， Brambilla, I.， Bruno, R.， Perlini, S.等人(2020)。儿童和青少年严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)感染:一项系统综述JAMA Pediatr。174(9)， 882-889。doi: 10.1001 / jamapediatrics.2020.1467
Cevik, M.， Tate, M.， Lloyd, O.， Maraolo, A. E.， Schafers, J.， Ho, A.(2021)。SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV病毒载量动态、病毒脱落持续时间和传染性:系统综述和荟萃分析柳叶刀的微生物2 (1)， e13-e22。doi: 10.1016 / s2666 - 5247 (20) 30172 - 5
程超，张丹，党丹，耿杰，朱鹏，袁敏，等(2021)。COVID-19的潜伏期:一项涉及53项研究的全球荟萃分析和一项涉及11545例患者的中国观察研究感染。Dis.贫困10(1)， 119。doi: 10.1186 / s40249 - 021 - 00901 - 9
丰塔纳，L. M.， Villamagna, A. H.， Sikka, M. K.， McGregor, J. C.(2021)。了解严重急性呼吸道冠状病毒2型(SARS-CoV-2)的病毒脱落:目前文献综述感染控制，医院流行病学。42(6)， 659-668。doi: 10.1017 / ice.2020.1273
Furukawa, R.， Kitabatake, M.， Ouji-Sageshima, N.， Suzuki, Y.， Nakano, A.， Matsumura, Y.等人(2021)。柿子鞣质具有抗病毒作用，并在叙利亚仓鼠模型中降低SARS-CoV-2感染和传播的严重程度。科学。代表。11(1)， 23695。doi: 10.1038 / s41598 - 021 - 03149 - 3
戈尔登，J. W.，克莱恩，C. R.，曾，X.，加里森，A. R.，凯里，B. D.，马克尔，E. M.等(2020)。感染SARS-CoV-2的人血管紧张素转换酶2转基因小鼠会患上严重和致命的呼吸道疾病。江森自控的洞察力5(19)。doi: 10.1172 / jci.insight.142032
关,w·J。倪z, Y。,,Y。,梁,w·H。或者,c . Q。他,J . X。et al。(2020)。2019年中国冠状病毒病临床特征新英格兰。j .地中海。382(18)， 1708-1720。doi: 10.1056 / NEJMoa2002032
Gussing, F.， Bohm, S.(2004)。主嗅系统和副嗅系统的NQO1活性与投影图的地带性有关。欧元。j . >。19(9)， 2511-2518。doi: 10.1111 / j.0953 - 816 x.2004.03331.x
他,X。,刘,e·h·Y。吴,P,邓,X。,,,,X。,et al。(2020)。COVID-19病毒脱落和传播的时间动态。Nat,地中海。26(5)， 672-675。doi: 10.1038 / s41591 - 020 - 0869 - 5
Imai, M.， Iwatsuki-Horimoto, K.， Hatta, M.， Loeber, S.， Halfmann, P. J.， Nakajima, N.等人(2020)。叙利亚仓鼠作为新型冠状病毒感染小动物模型及对策研究Proc。国家的。学会科学。美国117(28)， 16587-16595。doi: 10.1073 / pnas.2009799117
Jabs, J. M.， Schwabe, A.， Wollkopf, A. D.， Gebel, B.， Stadelmaier, J.， Erdmann, S.等人(2022)。2020年急诊医院医护人员常规SARS-CoV-2筛查的作用:系统综述和荟萃分析BMC感染。说。22(1)， 587。doi: 10.1186 / s12879 - 022 - 07554 - 5
杨娇,L。,,Y,, W,赵,Y。,H。,高,J。,et al。(2021)。嗅觉路线是新冠病毒入侵恒河猴中枢神经系统的潜在途径。信号转导靶向Ther。6(1)， 169。doi: 10.1038 / s41392 - 021 - 00591 - 7
Kishimoto-Urata, M.， Urata, S.， Kagoya, R.， Imamura, F.， Nagayama, S.， Reyna, R. A, et al.(2022)。SARS-CoV-2对嗅觉神经回路的长期和长期影响。科学。代表。12(1)， 5728。doi: 10.1038 / s41598 - 022 - 09731 - 7
Lauer, S. A.， Grantz, K. H.， Bi, Q.， Jones, F. K.， Zheng, Q.， Meredith, H. R.等(2020)。公开报告的确诊病例的2019冠状病毒病(COVID-19)潜伏期:估计和应用安。内部地中海。172(9)， 577-582。doi: 10.7326 / m20 - 0504
李,a·C。张a·J。陈,J . F。,C,风扇,Z,刘,F。,et al。(2020)。口服SARS-CoV-2接种在金色叙利亚仓鼠中建立亚临床呼吸道感染病毒脱落。病房代表。1(7)， 100121。doi: 10.1016 / j.xcrm.2020.100121
Mori, K.， von Campenhause, H.， Yoshihara, Y.(2000)。哺乳动物主嗅系统和副嗅系统的分区组织。费罗斯。反式。r . Soc。伦敦爵士。B杂志。科学。355 (1404)， 1801-1812doi: 10.1098 / rstb.2000.0736
尼古拉，L. A.，迈耶，C. G.，克里姆斯纳，P. G.，维拉文，T. P.(2020)。无症状的SARS冠状病毒2型感染:隐形却不可战胜。Int。j .感染。说。100年,112 - 116。doi: 10.1016 / j.ijid.2020.08.076
