Hst3p抑制作用gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba: H3K56全基因组乙酰化分析gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

多态真菌gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba是人类主要的机会性真菌病原体(gydF4y2BaLohse等人，2018gydF4y2Ba）;它在医学上的重要性使它成为研究真菌病理和二形真菌潜在生物学的合适实验模型(gydF4y2BaKabir等人，2012年gydF4y2Ba)．致病线索gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba主要是环境的变化，例如免疫系统受损、抗生素治疗后微生物菌群的改变，或医疗器械植入和器官移植(gydF4y2Ba拉莫斯等人，2018年gydF4y2Ba)．的能力gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在恶劣的环境中生存和繁殖(gydF4y2BaMayer et al.， 2013gydF4y2Ba)，再加上从酵母菌形态向灯丝形态的动态转变，是最明显的毒性决定因素，而不是其静态形态、酵母菌或菌丝本身(gydF4y2BaSudbery等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba卡,2016gydF4y2Ba)．因此，这种动态形态背后的转录调控与控制直接相关gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba毒性。与所有真核生物一样，转录抑制和激活都直接受到染色质结构的影响，染色质结构的动态变化主要取决于翻译后组蛋白修饰(gydF4y2BaFallah等，2021年gydF4y2Ba)．事实上，许多研究表明，染色质结构修饰剂的表观遗传调控，以及信号通路中已知的转录因子，可能与形态表型转变有关(gydF4y2Ba克拉尔等人，2001gydF4y2Ba；gydF4y2Ba西蒙蒂等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba扎基等人，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRai等人，2018gydF4y2Ba)．其中，酵母向菌丝的转变、白不透明转换、形成生物膜的能力以及对药物压力的适应是该真菌有趣而重要的致病机制，翻译后组蛋白修饰在其调控中起着突出作用(gydF4y2BaHnisz等人，2009年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba李等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaKim et al.， 2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaGarnaud等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaQasim等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在各种染色质修饰中，组蛋白乙酰化-去乙酰化起主导作用，它调节致病过程并促进gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba毒性(gydF4y2Ba西蒙蒂等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba扎基等人，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2BaGarnaud等人，2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在美国，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)被分为三类:一类是锌依赖的HDACs和一类是NAD的HDACs，即sirtuin家族gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba依赖(gydF4y2BaSu等，2020gydF4y2Ba)．最近的研究表明，sirtuins可能参与感知环境变化引发的形态转变(gydF4y2Ba赵和Rusche, 2021年gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba，有五个sirtuin编码基因(gydF4y2BaSIR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaHST1gydF4y2Ba，gydF4y2BaHST2gydF4y2Ba，gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba，和orf19.2963)gydF4y2Ba智人SIRT5gydF4y2Ba．Sir2p和Hst1p是由一个古老的基因复制而产生的同源同源，而Hst2p在进化上更有分歧(gydF4y2Ba鲁伯特等人，2016年gydF4y2Ba)．但是，它们的作用和定位却各不相同gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba由于Sir2p定位于核仁，Hst1p定位于细胞核，Hst2p定位于细胞质(gydF4y2Ba赵和Rusche, 2021年gydF4y2Ba)．特别是，Set3复合物(Set3C)的组成部分Hst1p被认为可能通过减弱cAMP/PKA信号通路来抑制酵母到灯丝的转变，同时促进白色到不透明的转换(gydF4y2BaSu等，2020gydF4y2Ba)．另一方面，菌丝特异性基因的表达减少gydF4y2BaHWP1, ALS3gydF4y2Ba,gydF4y2BaECE1gydF4y2Ba在sir2Δ/Δ突变体(gydF4y2Ba赵和Rusche, 2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba， NADgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-依赖组蛋白去乙酰化酶(sirtuin) Hst3p负责去除H3组蛋白Lys 56的乙酰基，这种乙酰基在酵母中特别丰富;它标记新合成的组蛋白，促进其沉积到染色质和染色质段与高核小体周转。这种翻译后修饰在酵母中很重要，因为它调节DNA损伤反应，并有助于真菌基因组的完整性(gydF4y2BaCelic等人，2006年gydF4y2Ba；gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba， H3K56乙酰化/去乙酰化平衡由乙酰转移酶(HAT) Rtt109p和Hst3p去乙酰化酶调控，由gydF4y2BaRTT109gydF4y2Ba而且gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba基因，分别(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

之前的研究强调gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba缺失是致命的gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba（gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)，表明这是这种真菌的一个必需基因。此外,gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba条件突变体在小鼠模型中显示毒性减弱;而且，减少了拷贝的数量gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba，或通过烟酰胺(NAM)处理抑制Hst3p，促进白色到不透明的转换，从而增加不透明表型(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba史蒂文森和刘，2011gydF4y2Ba；gydF4y2Ba史蒂文森和刘，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaGuan和Liu, 2015gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与耐抗生素细菌一样，对主要抗真菌药物(包括多烯类、唑类、棘白菌素和5-氟胞嘧啶)耐药的真菌菌株的出现正成为全球公共卫生的严重威胁。此外，现有的治疗分子缺乏特异性和选择性，导致多种副作用。鉴于组蛋白乙酰化/去乙酰化平衡中的核心作用gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2BaHATs和HDACs为开发新的抗真菌药物提供了很有前景的靶点。gydF4y2Ba

