方法的文章

前面。细胞。感染。Microbiol。，27October 2022
第二节寄生虫和宿主
卷12 - 2022 | https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.1019789

原生寄生虫合成细胞外囊泡酵母菌属

史蒂文·桑蒂诺·莱昂纳迪 ^{1 __}，

高怡玲 ^{1 __}，

Lei邓 ¹，

Chenyuan黄 ^2、3，

Lingjun通 ^2、3，

Jiong-Wei王 ^{2、3、4、5}而且

Kevin Shyong-Wei Tan ^{1 *}

¹新加坡国立大学永洛林医学院微生物与免疫学系分子与细胞寄生虫学实验室，健康长寿转化研究项目，新加坡，新加坡
²新加坡国立大学Yong Loo Lin医学院外科，新加坡，新加坡
^3.新加坡国立大学Yong Loo Lin医学院纳米医学研究中心，新加坡，新加坡
⁴心血管研究所，新加坡国立大学心脏中心，新加坡，新加坡
⁵新加坡国立大学永洛林医学院生理学系，新加坡，新加坡

酵母菌属是一种单细胞原生生物属，属于小虫群。先前的研究表明，分离的酵母菌属与其他亚型相比，7亚型(ST7)诱导了更高水平的肠上皮细胞损伤和肠道菌群失调在活的有机体内而且在体外设置。先前的研究表明，肠道生态失调与暴露于病原微生物产生的细胞外囊泡(ev)之间存在联系。本研究展示了一种分离电动汽车的方案酵母菌属ST7通过超速离心法。纳米颗粒跟踪分析和透射电镜用于评估EV的大小和形态。用质量分光光度法测定分离EV的蛋白含量，用Western blotting法测定EV标记的存在。最后，将ev与显著的人类肠道微生物组共培养，观察其对原核生物生长的影响。我们的数据显示酵母菌属ST7分泌的ev在形态上与之前从其他生物体中鉴定的ev相似，这些ev含有有限但独特的蛋白质，具有宿主-寄生虫细胞间通信和细胞活力的功能。这批货物可能涉及调解的影响酵母菌属对周围环境的影响。

简介

酵母菌属是一种单细胞嗜stramopilic肠道寄生虫属(西尔伯曼等人，1996年)，分为超过20个小类别(Stensvold等人，2007年)．这种寄生虫对人类和动物的感染是普遍存在的，但在每st的基础上，它受到区域和宿主物种的限制(Parkar et al.， 2010；Alfellani et al.， 2013)．发生感染通过粪便-口腔途径，在发展中国家更为普遍(棕褐色,2008)．在毒力之间和内部都观察到了变异酵母菌属亚型(Wu等，2014b；Ajjampur和Tan, 2016年)．本文重点研究ST7，分离株-B和-H。这种亚型，特别是这些分离株，已被观察到与其他普遍研究的人类感染亚型ST1和ST4相比，表现出更强的毒性特征(亚森等人，2016；亚森等人，2019年)．

的过程酵母菌属定植尚不清楚，虽然研究已经确定豆科蛋白酶和组织蛋白酶b样蛋白酶在表面酵母菌属细胞作为关键毒力因子(吴等，2010；Wawrzyniak等人，2012；Nourrisson等人，2016)．寄生虫附着在肠上皮细胞上的过程特别重要，因为它是静止的，不能主动移动到感染部位(布尔姆等人，2008年)．酵母菌属感染与宿主的积极和消极健康结果都有关联。它与微生物群落的生物多样性的增加有关(斯坎伦等人，2014；Audebert等人，2016)以及炎症性疾病，例如肠易激综合症(Kesuma等人，2019年)及溃疡性结肠炎(Stensvold等人，2013)、细胞损伤引起的疾病，例如结直肠癌(Kumarasamy等，2017；sulyc - bielicka等人，2021)，以及肠道菌群失调(Beghini等人，2017；蒂托等人，2018；比利等人，2021年)．然而，科赫的假设还没有得到证实，寄生虫和疾病之间的明确因果关系还没有被发现。

