肠道寄生虫的外溢和基因组选择微孢子虫不同种类的蜜蜂
Xiuxiu魏1,
杰伊·d·埃文斯
砚平陈
羌族黄- 1江西农业大学蜜蜂研究所，中国南昌
- 2美国农业部-农业部蜜蜂研究实验室，美国马里兰州贝茨维尔市barc东楼306号
- 3.德克萨斯大学奥斯汀分校综合生物学系，美国德克萨斯州奥斯汀
微孢子虫是一种蜜蜂肠道寄生虫，最近通过交易蔓延到另一个蜜蜂宿主。感染对原生宿主的影响很小，而对新宿主的影响很大。在本研究中，人工接种模拟了寄生虫从原生宿主向新宿主的传播。我们发现寄生虫在新宿主中比在原生宿主中更早地开始增殖。此外，与原生宿主相比，感染新宿主时寄生虫基因表达显著提高，导致孢子数量显著增加。感染原生寄主和新寄主的寄生虫孢子的等位基因频率相似。这表明，在新宿主中发现的大量孢子并不是由来自原生宿主的更适合的孢子的子集引起的。与新宿主相比，原生宿主在感染反应中也表现出更多的上调基因。我们的数据进一步表明，原生宿主抑制了寄生虫基因的表达，并可能牺牲细胞来限制寄生虫。该结果为宿主防御和寄生虫溢出事件中的基因选择提供了新的见解。
简介
宿主-寄生虫进化涉及相互作用物种之间的相互遗传变化(Brockhurst et al.， 2014)．当寄生虫感染一个新宿主时，通常观察到高毒力。国际贸易极大地促进了寄生虫的外溢。蜜蜂是最重要的商业传粉者。蜂蜡和蜂果的贸易已导致蜜蜂寄生虫在全球传播，对养蜂业造成重大损害(伊德里苏等人，2019年；Liu等，2021)．微孢子虫是一种专性细胞内寄生虫，感染蜜蜂中肠上皮细胞(Higes et al.， 2007)．n ceranae是亚洲蜜蜂的本地寄生虫api cerana并成功地在新的蜜蜂物种中建立了感染，的蜜蜂（Fries等人，1996年；Higes et al.， 2006)．利用一组遗传标记，发现了高度的遗传多样性n ceranae（Gómez-Moracho等，2014；Pelin et al.， 2015)．然而，不同地理区域之间的差异较小，这表明基因流动是由人类介导的。这种感染在新的蜜蜂宿主中表现出高水平的毒力，导致飞行能力受损，寿命缩短，免疫反应受到抑制(Antunez等人，2009年；Dussaubat等人，2013；Goblirsch等人，2013；盖奇等人，2018)．然而，感染对原生宿主的影响很小。由于这两种蜜蜂在亚洲和澳大利亚共享栖息地，因此提供了一个理想的使用机会蜜蜂,答:cerana,n ceranae作为研究寄生虫外溢的模式生物。
n ceranae最近被提议Vairimorpha（Tokarev等，2020年)．为了与以往文献一致，我们保留了n ceranae．本研究旨在揭示报道的寄生虫外溢到新宿主后高毒力下的机制。因此，我们量化了宿主和寄生虫的基因表达，覆盖整个增殖周期。此外，我们还研究了寄生虫基因型的一个子集是否有利于导致高毒力。
结果
原生宿主感染后死亡率较高
未感染组未发现寄生虫孢子。在实验组中，未感染的新宿主存活率最高(> 98%)，与未感染的原生宿主无显著差异(Log Rank，调整后)P> 0.05)。相比之下，感染原生宿主的存活率最低(87%)，显著低于其他三组(Log Rank, adjusted)P< 0.001) (图1 b)．在感染后14天(dpi)，在新寄主中发现了510万个孢子，显著高于在原生寄主中发现的孢子(Kruskal Wallis试验)，P< 0.05) (图1 c)．
图1(一)本研究的实验设计。孢子是从原生宿主中纯化出来的。然后将孢子分别接种到来自原生和新宿主的新出的蜜蜂中，以收获产生的孢子。被感染蜜蜂的基因表达(RNA-seq)从1到5 dpi被量化，覆盖了寄生虫的完整增殖周期。此外，在14 dpi时，对寄生虫基因组上的snv进行了量化并比较了亲本孢子和产生孢子之间的snv。(B)蜜蜂的累积存活率。被寄生虫感染的原生宿主(F1_native)的死亡率最高(Log Rank，调整后)P< 0.001)。(C)寄生虫孢子装载在受感染的原生和新宿主中。与原生宿主相比，新宿主中产生的孢子数量显著增加(Kruskal Wallis测试，P< 0.05)。y轴表示以2为底对数变换后的孢子载量。(D)在亲本宿主中鉴定的snv和在原生宿主中产生的孢子的维恩图。(E)在亲本中鉴定的snv和在新寄主中产生的孢子的维恩图。无论寄主种类如何，产生的孢子中至少有90%的亲本snv。此外，产生的孢子中超过50%的新snv在每个宿主物种的重复之间共享，这表明突变可能不是随机的(Fisher的精确测试，P< 0.001)。
寄生虫在新宿主中比原生宿主更早地开始增殖