调控H3K56ac水平的真菌酶与人类酶显著不同;事实上，真菌Hst家族成员共享人类sirtuins中所没有的序列基序(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)．此外，与人类细胞中参与H3K56脱乙酰的sirtuins Sirt1和Sirt2不同，Hst3p具有很高的底物特异性(gydF4y2BaCelic等人，2006年gydF4y2Ba)．基于这一证据，Hst3p为开发新的抗真菌药物提供了一个独特而有趣的靶点。gydF4y2Ba

尽管近年来一直在努力，但Hst3p和H3K56乙酰化动力学所起的作用仅被部分了解。因此，在本研究中，使用非特异性sirtuin抑制剂NAM, NAD的产物gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba我们评估了Hst3p抑制对其底物H3K56在酵母生长过程中乙酰化水平的影响，以及对其形态和转录谱的影响gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba．此外，通过染色质免疫沉淀和测序(ChIP-seq)分析，我们首次提供了H3K56ac的全基因组图谱，并鉴定了一些与毒力相关的基因，这些基因的转录直接或间接受到Hst3p的调控。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

化学物质gydF4y2Ba

NAM被Sigma-Aldrich(米兰，意大利)收购。在所有实验中，以2 M NAM在超纯蒸馏水中作为原液，并添加到培养中以获得所需的浓度。Sirtinol, SirReal2和Inauhzin购自Selleckchem (Planegg, Germany)，溶解于二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)。gydF4y2Ba

真菌菌株和生长条件gydF4y2Ba

白念珠菌gydF4y2Ba野生型菌株SC5314 (ATCC-MYA-2876)常规培养于YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)琼脂平板上，并在YPD液体培养基中在25°C, 200 rpm下培养过夜。根据实验条件，gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在合成的YNB培养基(0.17% Difco酵母氮基，不含氨基酸和硫酸铵)中生长，添加2%葡萄糖和0.5%硫酸铵;M199培养基含有Earle’s盐和谷氨酰胺(Sigma-Aldrich，米兰，意大利)，pH值7.5用25 mM HEPES缓冲;10%胎牛血清(Euroclone, Pero，意大利);RPMI 1640培养基含有l -谷氨酰胺(Euroclone, Pero，意大利)，Spider培养基(2%甘露醇，2%营养肉汤，0.4%钾gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， pH调整为7.2与NaOH)。根据实验需要，每种培养基中添加10或25 mM NAM。在热压前，在液体肉汤中加入2%的琼脂制备固体培养基。在波长为600 nm (OD)时，测量每种培养物的光密度(OD)gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba)．进行三个独立的生物重复。gydF4y2Ba

NAM, Inauhzin, Sirtinol和SirReal2治疗gydF4y2Ba

将出芽酵母培养物在6孔板中稀释至密度为10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/ml 2 ml YPD与10 mM NAM (CaNAM)， 50 μ M Inauhzin, 10 μ M Sirtinol或50 μ M SirReal2。gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba仅用载体(DMSO)处理的细胞作为对照(CTRL)。培养皿在30°C下孵育28小时，细胞分化后进行Time Lapse成像(Leica DMI6000 T, bucininasco, Italy)。gydF4y2Ba

总共5 × 10gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba细胞通过离心(4,700gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃，10 min)，用蒸馏水清洗，-80℃保存，用于后续组蛋白提取。进行三个独立的生物重复。gydF4y2Ba

假丝酵母gydF4y2Ba生长曲线gydF4y2Ba

周末酵母细胞培养稀释至10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba细胞/mL在50 mL YPD培养基中，在25°C下生长过夜。随后，用出芽酵母培养物接种700ml YPD(含和不含10mm NAM)，细胞密度为2x10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba/毫升。处理过的(CaNAM)和未处理的酵母细胞(CTRL)在25°C下摇眶(200 rpm)培养50小时，然后通过测量OD来生长gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba．在选定的时间点(0、2、4、6、8、10和28小时)，5 × 10的颗粒gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba细胞通过离心(4700gydF4y2BaggydF4y2Ba4℃，10 min)，用蒸馏水清洗，-80℃保存，用于后续组蛋白提取。gydF4y2Ba

酵母、芽管和菌丝生长过程中H3K56乙酰化水平gydF4y2Ba

白念珠菌gydF4y2Ba在25°C的YNB中生长过夜，通过离心收集(2000gydF4y2BaggydF4y2Ba(25℃下10 min)，用0.15 M NaCl洗涤，在0.15 M NaCl中重悬，25℃下孵育24 h诱导饥饿。随后,10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba酵母/mL在RPMI 1640中分别在25、30或37℃下接种6小时，使细胞形态仅受生长温度的调节，特别是在25℃时获得酵母细胞，在30℃时获得芽管，在37℃时获得真菌丝。gydF4y2Ba