“细胞外囊泡”(EVs)是由活细胞分泌的三种依赖生物成因的囊泡的统称(Shao等，2018；Huang等，2021)．细菌、哺乳动物细胞和单细胞寄生虫已被证明可分泌与细胞通讯、调节和毒力途径有关的ev (Twu等人，2013；奥尔莫斯-奥尔蒂斯等人，2017年；刘等，2018；Reclusa等人，2020年)．ev被认为含有物种依赖的蛋白质、脂质和核酸，但对其功能和生成知之甚少(Twu等人，2013；Artuyants等人，2020年；Elzanowska等人，2020年)．致病性和共生菌群所产生的ev均与肠道内稳态的改变有关(van Bergenhenegouwen等人，2014；Chang等人，2020年；Cuesta等人，2021年)．特别是，两者痢疾而且贾第虫属研究表明，ev可激活宿主免疫和细胞因子反应在体外模型(埃文斯-奥塞斯等人，2017年；夏尔马等，2020年)．

宿主-寄生虫相互作用通常被认为是在总的分子方面，而宿主和寄生虫之间的信息交换知之甚少。电动汽车的研究是这种信息交换的一个有趣的假定途径。的理解酵母菌属美国生产的电动汽车仍处于萌芽阶段，尽管首次报道于2001年(Tan等，2001)．在这项研究中，我们报告酵母菌属亚型7B和7H分泌的ev具有与其他微生物系统相似的物理特征和蛋白质成分，并表明这些ev具有影响能力在体外宿主细胞和微生物种类。

结果

酵母菌属ST7分泌细胞外囊泡

以确定是否酵母菌属ST7分泌ev，无菌分离株维持在添加5%马血清的IMDM中，在37°C的厌氧条件下。收集条件介质并进行一系列离心循环，这些离心循环适用于Théry等。(Théry等，2006）（图1一个)．使用国际细胞外囊泡学会(ISEV)的建议作为囊泡表征的框架(特里等人，2018年)．透射电子显微镜(TEM)显示典型ev的杯状形态(Rikkert等人，2019年）（图1 b)．酵母菌属ST7B平均分泌1.70*10¹¹粒子毫升^－1，而ST7H平均为1.05*10¹²．利用纳米颗粒跟踪分析(NTA)， 7B和7H的平均EV尺寸分别为230.4±69.5 mm和161.6±72.9 mm (图1 c)．这些数据表明，收集到的介质中含有的囊泡，其大小和形状与其他原生生物产生的囊泡相似(Twu等人，2013；夏尔马等，2020年)．

图1

图1细胞外囊泡的特征酵母菌属ST7在生长培养基中培养。(一)EV隔离协议，改编自Théry等(Théry等，2006)．(B)ST7B和ST7H ev的透射电镜。每张图像中描绘了一辆EV，由红色箭头表示。比例尺= 100nm。(C)ST7B和ST7H在相同培养条件下产生的平均EV大小和浓度。

酵母菌属ST7 EV蛋白覆盖了寄生虫中不常见的GO生物学术语

采用质量分光光度法测定ST7B和ST7H ev和全细胞裂解物(WCLs)的蛋白质含量。包含两个或更多肽的蛋白质被纳入到UniProt数据库中进行下游分析。从ST7B和ST7H EV中分别鉴定出341和321个蛋白，从ST7B和ST7H WCLs中分别鉴定出1503和1517个蛋白。利用PANTHER数据库进行基因本体(GO)分析(Mi等人，2021年)显示，相对于WCLs，两种评估的ST7 EV菌株中与GO分子术语“结构分子活性”相关的蛋白质减少(图2一个)．与WCLs相比，ST7 ev中具有转运蛋白活性的蛋白质也相对增加。在两株WCL中，前四个生物分类GO术语覆盖了绝大多数(≥99%)检测到的蛋白质。在ev中，由这四种生物氧化石墨烯以外的其他生物氧化石墨烯项组成的蛋白质比例增加到总数的14%和16%。