在寄生虫增殖过程中，感染新寄主的寄生虫中有762个基因显著过表达，远高于原生寄主中26个基因的过表达(Fisher’s Exact检验，P< 0.001) (图2一个)．显著调控基因在遗传信息处理中富集(图2 b)．在新寄主中，早在一个dpi时就检测到寄生虫基因表达。相比之下，在原生宿主中直到3 dpi才检测到感染(图2一个)．此外，当寄生虫在新宿主中增殖时，有11个基因在3个时间点过表达，包括一个极管蛋白(G9O61_00g021150)。以基因组为背景，在感染新寄主(GO:0000790，调整后)的寄生虫中，核染色质相关基因显著富集P< 0.01)。
图2调控基因功能分析。(一)两种寄主的寄生虫基因表达谱。寄生虫在小说中表现出比原生宿主更高的基因表达水平(费雪精确测试，P< 0.001)。(B)显著调控的寄生虫基因的假定功能。(C)新宿主显著调控基因的数量。新宿主中被抑制的基因数量显著高于过表达的基因数量(配对t检验，P< 0.01)。(D)显著调控的新宿主基因的假定功能。(E)原生宿主显著调控基因的数量。基因表现为抑制表达模式。(F)显著调控的原生宿主基因的假定功能。在(b, d, e)在KEGG的全局通路图和基因组图中使用功能类别的颜色。右边的功能类别在饼图中按顺时针顺序表示。
原生宿主比新宿主对寄生虫感染表现出更强的反应
在新宿主中，从1到5 dpi，抑制基因的数量是过表达基因的2倍(图2 c，配对t检验，P< 0.01)，在遗传信息处理中富集(图2 d)．在原生宿主中，整个实验期间，抑制基因数量略高于过表达基因数量，但不具有统计学意义(图2 e，配对t检验，P= 0.057)。显著调控基因在环境信息处理中富集(图2 f)．在蜜蜂中，原生宿主感染后显著调控的基因数量(719个基因)明显高于新宿主(342个基因;费雪精确检验，P< 0.001)。以基因组为背景，与细胞周期相关的基因(GO:0000082，调整P< 0.001)在新宿主和与转录调控相关的基因(GO:0006357，已调整)中富集P< 0.001)在原生宿主中富集。
寄主种类对寄生虫基因组选择的影响较小
平均而言，74,002,415个reads (150bps成对reads，超过1000倍的基因组覆盖率)对齐到基因组n ceranae某文库基因组，占总测序reads的97.4%。在F0孢子中，鉴定出99999个单核苷酸变异(SNVs)。F1_native组共鉴定出105,768个(F1_native_1)、100,983个(F1_native_2)和103,965个(F1_native_3) SNVs (图1 d)．相比之下，在F1_novel组中鉴定出100,765 (F1_novel_1)， 101,506 (F1_novel_2)和100,772 (F1_novel_3)个snv。图1 e)．在F0孢子的99,999个snv中，在原生和新宿主的三个重复中分别发现了90,249和91,827个snv。90%以上的亲本snv在感染产生的孢子中被发现，与宿主物种无关。维持snv的数量与宿主物种无关(Fisher的精确测试，P> 0.05)。基因组分化指数(F圣)的差异略小于宿主物种之间的差异(表1)．在产生的孢子中，与亲本孢子相比，原生宿主比新宿主表现出更大的基因组分化。亲代孢子和产生的孢子表现出相似的基因组多样性(π),沃特森的θ，与宿主种类无关(表1)．日本田岛的维所有分离株均为阳性。对从F0到F1孢子维持snv的系数S进行了量化。在等位基因频率变异最高的前1%的位点中，这些位点在重复和宿主物种之间高度一致，显著高于随机(Fisher’s Exact检验，P< 0.001)。其中鉴定出50个基因，ATP结合显著富集(GO:0005524，经调整)P< 0.001)和细胞增殖(GO: 0010971，调整P< 0.01)。
表13种寄生虫分离株的群体遗传统计(Mean±SE)。
讨论
在生态学和保护生物学中，了解寄主和寄主之间的共同进化尤为重要(Gómez和Nichols, 2013；帕普洛斯卡斯等人，2021年)．大多数宿主-寄生虫相互作用的经验和理论研究都是在配对的宿主和寄生虫中进行的(Rabajante等人，2016；Best等，2017；Ebert和Fields, 2020年)．在自然条件下，寄生虫可感染并在多个宿主之间传播(贝利等人，2009年)．因此，寄生虫的传播和多样性取决于宿主丰度和易感性的相对程度(哈迪和库克，2010年；Neiman and Fields, 2016)．n ceranae是蜜蜂的细胞内肠道寄生虫，通过粪便-口腔途径传播。传播在很大程度上取决于蜜蜂之间的直接接触(如蜂群成员之间的营养关系)和间接接触(通过经常访问的花朵)(Graystock等人，2015)．作为其范围的一部分，n ceranae已经从亚洲蜜蜂蔓延到欧洲蜜蜂，在这种情况下，变化的动态取决于宿主物种数量的相对丰度(Hovestadt等人，2019)．