细胞通过离心(4700gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C, 10 min)，用蒸馏水清洗，-80°C保存，用于后续组蛋白提取。进行三个独立的生物重复。gydF4y2Ba

假丝酵母gydF4y2Ba组蛋白提取gydF4y2Ba

白念珠菌gydF4y2Ba球团首先在10mm EDTA, 10mm Tris-HCl pH 7.4, 5mm丁酸钠，5mm NAM, 2.5% 2-巯基乙醇和10%甘油中重新悬浮。细胞悬浮液在液氮中用研钵和研杵研磨成细粉。为了提高裂解效率，将粉末在10mm EDTA、10mm Tris-HCl pH 7.4、5mm丁酸钠、5mm NAM、2.5% 2-巯基乙醇、1% SDS和2% Triton-X 100中重悬，并加入酸洗玻璃珠。进行了两次或两次以上的冻结和涡旋循环。悬浮液在12000度离心gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C静置15 min，收集上清液。gydF4y2Ba

通过添加0.4 N H从总裂解物中提取酸溶蛋白gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba然后在4°C温和反转下孵育3小时。用25% TCA(三氯乙酸，Sigma-Aldrich，米兰，意大利)在4℃下进行组蛋白酸沉淀过夜。在用冰冷的丙酮洗涤两步后，沉淀的蛋白质在milliq H中重新悬浮gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用SDS-PAGE(15%聚丙烯酰胺凝胶)解析组蛋白，用Coomassie G-250 Brilliant Blue (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)染色凝胶，并在水中染色。gydF4y2Ba

对于Western印迹，每个组蛋白样品0.5 μg在SDS-PAGE上分离，并使用Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Segrate, Italy)转移到硝化纤维膜上。gydF4y2Ba

使用以下一抗进行检测:H3 (Abcam, ab1791，剑桥，英国)和H3K56ac (Active Motif，滑铁卢，比利时)。条带密度由LAS 4000 (GE Healthcare, Life Sciences)数字成像系统进行可视化，并使用ImageJ分析软件进行量化。gydF4y2Ba

纳米LC-MS/MS分析H3K56acgydF4y2Ba

从考马斯染色凝胶中切下组蛋白H3凝胶带，用胰蛋白酶反应gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba消化，如舍甫琴科等人所描述的。gydF4y2Ba舍甫琴科等，2006年gydF4y2Ba)．纳米esi - lc -MS/MS分析前，将提取的多肽溶于10%甲酸中。多肽由纳米Acquity LC系统(Waters Corp.曼彻斯特，英国)分离，配备BEH C-18 1.7 μ m, 75 μ m x 250 mm (Waters Corp.曼彻斯特，英国)色谱柱，连接LTQ-Orbitrap混合质谱仪(Thermo Scientific)。每个样品取5 μL上柱，流速为280 nL/min，缓冲液B线性梯度为15% ~ 40%(缓冲液a: 95% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 5% acn, 0.1% aa;缓冲液B: 95% ACN, 5% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.1% AA) 55分钟。采用选择反应监测(SRM)方法在LTQ-Orbitrap质谱仪上对H3 tryptic多肽进行了纳米esi - lc -MS/MS分析。gydF4y2Ba

目标乙酰化肽(FQK(ac)STELLIR)的数量通过监测其双电荷离子(m/z 638.82)和产生两个离子(831.54和1001.61)的碎片来定量。使用未修饰的H3肽YKPGTVALR对每个凝胶带中的H3数量进行归一化，监测其在m/z 502.86处的双电荷离子和在m/z 616.38和713.50处产生两个离子的碎片。gydF4y2Ba

固体琼脂培养基的形态分析gydF4y2Ba

为了评估NAM治疗引起的形态学改变，gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba将25°C在YNB中生长的酵母稀释至2 x 10的细胞密度gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba在含或不含25mm NAM的固体培养基上分别取5 μL稀释液。其中YPD琼脂板在25℃孵育，10% FBS、M199和Spider培养基在37℃孵育进行菌丝生长诱导。培养72小时后，使用AMG Evos成像系统(Thermo Fischer Scientific, Monza, Italy)在10倍放大的显微镜下检查菌落形态。gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀反应gydF4y2Ba

以细胞密度为10稀释出芽酵母细胞培养物gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba细胞/mL，分布在90mm直径的培养皿中(每个10ml)，在25°C下与或不含10mm NAM孵育28小时。之后,gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba培养物与1%甲醛交联15分钟，室温下，轻轻摇晃。加入125 mM甘氨酸淬灭反应，在室温下轻轻摇动孵育5分钟。染色质免疫沉淀(ChIP)如前所述进行(gydF4y2BaMawer等人，2021年gydF4y2Ba)，除了使用低温冷冻磨机(SPEX SamplePrep 6970EFM冷冻/磨机，München，德国)进行细胞裂解。ChIP-seq文库由H3K56ac的两个独立生物重复生成，并按照先前发表的协议(gydF4y2Ba福特等人，2014年gydF4y2Ba)，在Illumina NextSeq 500上用2 × 75 bp reads进行测序。对对照细胞(CTRL)或对照组细胞进行两次独立的生物重复gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba用10mmnam (CaNAM)处理。gydF4y2Ba