图2

图2功能分析酵母菌属ST7 EV蛋白质组。(一)表比较了ST7 ev和全细胞裂解液中存在的蛋白质。用质量分光光度法鉴定蛋白质。利用基因本体分析预测蛋白质功能通过黑豹数据库。(B)显示本研究中鉴定的ST7B/ST7H EV蛋白之间重叠的维恩图，痢疾阿米巴电动汽车由夏尔马等，2020年，以及由Vesiclepedia数据库策划的前100个EV标记。(C)Western blot分析内体分选(RAB5C;23 KDa)，肿瘤抑制基因(TSG) 101 (TSG101;45KDa)和囊泡转运富集(PDCD6IP/ALIX;97 KDa)标记酵母菌属ST7 ev和裂解物(L)，载脂蛋白ApoA1 (31 KDa)作为阴性标记物对照(特里等人，2018年)．每个通道均加载200µg EV蛋白。图中所示的Western blot代表了三个序列。

酵母菌属ST7 ev含有整体ev不常见的蛋白质

筛选ST7 EV蛋白组。覆盖>2%的鉴定蛋白被排除在外。然后将过滤后的EV蛋白质组与痢疾阿米巴EV蛋白质组和分析时在Vesiclepedia数据库中列出的前100种最常见的EV蛋白质(Kalra et al.， 2012；夏尔马等，2020年)．在ST7H 154个蛋白质和ST7B 159个蛋白质中，ST7 ev和前100个蛋白质共有9个蛋白质。这代表了每个EV亚型中观察到的蛋白质总数的约6%。ST7和痢疾电动汽车。ST7H ev表达更多与痢疾ST7B。其中46个(占7B总数的28.9%)和36个(占7H总数的23.4%)是该菌株所特有的酵母菌属ST7。

酵母菌属ST7 ev不表达tetraspanin家族蛋白

四筋蛋白家族是已知的泛ev标记(Yáñez-Mó等，2015)在ST7 EV蛋白质组中缺失。在其他寄生虫衍生的ev中也观察到这种缺失(Tzelos等人，2016年；阿拉伯等，2019年；汉森等人，2019年)．针对现有的NCBI BLAST验证酵母菌属基因组参考(Denoeud等人，2011)在遗传密码中没有发现与四筋蛋白家族的同源物。

观察到的酵母菌属ST7 EV蛋白数据不是由于WCL污染

利用Western blotting证实现有EV样本中没有WCL污染(图2 c)．在我们的质量分光光度法中鉴定的蛋白ALIX(程序性细胞死亡6相互作用蛋白)、TSG101(肿瘤易感基因101)和RAB5C (RAS癌基因家族成员)同样存在于我们的western blotting中。APOA1(载脂蛋白A1)被用作EV纯度控制，因为它在以前的文献中作为WCL污染的指标(Karimi等人，2018；特里等人，2018年)．在我们的EV样本中未观察到APOA1。

酵母菌属ST7 ev诱导HT29细胞死亡

使用CFSE标记ST7 ev。然后，HT29细胞在37°C下，在不同浓度的标记ev中孵育1小时。共聚焦成像显示在所有浓度下标记ev的摄取和内化(图3一)．一些细胞表现出明显的活力丧失迹象，特别是膜泡。细胞用碘化丙啶(PI)染色并评估通过流式细胞术(图3 b)．与ST7 ev孵育的HT29细胞显示PI荧光增强。与ST7B和ST7H孵育时，分别有10.8%和11%的细胞呈PI阳性，而对照组细胞的PI阳性<1% (图3 c)．

图3

图3吸收酵母菌属HT29细胞的ev导致细胞死亡增加。(一)共聚焦显微镜图像显示HT29细胞占用酵母菌属ev (HT29细胞核用Hoescht 33342染色为蓝色，HT29细胞膜用CellMask™深红色染色为粉红色，ev用CFSE染色为绿色)。比例尺= 10µm。(B)流式细胞术分析HT29摄取酵母菌属电动汽车。FITC信号(x轴)为CFSE染色;mCherry信号(y轴)表示碘化丙啶染色。蓝色门中的细胞已经占据了ev，无法存活。(C)cfse染色EV摄取的非活细胞比例表示为平均值±SEM。N =3个独立实验。* p < 0.05。