先前的研究发现，这种感染在新宿主中显示出高毒力(Eiri等人，2015；盖奇等人，2018；巴黎等，2018)．在这项研究中，我们发现寄生虫n ceranae在新寄主中产生的孢子数量明显高于原生寄主。这表明，新的宿主不能在单个蜜蜂水平上抑制寄生虫的增殖，正如我们之前在蜂群水平上发现的那样(Wu等，2022)．此外，我们发现原生宿主具有更高的死亡率。因此，本地宿主可能通过牺牲受感染的蜂巢成员来限制寄生虫的生长，这是在选择的蜜蜂品系中观察到的特征n ceranae公差(Huang等，2012)．在本地宿主中也观察到类似的现象，即牺牲受感染的幼虫以限制螨的繁殖(Page等人，2016)．
用一套记号笔，n ceranae据报道，蜂群内的多样性高于邻近蜂群(Gómez-Moracho等，2014；Gómez-Moracho等，2015)．之前，我们发现的遗传多样性n ceranae在本地蜜蜂和新蜜蜂物种共存的栖息地中，这一比例要高得多(Ke等人，2021年)．这项研究发现，不同重复之间的遗传多样性变异存在微小差异。在我们的数据中，π略高于沃特森的θ，导致一个小的积极日本田岛的维，这表明在所有寄生虫分离株中都存在少量的低频等位基因。罕见位点可能有很强的丢失趋势，基因组处于平衡选择(傅，李，1993；斯塔奇和哈恩，2005年)．固定指数F圣反映整体基因组分化。在我们的数据中，F圣在一个物种内的比例略高于两个宿主物种之间的比例，这表明宿主特异性适应影响了基因组进化，尽管这种影响并不强烈。在寄主-寄生虫研究中，等位基因频率波动可以提供对毒性和感染的深入了解(坎贝尔等人，2013；Papkou等，2019)．在我们的研究中，宿主物种对等位基因频率变化的影响较小，这可能反映了它们之间密切的系统发育关系。
的生命周期n ceranae大约是4天(Higes et al.， 2007；Gisder等人，2011)．在我们的数据中，当感染新宿主时，增殖开始得更早。结果，在新宿主中发现了更多的孢子。在寄生虫基因组中，有2280个基因被注释。其中，762个基因在感染新宿主时显著上调，广泛参与DNA/RNA复制。值得注意的是，极性管蛋白不断上调，这是附着在宿主细胞膜上所必需的，对启动感染至关重要(韩等，2017)．当极性管蛋白的表达水平被抑制时，产生的孢子数量大大减少(罗德里格斯-加西亚等人，2018)．接种后，原生宿主对感染反应强烈。众所周知，n ceranae抑制受感染蜜蜂的细胞凋亡，细胞凋亡加速的蜜蜂更能耐受感染(Higes et al.， 2013；Kurze等，2015)．在我们的数据中，细胞周期基因在新宿主中被抑制，这表明受感染的细胞不能启动细胞凋亡来限制寄生虫的增殖。因此，细胞凋亡可能反映了原生宿主用于限制的一种重要策略n ceranae感染。
材料与方法
宿主和寄生虫来源
蜜蜂，api cerana，是寄生虫的原生宿主微孢子虫和蜜蜂的蜜蜂是寄生虫的新宿主吗n ceranae．本研究通过人工接种两种蜜蜂来模拟寄生虫从原生宿主向新宿主的传播n ceranae孢子。首先，从原生宿主中纯化寄生虫孢子，答:cerana．然后，将纯化后的孢子分别接种新宿主和原生宿主，通过感染获得产生的孢子(图1一个)．总的来说，我们收集并分析了三种来源的寄生虫孢子，包括从原生宿主中分离出的亲本孢子(F0)、在原生宿主中感染产生的孢子(F1_native)和在新宿主中产生的孢子(F1_novel)。此外，在两个宿主中的寄生虫基因表达(RNA-seq)从1到5 dpi被量化，这涵盖了一个完整的寄生虫增殖周期。
寄生虫隔离，接种和样本收集
为了收获足够数量的孢子，从4个采集地随机采集了200只蜜蜂答:cerana严重感染的菌落n ceranae在实验蜂房里。将蜜蜂的中肠解剖并均质分离n ceranae用离心法分离孢子(Fries等，2013)．用Percoll梯度离心进一步纯化孢子n ceranae均被物种特异性引物采用常规PCR方法证实(Chen等，2013；Fries等，2013)．聚集的孢子代表了当地寄生虫的多样性，并作为一种常见的接种来源。
从本地的蜂群中移除了有新孵化的巢框(答:cerana)和新宿主(蜜蜂)，置于培养箱(34±1℃，相对湿度60%)中。对于每一种蜜蜂，150只新出的工蜂被单独喂食2µl含有105n ceranae从原生寄主中分离出来的孢子。另外150只新出现的原生和新型宿主工蜂饲喂2 μ l蔗糖溶液作为未感染对照。在实验过程中，队列被分为三个杯子，每个杯子装有50只蜜蜂，并保持在50%的蔗糖溶液中随意在孵化器里。死亡的蜜蜂被记录下来并每天清除。每隔24小时从每个杯子中采集3只蜜蜂，dpi从1到5dpi不等。中肠解剖，用TriZol提取RNA，用Illumina Hiseq 2000测序。在14 dpi时，采集剩下的蜜蜂进行孢子计数。用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)收集同一物种的孢子进行DNA提取(Chen等，2013)，也使用Illumina Hiseq 2000进行测序。每个处理进行3个重复。