总RNA提取gydF4y2Ba

如上所述，gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在直径为90毫米的培养皿中，加入或不加入10毫米的NAM，培养物在25°C下培养。对CTRL或CaNAM细胞分别进行3次独立的生物学重复。28 h孵育后，共10gydF4y2Ba^9gydF4y2Ba收集酵母细胞(8000 g, 4°C下10分钟)，用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理过的水清洗。RNA分离进行描述gydF4y2BaVennapusa等人，2020年gydF4y2Ba做了一些修改。简单地说，酵母细胞在600 mL RNA提取缓冲液(100 mM Tris- HCl (pH: 8)， 25 mM EDTA, NaCl 2.5 M, 2.5% β-巯基乙醇，2% SDS)中重悬，并使用酸洗玻璃珠用BeadBug微管均质器(Benchmark Scientific, Sigma-Aldrich, Milan, Italy)机械破坏。gydF4y2Ba

总RNA用等体积的酸-苯酚/氯仿分离，pH 4.5, IAA, 25:24:1 (Sigma-Aldrich，米兰，意大利)。离心后，用100%乙醇从水相中析出RNA，用75%乙醇洗涤两次，并用DEPC-water溶解。gydF4y2Ba

RNA定量使用Nanodrop 200 Thermo Fisher Scientific (Monza, Italy)仪器进行。gydF4y2Ba

RNA序列gydF4y2Ba

对于RNA测序，使用TapeStation(安捷伦，Cernusco sul Naviglio，意大利)评估RNA质量，仅使用RIN > 8的RNA进行文库生成。根据制造商说明，使用TruSeq链总RNA样品准备试剂盒(Illumina Inc.， Berlin, Germany)从1µg纯化RNA制备索引文库。在NextSeq 550平台(Illumina Inc.， Berlin, Germany)上对文库进行合并和测序(成对端，2 x 100 bp)。使用专门用于酵母的Ribo-Zero Gold rRNA去除试剂盒(Illumina公司，柏林，德国)去除rRNA。在NextSeq 550平台(Illumina公司，柏林，德国)上对文库进行汇总和测序(成对端，2 x 75循环)。进行三个独立的生物重复。gydF4y2Ba

生物信息学分析gydF4y2Ba

对于RNA测序，生成的原始序列文件(。fastq文件)使用FastQC工具(gydF4y2Bahttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqcgydF4y2Ba)，然后将经过质量检查的成对结束读与引用对齐gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2BaSC5314基因组(装配GCA_000182965.3)使用STAR (version 2.5.2a) (gydF4y2BaDobin et al.， 2013gydF4y2Ba)，并附有标准参数。featutelling演算法(gydF4y2Ba廖等，2014gydF4y2Ba)被用来量化每个转录本，使用映射到基因组的读数。当在3个重复中检测到至少10个总reads时，就认为某个给定基因表达了。数据归一化和差异表达转录本使用DESeq2 (gydF4y2Ba《爱等人》，2014gydF4y2Ba)，采用标准参数;差异表达报告为折叠变化。FDR≤0.05 (False Discovery Rate)、Fold Change≤-1.5(下调基因)或Fold Change≥1.5(上调基因)的基因被认为存在显著差异表达。gydF4y2Ba

对于chip测序，使用Galaxy工具进行分析(v 22.05) (gydF4y2Bahttps://usegalaxy.eu/gydF4y2Ba） （gydF4y2Ba银河社区，2022gydF4y2Ba)．简单地说，在FastQC质量检查之后，配对的端读数与参考对齐gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2BaSC5314基因组(GCA_000182965.3组装)使用Bowtie 2 (Galaxy Version 2.4.4)，生成的BAM文件使用Filter BAM (-q=20) (Galaxy Version SAMTOOLS: 1.8)进行过滤。映射的读取使用samtools MergeSamFiles (Galaxy Version 2.18.2.1)进行索引和合并，并使用deepTools bamCoverage (Galaxy Version 3.5.1.0.0)将bin大小为10并归一化为基因组内容转换为bigwig文件。使用MACS2 callpeak (Galaxy Version 2.2.7)对板区使用标准参数进行峰值调用，并归一化为有效基因组大小。Peak标注使用ChIPseeker (Galaxy Version 1.28.3)进行。gydF4y2Ba

在ChIP-seq和RNA-seq分析中，PCR重复项均被排除。使用ClueGo和CluePedia Cytoscape插件(3.9.1版本)进行网络分析(gydF4y2BaBindea等人，2009年gydF4y2Ba)．维恩图由InteractiVenn (gydF4y2BaHeberle等人，2015gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据来自至少三个独立的实验，结果以均数±标准差表示。数据采用GraphPad Prism 7 (GraphPad Software)进行分析。酌情采用双侧学生t检验(2组比较)或双侧方差分析(>2组比较)。P值< 0.05为显著。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