酵母菌属ST7电动汽车会有影响b . longum而且大肠杆菌增长

在2019年的一项研究中，我们的实验室表明，共培养与酵母菌属ST7可以影响某些肠道细菌的生长(亚森等人，2019年)．在这里，我们研究了在与ST7 ev共培养时是否观察到类似的效应。我们cocultured大肠杆菌，长肠杆菌,l .短交替使用标准数量的电动汽车(10⁷)，以及之前实验中观察效果所需的ev浓度(80µg)。b . longum与ST7 ev培养时，生长下降，而大肠杆菌与ST7B ev培养时，生长增加。l .短仍不受影响。这些结果与上述研究中观察到的结果相似。

酵母菌属ST7B ev可影响THP1细胞炎症因子

Teo等人2014年的一项研究(Teo等人，2014)显示酵母菌属ST7，包括分离的ST7B，能够改变THP1-Blue细胞中的NF-κB水平。我们使用qPCR方法评估ST7B ev是否能诱导三种NF-κ b相关细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。与ST7B ev共培养时，IL-1β表达显著升高，IL-6表达显著降低。

讨论

本研究首次对合成的ev进行了鉴定和表征酵母菌属，让人们注意到它们在寄生虫-宿主相互作用中的假定作用。本研究中使用的两种ST7分离株(ST7B和ST7H)据报道毒性更强(Wu等，2014a；Wu等，2014b)，对抗寄生虫药物的抗药性增加(米尔扎等人，2011)，并在更大程度上诱导宿主免疫反应(亚森等人，2016)与其他酵母菌属子类型。特别是,酵母菌属ST4已被证明对宿主有有益的影响(邓等人，2021；邓和谭，2022年)．目前，这些亚型和其他亚型在观察到的致病性上的差异还没有得到解释，而EV特征的差异提供了一个潜在的解决方案。

我们表明，ST7电动汽车符合典型的电动汽车尺寸和结构的特征，在其他地方(Twu等人，2013；埃文斯-奥塞斯等人，2017年)．我们还建立了由一致数量的合成ev的数量酵母菌属；在日后的研究中，这些资料将是有用的比较点(图1)．我们定义了ST7 EV蛋白质组通过质量分光光度法和western blotting证实了典型EV蛋白ALIX、TSG101和RAB5C (图2)．这证实了我们能够成功地分离出源自酵母菌属．研究人员注意到泛ev标记tetraspanin的缺失，但这可能是由寄生虫产生的ev缺乏tetraspanin的另一个实例(Tzelos等人，2016年；阿拉伯等，2019年；汉森等人，2019年)．

基因本体论分析显示，所鉴定的EV蛋白中含有丰富的WCL中不常见的GO生物分类术语。未被前四个生物学术语描述的蛋白质在ST7 WCL中约占不到1%，而在ST7 EV蛋白质组中约占15%。同样地，203个过滤的ST7 EV蛋白中有169个对Vesiclepedia进行了评估图2 b是独一无二的酵母菌属．另外82种蛋白质是ST7B或ST7H所独有的。这表明酵母菌属ev可以拥有一种独特的蛋白质，即使在单个亚型的分离株之间也会发生分歧。ev通常表现出显著的可变性，因此必须进行进一步的研究来证实这些结果(Tiruvayipati等人，2020年；Newman等人，2021年)．

荧光显微镜显示ST7 ev可被人体吸收在体外模型细胞系，它们对这些细胞的活力有负面影响，表现为碘化丙啶摄取的增加(图3)．我们证明了ST7 ev对肠道菌群的影响(图4)与期间观测到的结果一致酵母菌属-原核细胞共培养实验(亚森等人，2019年)——具体来说，是对有益肠道物种的抑制b . longum（Wong等人，2019年)与高浓度ev孵育。最后，我们研究了ST7B ev对分化THP-1细胞内炎症细胞因子的影响，结果表明IL-1β的表达随着ST7B ev浓度的增加而增加(图5)．IL-1β是一种与胃肠道癌和t细胞活化相关的促炎细胞因子(Lu et al.， 2005；Ben-Sasson等人，2013)．ST7电动汽车对大肠杆菌生长和IL-6表达具有统计学意义，但不依赖于剂量，需要进一步研究来验证观察到的效果。我们的研究结果证明酵母菌属ev抑制有益肠道原核生物的生长，降低人类胃肠细胞模型的生存能力，并在同一模型中增加促炎、致癌细胞因子的表达。这些与生态失调、炎症和对宿主肠道上皮细胞的损伤相关——所有与肠道疾病相关的疾病特征酵母菌属（图6)．这表明酵母菌属ev可能在观察到的寄生虫在肠道中诱导的有害影响中发挥作用。