基因表达与SNV分析
为了进行遗传多样性分析，分别对F0孢子、F1_native孢子(F1_native_1、F1_native_2和F1_native_3)和F1_novel孢子(F1_novel_1、F1_novel_2和F1_novel_3)的DNA文库进行测序。DNA测序结果与n ceranae基因组(Ncer 3.0, GCA_004919615.1)使用默认参数的BWA (Li和Durbin, 2009；Huang等，2021)．使用Picard-GATK-SNPEFF管道识别和注释snv (Van der Auwera等人，2013)．在F0孢子中发现而在F1孢子中没有发现的SNVs被定义为丢失的SNVs。在F1孢子中发现而在F0孢子中没有发现的snv被定义为新snv。在F0和F1孢子中发现的snv被定义为维持snv。对于RNA-seq分析，每天对未感染的原生宿主的3个RNA文库、未感染的新宿主的3个RNA文库、感染的原生宿主的3个RNA文库和感染的新宿主的3个RNA文库进行测序，时间为1至5 dpi。RNA读数与寄生虫(n ceranae， Ncer 3.0, GCA_004919615.1)，本机主机(蜜蜂答:ceranae， HAv3.1, GCA_003254395.2)，以及新宿主(蜜蜂蜜蜂， ApisCC1.0, GCA_002290385.1)与Hisat2默认参数(Kim et al.， 2015；刁等，2018；Wallberg等人，2019年)．利用3个重复的方差计算组内方差，以确定显著调控基因，使用EdgeR (罗宾逊等，2010年)．将显著调控基因的蛋白序列输入NCBI非冗余数据库和KEGG，以推断其生物学功能和通路(Kanehisa和Goto, 2000年)．使用EggNOG-mapper检索GO项，使用TopGO (Alexa和Rahnenfuhrer, 2021年；Cantalapiedra等人，2021)．共测序分析了7个DNA文库和60个RNA文库。
群体遗传分析与统计
沃特森的θ，基因组多样性π，并纠正了日本田岛的维数值由population (Kofler等人，2011a)．固定指数F圣计算方法为Popoolation2 (Kofler et al.， 2011b)．生存率分析采用SPSS Kaplan-Meier程序，FDR调整采用R (R核心团队，2013年)．采用Kruskal Wallis试验，采用R (R核心团队，2013年)．用配对t检验比较上调和下调基因与R (R核心团队，2013年)．在接种常见亲本孢子以收获产生的孢子时，使用一个样本t检验比较亲本孢子和产生的孢子中的snv数量，使用R (R核心团队，2013年)．
数据可用性声明
本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/PRJNA784016;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA820988。
作者的贡献
XW进行实验。QH设计了这个实验。XW, JE, YC, QH整理稿件。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
资金
本研究由江西农业大学项目(050014/923230722)和国家自然科学基金项目(32060778)资助。
致谢
感谢张丽珍博士的技术支持和Nancy Moran教授对稿件的修改。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
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关键词:微孢子虫，蜜蜂，多寄主寄生虫，选择，等位基因频率
引用:魏旭，陈勇，黄强(2022)肠道寄生虫的外溢效应和基因组选择微孢子虫在蜜蜂种类之间。前面。细胞。感染。Microbiol。12:1026154。doi: 10.3389 / fcimb.2022.1026154
收到:2022年8月23日;接受:2022年9月26日;
发表:2022年10月11日。
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