NAM处理导致乙酰化H3K56的积累gydF4y2Ba

确定NAM能诱导H3K56ac积累而不影响H3K56ac的最低浓度gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba在28 h内，不同浓度的NAM (5-100 mM)进行了测试(数据未显示)。如gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba， 10 mM NAM对真菌复制没有显著影响，更重要的是导致H3K56乙酰化水平的大量积累(gydF4y2Ba图1罪犯gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba从处理和未处理的细胞中选择时间点(0、2、4、6、8、10和28 h)制备核蛋白片段，通过纳米液相色谱-串联质谱(纳米esi - lc -MS/MS)测定H3K56的乙酰化水平。FQK(Ac)STELLIR是一种含有乙酰化赖氨酸的组蛋白tryptic peptide，采用归一化色谱峰面积法对其进行定量gydF4y2Ba与gydF4y2BaYKPGTVALR, H3组蛋白的另一种胰蛋白酶肽，不显示翻译后修饰。纳米esi - lc -MS/MS分析显示，接种4 h后H3K56乙酰化达到最大峰值，而未处理的对照组细胞随时间推移乙酰化下降。相反，在NAM处理后，H3K56的乙酰化水平在生长过程中增加并积累，在24小时内达到平稳期(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)．这些结果首次描述了H3K56在反应过程中如何乙酰化gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba并证实NAM对真菌sirtuin Hst3p的抑制作用。从H3K56ac中分离的组蛋白也通过Western blotting证实了其nam依赖的积累gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba28小时孵育后(gydF4y2Ba图1C、DgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Hst3p抑制改变gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba形态gydF4y2Ba

作为一种二态真菌，gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba可以可逆地从酵母形态切换到拉长的菌丝形式，在基因表达谱的广泛变化为特征的精细调控过程中响应环境刺激。gydF4y2Ba

鉴于染色质景观在真核生物转录激活/抑制中的核心作用，并考虑到H3K56乙酰化是真核生物中最丰富的翻译后修饰gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba，我们想知道这种组蛋白修饰是否可能参与调控菌丝特异性基因(HSG)。为此，我们对其菌落形态进行了分析gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba这是由于Hst3p的抑制。gydF4y2Ba

在25 mM NAM存在或不存在的情况下，用10%血清、M199或Spider培养基在37℃诱导成丝。正如在gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba， 25 mM NAM导致了的显著变化gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在固体培养基上，对大菌落周围的丝状和菌丝冠的形成有很强的抑制作用。此外，根据Wurtele及其同事(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)，当Hst3p在酵母促进条件下(25°C的YPD)被抑制时，我们观察到形成异常和扩大的丝状结构，其中有一种特殊的结构称为v型菌丝(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

这种形态改变支持了H3K56ac可能参与了酵母到菌丝的转变的假设。然而，Western blotting分析分别从酵母、芽管和菌丝形状中分离的组蛋白显示，H3K56的整体乙酰化水平在三种细胞形式中是相当的(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Sirtinol、SirReal2和Inauzhin均不抑制Hst3pgydF4y2Ba

作为NAD的一员gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNAM以非特异性和非选择性的方式抑制组蛋白脱乙酰酶家族的Hst3p。为了验证商业上可用的sirtuin抑制剂是否影响Hst3p活性，我们测试了Sirtinol, SirReal2和Inauhzin，它们是特定的SIRT1和SIRT2抑制剂。详细地说，来自过夜培养的酵母细胞接种在含有10µM Sirtinol、50µM SirReal2或50µM Inauhzin(抑制剂完全可溶的最高浓度)的YPD中，或与10 mM NAM(这里用作对照)。利用延时成像技术跟踪酵母生长24小时。使用的任何抑制剂均未观察到形态学改变，而使用NAM处理的细胞如预期的那样形成了v型分支的菌丝(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，对从夜间处理中提取的组蛋白进行Western blotting证实，Sirtinol、SirReal2和Inauhzin没有诱导H3K56ac的显著积累，而NAM则通过较高水平的乙酰化H3K56 (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