图4

图4酵母菌属ST7 ev会导致B longum同时增加大肠杆菌增长。Coculture的酵母菌属PBS中含有三种生理相关的人类肠道微生物群的ST7 ev:(一)短乳，(B)双歧杆菌longum,(C)大肠杆菌．bar表示共培养24小时后原核细胞的生长水平(均值±标准差)。使用了两种标准量的EV: 80µg，即产生在实验中观察到的效果所需的量图3 b，和10⁷ev(图中转换为µg)。采用双因素方差分析进行统计检验;n = 3。统计学意义星号表示相对于没有ev补充的对照生物体的显著性(如虚线所示)。* * p < 0.05。

图5

图5酵母菌属在人类免疫细胞模型中，ST7B ev改变炎症标志物水平。THP1细胞与不同浓度的ST7B ev孵育。qPCR检测3种促炎蛋白IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。条形图表示相对于没有ev培养的对照组的DNA表达折叠变化。采用双因素方差分析进行统计检验;n = 3。统计学意义星号表示相对于未补充ev的细胞的显著性(如虚线所示)。

图6

图6效果的图形表示酵母菌属基于本研究中观察到的结果和与之相关的条件，ev可能在人类宿主上产生酵母菌属感染。改编自BioRender.com的《受损肠膜》(2022年)。从检索https://app.biorender.com/biorender-templates．

结论

有益和致病的途径酵母菌属亚型影响宿主细胞，宿主菌群特征仍然不明显。了解这些途径将有助于阐明酵母菌属毒性和原因之间的行为高度分化酵母菌属子类型。本文提出电动汽车作为一个可能的中介之间的相互作用酵母菌属微生物组和宿主。未来的工作可以利用我们的实验作为出发点，更深入地研究这里显示的结果，着眼于建立ev和效应之间的因果关系，或研究更复杂的模式生物。重要的是需要确定这些影响在其他方面是否可见酵母菌属亚型，如果是，它们的严重程度是否与亚型和分离物的毒力相关。

材料与方法

酵母菌属文化

人类酵母菌属20世纪90年代初，在新加坡国立大学(NUS)机构审查委员会成立之前，从新加坡总医院的患者身上获得了分离株。这两个酵母菌属ST7分离株-B和-H保存在新加坡国立大学微生物学和免疫学系的微生物收集处。两种培养基先前都经过了轴化处理酵母菌属ST7B及ST7H (Ho等人，1993年)保存在预还原的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM) (Gibco，新西兰)中，补充热灭活的5%马血清(Gibco，新西兰)。这些培养物用Anaerogen气体包(Oxoid，美国)在37°C的瓶中进行厌氧培养，每周进行一次继代培养。

HT-29细胞培养

人结直肠腺癌细胞系HT-29 (ATCC Cat。不。HTB-38)细胞保存在T-75烧瓶(美国康宁公司)中，在37°C、5% CO2的湿化培养箱中。Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM;Thermo Scientific, USA)添加10%热灭活胎牛血清(Gibco, USA)和青霉素-链霉素、非必需氨基酸(Gibco, USA)和丙酮酸钠(Gibco, USA)各1%，并指定为完全培养基。

HT-29细胞以大约1 x 10的速度播种⁵细胞毫升^－1孵育48小时以达到至少80%的融合度，随后与无血清DMEM细胞同步24小时。然后使用HT-29细胞进行共聚焦成像，辅以80µg和/或~1 x 10的ev⁷酵母菌属ST7(整个)细胞mL^－1,分别。以不含ev的HT-29细胞为对照。