奥兰，D. P.，托波尔，E. J.(2020)。无症状SARS-CoV-2感染的患病率:一项叙述性综述。安。内部地中海。173(5)， 362-367。doi: 10.7326 / m20 - 3012
WH 2022对公众的COVID-19疾病建议．可以在:https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/advice-for-public．
Reyna, R. A, Kishimoto-Urata, M.， Urata, S.， Makishima, T.， Paessler, S.， Maruyama, J.(2022)。感染SARS-CoV-2的仓鼠嗅觉丧失的恢复与嗅觉上皮的修复有关。科学。代表。12(1)， 628。doi: 10.1038 / s41598 - 021 - 04622 - 9
萨尼亚斯亚亚，伊斯兰，M. A.，阿卜杜拉，B.(2021)。2019冠状病毒病(COVID-19)中嗅觉功能障碍的患病率:对27,492名患者的荟萃分析。喉镜131(4)， 865-878。doi: 10.1002 / lary.29286
Yoon Seo, j·S, S W。黄,S . H。南,S M。Nahm, S。,j . H。et al。(2021)。微绒毛细胞和孤立的化学感觉细胞是叙利亚金仓鼠感染新靶点。病毒13 (8). doi: 10.3390/v13081653
图尔迪，A.，菊田，S.，木下，M.， Kamogashira, T.，近藤，K.，岩崎，S.等人(2018)。长期运动或热量限制后，嗅觉上皮背区的感觉神经元密度特异性降低。科学。代表。8(1)， 17300。doi: 10.1038 / s41598 - 018 - 35607 - w
Ueha, R.， Ito, T.， Furukawa, R.， Kitabatake, M.， Ouji-Sageshima, N.， Ueha, S.等人(2022)。口服SARS-CoV-2引起鼻腔病毒感染导致嗅球感染的实验研究前面。细胞。感染Microbiol。12.doi: 10.3389 / fcimb.2022.924725
上叶，R.，近藤，K.，鹿古屋，R.，七野，S.，七野，S.，山叶，T.(2021)。ACE2、TMPRSS2和furin在小鼠和人类的鼻子和嗅球中的表达。鼻科学59(1)， 105-109。doi: 10.4193 / Rhin20.324
上叶，R.，上叶，S.，近藤，K.，菊田，S.，山叶，T.(2018)。吸烟引起的细胞死亡导致老年小鼠持久的嗅觉功能障碍。前面。衰老>。10.doi: 10.3389 / fnagi.2018.00183
上叶，R.，上叶，S.，近藤，K.，坂本，T.，菊田，S.，金谷，K.等人(2016)。吸烟所致小鼠嗅觉功能障碍与嗅觉祖细胞损伤有关。点。j .分册。186(3)， 579-586。doi: 10.1016 / j.ajpath.2015.11.009
Ueha, R.， Ueha, S.， Sakamoto, T.， Kanaya, K.， Suzukawa, K.， Nishijima, H.等人(2016)。香烟烟雾延迟小鼠嗅觉上皮细胞的再生。神经毒性Res。30(2)， 213-224。doi: 10.1007 / s12640 - 016 - 9617 - 5
Urata, S.， Maruyama, J.， Kishimoto-Urata, M.， Sattler, R. A.， Cook, R.， Lin, N.等(2021)。金色叙利亚仓鼠SARS-CoV-2感染后嗅觉上皮的再生特征。ACS化学。>。12(4)， 589-595。doi: 10.1021 / acschemneuro.0c00649
Vidal, E.， Lopez-Figueroa, C.， Rodon, J.， Perez, M.， Brustolin, M.， Cantero, G.等人(2022)。hace2转基因小鼠SARS-CoV-2感染后的时序脑损伤。兽医病理学研究。59(4)， 613-626。doi: 10.1177 / 03009858211066841
Yoshihara, Y.， Kawasaki, M.， Tamada, A.， Fujita, H.， Hayashi, H.， Kagamiyama, H.等人(1997)。OCAM:与嗅觉轴突和犁鼻轴突的带向投射有关的神经细胞粘附分子家族的新成员。j . >。17(15)， 5830-5842。doi: 10.1523 / jneurosci.17 - 15 - 05830.1997
Yu, P,邓、W。包,L,瞿,Y。,,Y。,赵,W, et al。(2022)。K18-hACE2 tg小鼠、hACE2 tg小鼠和感染SARS-CoV-2的仓鼠鼻上皮细胞的比较病理。兽医病理学研究。59(4)， 602-612。doi: 10.1177 / 03009858211071016
关键词:SARS-CoV-2，密切接触，短期同居，嗅觉受体细胞，鼻子，肺，嗅觉上皮
引用:Ueha R, Ito T, Ueha S, Furukawa R, Kitabatake M, Ouji-Sageshima N, Uranaka T, Tanaka H, Nishijima H, Kondo K和Yamasoba T(2022)近距离接触感染叙利亚仓鼠模型中SARS-CoV-2传播和嗅觉细胞谱系损伤的证据。前面。细胞。感染。Microbiol。12:1019723。doi: 10.3389 / fcimb.2022.1019723
收到:2022年8月15日;接受:2022年10月11日;
发表:2022年10月21日。
编辑:
索尼娅Navas-Martin美国德雷塞尔大学版权©2022上叶，伊藤，上叶，古川，北泷，Ouji-Sageshima，天中，田中，西岛，近藤和山叶。这是一篇开放获取的文章，根据创作共用署名许可(CC BY)．在其他论坛上的使用、分发或复制是允许的，前提是原作者和版权所有者注明出处，并按照公认的学术惯例引用本刊上的原始出版物。不得使用、分发或复制不符合这些条款的内容。
*通信:鲁米Ueha,ruu1025@yahoo.co.jp；uehar-oto@h.u-tokyo.ac.jp