H3K56ac全基因组分析gydF4y2Ba

ChIP-seq是分析和绘制表观遗传标记的强大工具。为了识别H3K56ac的模式gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba用抗h3k56ac抗体在25°C YPD中孵育28小时后，用ChIP-seq分析基因组、对照和nami处理的v型细胞。在gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba显示H3K56ac主要定位于基因TSS的基因组区域。我们在CTRL和CaNAM中分别鉴定出671和843个chip - enrichment regions (gydF4y2Ba补充数据集1gydF4y2Ba） （gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．由于组蛋白乙酰化主要与开放染色质和随之而来的转录激活相关，我们将重点放在chip富集的启动子区域(上游TSS 2 kb)。其中，283个富集区域在两种实验条件下都有，主要分布在代谢过程、转录和翻译控制必需基因的启动子(即转录启动子、核糖体蛋白、翻译伸长因子)(gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)．仅在NAM处理后，这种组蛋白修饰富集的区域为447个，这表明在这些区域，对照细胞中的H3K56可能被Hst3p去乙酰化(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了更好地理解差异乙酰化区域的生物学意义，我们使用ClueGo和CluePedia Cytoscape插件进行了功能分析，该插件集成了基因本体(GO)术语，创建了一个功能组织的GO术语网络，我们发现8个GO生物过程显著富集(Bonferroni调整pValue≤0.05)。这些差异乙酰化区域包括参与丝状、表型切换和粘附的基因启动子，这将解释CaNAM中观察到的异常v型形态(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)．其中，我们发现了几个参与形态过程的转录因子:gydF4y2BaOFI1gydF4y2Ba，参与调节白不透明开关和丝状生长(gydF4y2BaDu等，2015gydF4y2Ba）;gydF4y2BaWAL1gydF4y2Ba，参与极性菌丝生长(gydF4y2Ba瓦尔特和温德兰，2004年gydF4y2Ba）;gydF4y2BaEFG1gydF4y2Ba，是形态发生和生物膜的中心转录调节因子(gydF4y2Ba装玻璃的,2022gydF4y2Ba）;gydF4y2BaNRG1gydF4y2Ba，一种调节菌丝基因和毒力的转录因子/抑制因子(gydF4y2BaBraun等人，2001年gydF4y2Ba）;gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba，可调节形态建成、黏附和毒性(gydF4y2Ba凯利等人，2004年gydF4y2Ba）;gydF4y2BaWOR1gydF4y2Ba，是白不透明表型转换的主要调节因子(gydF4y2BaHuang等，2006gydF4y2Ba)，gydF4y2BaWOR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR3gydF4y2Ba而且gydF4y2BaWOR4gydF4y2Ba加上gydF4y2BaWOR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaCZF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaEFG1gydF4y2Ba,gydF4y2BaAHR1gydF4y2Ba，形成转录网络，触发在白色和不透明细胞类型之间切换的能力(gydF4y2BaHernday等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaLohse和Johnson, 2016gydF4y2Ba)．此外，我们还发现了参与粘附和生物膜形成的基因，如gydF4y2BaHWP1gydF4y2Ba，一种菌丝特异性的细胞表面蛋白，是生物膜形成所必需的gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba（gydF4y2Ba诺比莱等人，2006gydF4y2Ba),gydF4y2BaHWP2gydF4y2Ba，是生物膜形成、黏附、丝状生长所需的gpi锚定蛋白(gydF4y2Ba哈耶克等人，2010年gydF4y2Ba)，即转录因子gydF4y2BaCRZ2gydF4y2Ba，在ph值诱导下形成纤维(gydF4y2BaKullas等人，2007年gydF4y2Ba)，即黏着素gydF4y2BaALS3gydF4y2Ba，是一种模拟宿主细胞钙粘附素的真菌入侵素，通过与内皮细胞上的n -钙粘附素和口腔上皮细胞上的e -钙粘附素结合，诱导内吞作用(gydF4y2BaPhan等人，2007年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

整合和加强ChIP-seq数据，并更好地了解H3K56乙酰化水平如何影响gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba转录组和v型菌丝发育，我们对CaNAM进行了RNA测序gydF4y2Bavs。gydF4y2BaCTRL细胞。我们发现1330上调(FC≥1.5;FDR≤0.05)、1081下调(FC≤-1.5;与CTRL细胞相比，CaNAM细胞中FDR≤0.05的转录本(gydF4y2Ba补充图S3和4gydF4y2Ba)．基因本体论分析显示，与v型形态一致，上调的基因主要与白不透明、丝状、细胞壁组织和粘附有关(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

将RNA测序数据与经过nam处理的447个chip富集区域相交叉，我们发现87个基因的上调与与其启动子相关的H3K56乙酰化模式直接相关，包括gydF4y2BaOFI1gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaHWP1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNRG1gydF4y2Ba，gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCRZ2gydF4y2Ba，即分泌天冬氨酸蛋白酶gydF4y2BaSAP1gydF4y2Ba而且gydF4y2BaSAP2gydF4y2Ba，除了已知的一些gpi锚定的粘连蛋白样蛋白参与粘连和毒性(gydF4y2Ba补充数据集2gydF4y2Ba)．出乎意料的是，85个启动子仅在NAM抑制下显示H3K56乙酰化的基因子集显示了相反的趋势，与CTRL相比，CaNAM的乙酰化程度更高，但转录丰度更低，这表明H3K56乙酰化并不总是伴随着更高的转录率。这可以解释为，在所有真核生物中，广泛的机制有助于转录控制(包括mRNA稳定性控制、Pol II终止和Pol II衰减)，这与Topal及其同事进行的NET-seq分析一致(gydF4y2BaTopal等人，2019年gydF4y2Ba)．他们表明，除了在增强转录起始过程中起主导作用外，H3K56ac可能通过促进核小体的组装而瞬时发挥转录抑制因子的作用gydF4y2Ba酿酒酵母gydF4y2Ba．此外，我们的ChIP-seq分析显示，Hst3p还通过编码RNA聚合酶II中介复合物亚基MED1、RNA聚合酶II调节因子EED1的基因启动子调控H3K56ac，以及其他预测的核糖核酸酶或推测的蛋白质，在mRNA 3 ' -end加工、mRNA多聚腺苷化和mRNA前裂解中发挥预测作用。gydF4y2Ba