细菌培养

大肠杆菌(写明ATCC 11775),双歧杆菌longum(ATCC 15707)和短乳(ATCC 14869)分别在Luria-Bertani (LB)， Bifidus Selective Medium (BSM)和deMan, Rogosa, Sharpe (MRS) Medium(均来自Sigma-Aldrich, USA)上进行肉汤和琼脂培养。所有培养物均在37°C的厌氧瓶中与AnaeroGen™气体包(Oxoid, USA)孵育。实验前用分光光度计在600 nm波长下对细菌肉汤培养物进行吸光度读数。

差速超离心富集ev

Théry等人建立的超离心协议(特里等人，2018年)用于分离EVs，其中无血清细胞培养基(CCM)在4°C下以300 x g离心10分钟，通过制粒去除较大的细胞。将上清液转移到新管中，在4°C下以2000 x g离心10分钟，将死亡细胞制成颗粒，然后在4°C下以10000 x g离心30分钟，收集细胞碎片。澄清后的CCM在Optima™L-90超离心机(Beckman Coulter, USA)中以100,000 x g在4℃下离心70分钟，使用SW41Ti旋斗转子(Beckman Coulter, USA)将EV制成颗粒，用1xPBS洗涤，然后在4℃下以100,000 x g再次离心70分钟。得到的EV颗粒在100μL 1xPBS中重悬，并在-80℃保存直到使用。

透射电子显微镜

用2.5%戊二醛在4℃下固定1小时，制备新鲜分离的ev，用于透射电镜(TEM)观察。每个样品的体积为20µL，在Formvar Film 200目，CU, FF200-Cu网格上孵育5分钟(电子显微镜科学，美国)。用2.5%三乙酸钆孵育1分钟，进行阴性染色。固定样品在室温下在FEI TECNAI SPIRIT G2 (FEI公司，美国)上观察。显微图像从三个独立的实验中获得，每个实验有三个技术重复(n=9)。

纳米颗粒跟踪分析

将ev在过滤过的磷酸盐缓冲盐水中稀释至数据采集的最佳浓度。在室温下录制了5段60秒的视频片段。随后使用NanoSight NTA软件v3.2 (NanoSight, United Kingdom)对这些视频片段进行检测阈值为4-6的分析。数据来自3个独立实验，每3个技术重复(n=9)。

用质量分光光度法测定总蛋白含量

以裂解缓冲液(50mM三乙基碳酸氢铵、8M尿素、1%脱氧胆酸钠)以1:2的颗粒体积与裂解缓冲液的比例均质提取UC分离ev中的蛋白质。酵母菌属ST7B和ST7H细胞裂解物作为对照。混合物在室温下孵卵20分钟，每5分钟涡旋一次，然后在≥21,000 x g的条件下在4℃下离心30分钟。将所得上清液转移到新的微量离心管中进行分析。ev和细胞裂解蛋白样品在两个独立的技术运行的两个生物重复中进行分析。在使用TripleTOF之前对样品进行胰蛋白酶消化^®5600系统(Sciex，美国)。

使用ProteinPilotTM Software v5.0 (Sciex, USA)在UniProt蛋白质数据库中搜索蛋白质序列。使用Paragon搜索算法，以下参数设置为默认值:胰蛋白酶特异性，cys烷基化，彻底错误发现率(FDR)。酵母菌属hominis被用作参考生物(Denoeud等人，2011)．只考虑在95%置信水平(CI)下，FDR为1%的多肽发生率≥2。维恩图酵母菌属ST7 EV蛋白是唯一的，共有的，共有的Entameoba阿米巴电动汽车(夏尔马等，2020年)和100种最常见的EV蛋白质(Kalra et al.， 2012)使用Venny v2.1.0的在线版本(Oliveros 2007)．与EV蛋白相关的功能通路酵母菌属ST7由KEGG分析推断(Kanehisa Laboratories, Japan)，基因本体(GO)注释结果由PANTHER数据库(Mi等人，2021年)．

免疫印迹

酵母菌属用含Protein iniinhibitor (100x)的RIPA (Invitrogen, USA)在冰上裂解30分钟。在Infinite上使用PierceTM BCA蛋白测定试剂盒(thermofisher Scientific, USA)对蛋白质进行定量^®200 PRO NanoQuant (TECAN，美国)。从每个样品中提取约200µg蛋白质，在4倍加载缓冲液(Invitrogen, USA)中在98°C下加热10分钟;然后将样品加载到SDS-PAGE凝胶上，在110 V下进行蛋白带分离约1小时。光谱多色广谱蛋白阶梯(thermofisher, USA, Cat。编号26623)作参考。将样品转移到硝化纤维膜上，用5% BSA在tris缓冲盐水+ 1% Tween20 (TBST)中阻塞，然后用一抗孵育过夜:兔单克隆抗alix (Abcam, USA, Cat)。不。ab186429)，兔单克隆抗rab5c (Abcam, USA, Cat。不。ab199530)，兔单克隆抗tsg101 (Abcam, USA, Cat。 No. ab125011) and rabbit monoclonal anti-Apo-A1 (Abcam, USA, Cat. No. ab52945). Membranes were washed three times with TBST and mouse anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody incubation was carried out for 60 minutes at room temperature. Protein bands were visualized using the Electrogenerated Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Substrate Kit (Millipore, USA, Cat. No. 1825002) and imaging was performed on a ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Data were acquired from three independent experiments.

细胞摄取酵母菌属-衍生ev和共聚焦显微镜活细胞成像

纯化酵母菌属-衍生ev用Vybrant标记^®CFDA SE细胞示踪试剂盒(Invitrogen, USA;(以下简称CFSE)，如上文所述(莫拉莱斯-卡斯特雷萨纳等人，2017年)．简单地说，将100µL CFSE(200µM)添加到80µg ev中，并在37°C下孵育15分钟。通过离心将细胞重新制成颗粒，在新鲜的预热PBS中重悬，并进一步孵育30分钟，以确保探针的完全修饰。cfse染色的ev用PBS离心洗涤一次，然后在无血清培养基中重新悬浮。

对于EV摄取和细胞内定位的实时共聚焦检查，10⁵细胞毫升^－1将HT-29细胞接种到8孔的µ-Slide (ibidi GmbH, Germany)中，按照上述方法培养，然后加入cfse染色的ev，浓度分别为200µg或500µg，在37°C下共孵育1小时。随后将上清液替换为由Hoescht 33452和CellMask™质膜染色深红色(thermofisher, USA)染料组成的混合物，在室温下孵育15分钟后进行实时成像。所有图像均在Olympus FV3000共聚焦激光扫描显微镜(Olympus Corporation, USA)油浸(n=3)下拍摄，每个样品至少拍摄3张图像。阴性对照包括仅染色HT-29细胞而无cfse染色ev。

流式细胞术

在Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter, USA)上对HT-29细胞摄取cfse染色的EV进行定量。按照描述制备细胞用于共聚焦显微镜，用0.25% EDTA-trypsin在5% CO2培养箱中于37℃下胰蛋白酶化10分钟。将分离的细胞离心成球，然后去除上清液;然后用0.5mL的1xPBS体积重悬细胞颗粒，然后加入0.5µL的PI (0.1mg mL^－1)进行流式细胞仪检测。数据由3个独立实验计算，每个样品2个技术重复(n=6)。

共培养的酵母菌属-衍生ev与细菌细胞

l .短，b . longum而且大肠杆菌细胞在1000 x g的PBS中洗涤两次10分钟。在联合孵育之前，使用亚森等人概述的滴板法枚举了一组细胞。亚森等人，2019年)，以确定初始细胞的数目。然后在厌氧条件下，将浓度为80µg的ev与1mL PBS洗涤的细菌细胞在37°C的预还原PBS中孵育24小时。24h后计数细菌数量，计数细菌集落形成单位(cfu) mL^－1是在琼脂板上出现菌落时确定的。对照只含有细菌细胞或与10个细菌细胞共培养⁷酵母菌属细胞毫升^－1包括预还原PBS。每种细菌细胞类型的数量来自三个独立的实验，每个实验有三个技术重复(n=9)，相对于对照组以%表示。

THP1细胞培养

THP1细胞系(Invivogen, USA)保存在RPMI-1640 (Gibco, USA)中，添加10%热灭活胎牛血清(FBS) (Gibco, USA)， 100 U mL^－1青霉素，100 μg mL^－1链霉素(ThermoFisher, USA)。在37°C和5% CO2的加湿培养箱中，以2.5 × 106个细胞的密度将细胞接种到T-75瓶中。为了将THP1细胞分化为巨噬细胞，细胞用25 ng/mL的12-肉豆汤酸13-乙酸phorbol (Sigma-Aldrich, USA)刺激48小时。然后将pma分化的THP1细胞与酵母菌属st7衍生的ev(50、100和200 ng mL^－1，分别)或PBS(阴性对照)48小时。

RT-qPCR基因表达分析

提取总RNA酵母菌属根据制造商的协议，使用RNAzol RT (Sigma-Aldrich, USA)进行st7衍生ev和pbs处理的THP1细胞。利用iScript cDNA试剂盒(Bio-Rad, USA)合成互补DNA。SsoAdvanced™通用SYBR Green Supermix (Bio-Rad，美国)用于应用生物系统公司7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司，美国)的所有qPCR扩增。qPCR反应在总体积为10 μL的主液和2 μL的cDNA模板中进行。前者含有5 μL SsoAdvanced™Universal SYBR Green Supermix (2×)，每个引物0.3 mM，用无核酸酶水最多10 μL配制。以肌动蛋白为管家基因，qPCR检测3种促炎因子TNF-α、白细胞介素(IL -6)和IL-1β。折叠变化由2−(ΔΔCt)方法确定(Zhang等，2013)．

统计分析

数据以三次重复实验的均数±标准误差(SEM)表示。如各自方法子节所述，进行了两次技术重复(n=6)或三次技术重复(n=9)。采用GraphPad Prism v8.0软件对采集数据进行统计分析(迅速,1997)．方差分析(ANOVA;计算两组以上的比较)，以p值<0.05为有统计学意义。

数据可用性声明

该研究中提出的原始贡献是公开的。这些数据可以在这里找到:https://data.mendeley.com/datasets/4r7xgpdrj4．

作者的贡献

KT和EK构想了这项研究，并参与了设计和协调。EK与CH、LT和J-WH进行了相关实验并组织了合作图1而且2．CH对。进行NTA分析图1 c，而LT则完成了蛋白质的工作图2 c．J-WH协调了他们的工作。DL进行了有关的实验图5．SS编写并编辑了手稿，KT最终提交。所有作者都阅读并批准了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项研究工作得到了新加坡国立大学外科种子基金(N-176-000-100-001)和Yong Loo Lin医学院“同一个健康下的囊胚”基金(NUHSRO/202 /074/NUSMed/Blastocystis/LOA)的支持。SS感谢新加坡大学博士研究奖学金的支持。EK获得了新加坡国立大学教育部博士后奖学金的支持。获得教育部研究奖学金。中国国家留学基金委资助项目(202006330097)。JWW感谢新加坡国立大学纳米医学项目(NUHSRO/2020/002/ NanoNASH /LOA)和新加坡国立大学勇罗林医学院纳米医学转化研究项目(NUHSRO/2021/034/TRP/09/纳米医学)的支持。

致谢

作者感谢Geok Choo Ng女士出色的行政和技术支持。作者还感谢以下人员提供的优秀技术支持和建议:Cyrill Kafi Salim先生在EV摄取成像协议方面提供的技术建议，新加坡国立大学医学流式细胞仪部门的Shu Ying Lee女士在共聚焦显微镜方面提供技术建议，王晓宁女士在流式细胞仪方面提供技术建议，新加坡国立大学SINGMASS部门的Lin Qifeng博士和Teck Kwang Lim先生在新加坡。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

参考文献

阿吉姆布尔，s.s.r，谭，k.s.w .(2016)。囊胚虫的致病机制——来自在体外而且在活的有机体内研究。Parasitol。Int。65年,772 - 779。doi: 10.1016 / j.parint.2016.05.007