这些结果提示H3K56ac可能在调控转录控制的微调机制中发挥作用。gydF4y2Ba

除了87个表达似乎与H3K56ac及其启动子直接相关的基因外，我们的转录组分析显示，有一部分基因的表达受到该组蛋白标记的间接调控。例如，我们的ChIP-seq揭示了Hst3p抑制导致H3K56乙酰化与的启动子相关gydF4y2BaEFG1gydF4y2BaEfg1是几种形态发生和毒力相关基因的关键转录调控因子，其转录不仅受到Efg1的负自调控，还受到Wor1、Wor2和Czf1建立的一系列正反馈环路的抑制(gydF4y2BaHernday等人，2013gydF4y2Ba)．此外,gydF4y2BaECE1gydF4y2Ba，编码细胞溶解肽念珠菌素，和gydF4y2BaUME6gydF4y2Ba作为丝状特异性转录调控因子，NAM处理后RNA-seq上调，直接被gydF4y2BaEFG1gydF4y2Ba（gydF4y2Ba班纳吉等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba莫耶斯等人，2016年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

我们的研究结果揭示了H3K56ac介导的基因调控背后的复杂机制，强调了这种组蛋白标记在控制人体多种生物过程中的重要性gydF4y2Ba白念珠菌。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

医院感染引起的gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba由于出现了对主要抗真菌药物耐药的真菌菌株，引起了人们的极大关注。特别是,gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba是在成人和儿童人群中引起疾病的最普遍的物种，在免疫功能低下的宿主中，30天死亡率接近40% (gydF4y2Ba克勒等人，2019年gydF4y2Ba)．真菌和人类细胞之间的相似性限制了在不损害宿主的情况下唯一影响微生物细胞的特定靶点的识别，进一步减少了治疗真菌感染的治疗方案(gydF4y2Ba萨拉查等人，2020年gydF4y2Ba)．此外，对唑类、棘白素类或多烯类药物的内在耐药性(gydF4y2BaNami等人，2019年gydF4y2Ba)gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba，这就进一步需要开发具有新颖机制的抗真菌药物用于医疗实践(gydF4y2BaCaruso等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba，最丰富的翻译后修饰是H3K56乙酰化，由组蛋白乙酰转移酶Rtt109p和组蛋白去乙酰化酶Hst3p调控。组蛋白乙酰化/去乙酰化平衡在其中起着关键作用gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba生长及毒力(gydF4y2BaSu等，2020gydF4y2Ba)．有趣的是，Hst3p显示了与人类sirtuins不同的序列基序(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba）;因此，该组蛋白脱乙酰酶为开发新的抗真菌药物提供了一个很有前景的治疗靶点。几种已知的HDAC抑制剂已经被探索为新的潜在抗真菌疗法，但这些分子的选择性仍然是主要问题(gydF4y2BaSu等，2020gydF4y2Ba)．事实上，我们测试了目前可用的三种sirtuin抑制剂(Inauhzin, Sirtinol和SirReal2)，但没有一种对Hst3p显示出活性，因为它们没有引起Hst3p的形态学改变gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba或H3K56ac大量积累。gydF4y2Ba

因此，我们将NAM作为一种非特异性sirtuin抑制剂，以探索H3K56ac在H3K56ac积累中的作用gydF4y2Ba白色念珠菌gydF4y2Ba．首先，我们研究了H3K56乙酰化水平的变化趋势gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba酵母生长曲线。特别地，通过纳米esi - lc -MS/MS，我们观察到H3K56乙酰化在对数相开始时达到最大值，然后下降，这与H3K56ac标记新合成的组蛋白，促进其沉积在染色质上的观察一致。相反，当Hst3p在酵母生长过程中被NAM抑制时，我们观察到H3K56乙酰化随着时间的推移而积累，在24小时达到平台期。此外，Hst3p抑制导致异常表型;特别是，当gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba在菌丝诱导的条件下生长，有大量的丝状减少。相反，正如之前Wurtele和同事所观察到的(gydF4y2BaWurtele等人，2010gydF4y2Ba)，当Hst3p在酵母促进条件下被抑制时，gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba形成一种称为v型菌丝的异常表型。然而，我们观察到H3K56的整体乙酰化水平在酵母、胚管和菌丝之间没有显著变化，这表明这种组蛋白修饰，削弱了核小体之间的相互作用，并导致转录染色质松弛(gydF4y2BaWang和Hayes, 2008gydF4y2Ba)，是所有形态发生阶段所必需的gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

由于v型菌丝是一种与H3K56ac水平增加相关的特殊形态，我们使用这些细胞作为模型来识别Hst3p靶点。虽然H3K56乙酰化在gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba，我们的ChIP-seq分析揭示了与TSS相关的基因的强烈富集gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Basp致病性和形态。值得注意的是，我们鉴定出仅在NAM处理后ChIP富集的447个区域，包括编码HSG、粘附蛋白、降解酶和白不透明开关的基因，如gydF4y2BaOFI1gydF4y2Ba，gydF4y2BaACE2gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR1gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR2gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR3gydF4y2Ba，gydF4y2BaWOR4gydF4y2Ba，gydF4y2BaHWP1gydF4y2Ba，gydF4y2BaHWP2, CRZ2gydF4y2Ba，gydF4y2BaALS3。gydF4y2Ba此外，我们的RNA-seq分析显示Hst3p抑制后转录组明显失调，与CTRL相比，CaNAM 28小时内有1330个转录本上调，1081个转录本下调。基因本体论分析证实，在上调的转录本中，主要与丝化、细胞壁组织、黏附相关的基因可能是H3K56通过乙酰化状态调控这些过程。gydF4y2Ba

有趣的是，我们发现了87个基因，它们的转录增加与启动子上H3K56乙酰化的富集密切相关，包括一些著名的表型切换和毒性调节因子。例如，锌指转录因子gydF4y2BaOFI1gydF4y2Ba，其过表达在几种培养条件下促进丝状生长(gydF4y2BaDu等，2015gydF4y2Ba),gydF4y2BaWAL1gydF4y2Ba，皮质肌动蛋白细胞骨架的组织和极化菌丝生长所必需的(Walther和Wend land, 2004)。gydF4y2Ba

此外，我们的ChIP-seq揭示了H3K56ac的启动子模式的存在gydF4y2BaEFG1gydF4y2BaCaNAM组转录本丰度低于CTRL组。这与之前的研究一致，过度表达gydF4y2BaEFG1gydF4y2Ba促进菌丝起始，但此后不久导致依赖Efg1的转录下调(gydF4y2BaTebarth等人，2003年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba拉萨克等人，2011年gydF4y2Ba)．此外,gydF4y2BaEFG1gydF4y2Ba被Wor1直接或间接抑制(gydF4y2BaHernday等人，2013gydF4y2Ba)在NAM治疗时上调。Efg1,gydF4y2Ba通过gydF4y2BacAMP-PKA通路，调节几个参与纤维化的基因的表达，如gydF4y2BaUME6gydF4y2Ba，一种已知的菌丝延伸调节因子，在v型条件下上调(gydF4y2Ba班纳吉等人，2008年gydF4y2Ba)．这些结果可能解释了异常表型，即v型菌丝，观察到gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba在酵母促进条件下暴露于NAM的细胞。gydF4y2Ba

我们意识到使用非特异性抑制剂可能不是最好的治疗方法，但一些迹象表明，本研究中报道的NAM的作用主要是通过抑制Hst3p活性来发挥的。首先,在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba时，H3K56发生脱乙酰反应gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba因此，NAM处理后H3K56ac的积累可能是由于Hst3p的抑制。此外，在我们的实验条件下，我们使用了不影响NAM的浓度gydF4y2Ba假丝酵母gydF4y2Ba生长，但诱导形成v型菌丝，这与Wurtele和同事在杂合缺失突变体中观察到的表型相同gydF4y2BaHST3gydF4y2Ba．此外，尽管在gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba除了Hst3p，还有其他sirtuins，如Sir2p, Hst1p和Hst2p，gydF4y2Ba赵和Rusche (2021)gydF4y2Ba证明只有缺失的菌丝才能显著减少菌丝的形成gydF4y2BaSIR2gydF4y2Ba但不是gydF4y2BaHST1gydF4y2Ba或gydF4y2BaHST2gydF4y2Ba．此外，菌丝特异性基因的表达gydF4y2BaHWP1gydF4y2Ba，gydF4y2BaALS3gydF4y2Ba,gydF4y2BaECE1gydF4y2Ba显著降低了gydF4y2Basir2gydF4y2Ba与野生型相比，单突变型。相比之下，在我们的实验条件下，这三个基因都上调了，这表明NAM对Hst3p的抑制优于最终对Sir2p的抑制。gydF4y2Ba

总的来说，我们的研究代表了第一个全基因组H3K56乙酰化分析gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba并提供了第一张H3K56ac模式的地图gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba基因组，为未来的研究提供了丰富的资源。然而，H3K56ac直接调控几种毒力相关基因表达的证据指出了这种表观遗传修饰在调控中的相关性gydF4y2Ba白念珠菌gydF4y2Ba这证实了Hst3p是开发新的潜在抗真菌药物的一个有吸引力的靶点。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库的名称和登录号可以在下面找到:ArrayExpress，登录E-MTAB-12193;e - mtab - 12167。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

MC:数据管理、调查、方法学、可视化、生物信息分析、写作-初稿准备、写作-评审和编辑;DE:数据管理、调查、方法论、可视化、写作评论和编辑;MP:调查和方法论;AMP:调查和方法论;MM:方法论与写作回顾与编辑;答:方法;GG:方法论与生物信息学分析;FR:方法论与生物信息学分析;PT:方法论和写作-评论和编辑，AnP:数据策划和调查;AT:概念化、数据管理、调查、验证、写作评审和编辑，以及资金获取; AmP: conceptualization, data curation, investigation, validation, visualization, writing—original draft, writing—review and editing, and funding acquisition. All authors contributed to the article and approved the submitted version.

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了萨莱诺大学内部基金FARB的支持。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fcimb.2022.1031814/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba