对22种候选疫苗的评价揭示了开发对抗钩端螺旋体病通用疫苗的挑战gydF4y2Ba
玛拉·a·c·玛雅gydF4y2Ba
1‡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
埃弗顿·b·贝丁gydF4y2Ba1 __‡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
Liana N. BarbosagydF4y2Ba
1 __‡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
娜塔莎·r·德·奥利维拉gydF4y2Ba
1‡gydF4y2Ba，gydF4y2Ba蒂芙尼·t·邦德gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba安娜·卡罗琳娜·k·佩德拉gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2BaGuilherme A. RosagydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba伊莱亚斯·e·b·达·罗莎gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba塞克萨斯·内托gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
André A.格拉斯曼gydF4y2Ba
2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba
约翰麦克费登gydF4y2Ba
3§gydF4y2Ba，gydF4y2BaOdir A. DellagostingydF4y2Ba1§gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba
艾伦·j·a·麦克布莱德gydF4y2Ba
1、3 *§gydF4y2Ba
- 1gydF4y2Ba巴西南大州佩洛塔斯佩洛塔斯联邦大学技术发展中心生物技术单元gydF4y2Ba
- 2gydF4y2Ba美国康涅狄格州法明顿康涅狄格卫生大学医学系gydF4y2Ba
- 3.gydF4y2Ba联合王国吉尔福德萨里大学健康和医学科学学院生物科学和医学学院gydF4y2Ba
钩端螺旋体病是一种被忽视的人类和动物疾病，每年影响近50万人，造成相当大的经济损失。目前的人类疫苗是灭活的全细胞制剂(菌素)gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba提供强同源保护但不能诱导交叉保护免疫反应的种。每年都需要加强，而且严重的副作用经常被报道，因此只有少数国家批准该疫苗用于人类。新型通用疫苗需要鉴定钩端螺旋体抗原的保守表面暴露表位。外膜β-桶蛋白(βb-OMPs)满足这些要求，并已成功用于其他疾病的疫苗。我们报告了22个包含33个钩体βb-OMPs蛋白片段的构建物的评估，这些构建物之前通过逆向和结构疫苗学以及细胞表面免疫沉淀鉴定。利用I-TASSER预测各钩体βb-OMP的三维结构。使用NetMHCII 2.2和BepiPred 2.0预测表位。含有一个或多个βb-OMPs区域的重组构建物克隆并表达于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．imac纯化的重组蛋白被吸附到氢氧化铝佐剂上以生产疫苗配方。用重组蛋白(50 ~ 125 μg)接种仓鼠(4 ~ 6周龄)2次，间隔14 d。在钩端螺旋体病仓鼠模型中评估免疫保护对同源挑战(10 - 20× EDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba),gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba血清组黄疸出血血清型哥本哈根菌株Fiocruz L1-130。在疫苗配方中，20/22是免疫原性的，并在攻毒前诱导了显著的体液免疫反应(IgG)。四种结构诱导显著保护(100%，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.001)和消毒免疫在两个独立的实验中，然而，这在随后的评估中是不可重复的(0 - 33.3%的保护，gydF4y2BaPgydF4y2Ba> 0.05)。这些挑战性实验和文献中的其他报告缺乏可重复性，加上缺乏免疫相关物和商业上可用的试剂来表征免疫反应，表明仓鼠可能不是评估钩端螺旋体疫苗的理想模型，并强调需要评估替代模型，如小鼠。gydF4y2Ba
简介gydF4y2Ba
钩端螺旋体病是由该属的致病螺旋体引起的gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba在热带及亚热带国家发病率较高(gydF4y2Ba科斯塔等人，2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaPicardeau 2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaBaquero和Machado, 2018gydF4y2Ba)．这种感染是世界上最广泛的细菌性人畜共患病之一，被认为是一个严重的公共卫生问题。人类是病原体的偶然和最终宿主，表现出各种各样的症状，从非特异性发热、寒战、头痛和肌痛到严重的钩端螺旋体病，后者可表现为韦尔氏病或钩端螺旋体病相关肺出血综合征(gydF4y2Ba麦克布莱德等，2005年gydF4y2Ba;gydF4y2BaCroda等人，2010年gydF4y2Ba)．据估计，每年全球发病率约为100万人间病例，但由于该病被忽视的状况，这一数字可能被低估(gydF4y2Ba科斯塔等人，2015gydF4y2Ba)．该病影响家养动物和野生动物，在维持生计和工业化养殖方面造成经济损失(gydF4y2BaAdler和de la Pena Moctezuma, 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba马丁斯和利伦鲍姆，2017年gydF4y2Ba)．预防钩端螺旋体病对于降低发病率和中断传播周期至关重要。gydF4y2Ba
对流行地区的人类和动物种群进行疫苗接种可能是控制该病的最可行策略(gydF4y2Ba阿德勒,2015 bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba科斯塔等人，2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017bgydF4y2Ba;gydF4y2BaVernel-Pauillac and Werts, 2018gydF4y2Ba)．市面上可买到的全细胞灭活疫苗(菌素)在世界各地的牲畜和家畜中经常使用(gydF4y2Ba维尔马等人，2013年gydF4y2Ba)．虽然预防致命感染，这些疫苗引起的免疫反应主要针对钩端螺旋脂多糖，一种t-独立抗原，诱导短期免疫，需要每年加强免疫。此外，由菌素引起的保护仅限于疫苗制剂中包括的血清素。大约64种不同的gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba迄今为止所描述的，其中17种具有潜在传染性，并被分为300多种血清型(gydF4y2BaAdler和de la Pena Moctezuma, 2010gydF4y2Ba;gydF4y2Ba文森特等人，2019年gydF4y2Ba)．此外，细菌素与人类的不良副作用有关，这限制了它们仅在少数国家的高危人群中使用(gydF4y2Ba维尔马等人，2013年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017bgydF4y2Ba;gydF4y2BaVernel-Pauillac and Werts, 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaFelix等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
高基因组和表型多样性的致病性gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Basp .是疫苗开发的主要缺陷(gydF4y2BaPereira等人，2018gydF4y2Ba)．开发一种具有长期保护钩端螺旋体病的具有成本效益的疫苗一直是世界各地几个研究小组的目标，但它仍然难以实现(gydF4y2BaFelix等人，2020年gydF4y2Ba)．一种针对钩端螺旋体病的通用疫苗可能是多价的，对大多数致病性有保护作用gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2BaSpp，诱导长期免疫，无不良反应，对人和动物均有效。大多数的努力都集中在开发一种重组疫苗，作为细菌素的替代品。gydF4y2Ba德拉戈斯汀等人，2017年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017bgydF4y2Ba;gydF4y2Ba西尔韦拉等人，2017年gydF4y2Ba)．基于刺激先天免疫系统的替代方法已显示出有趣的结果(gydF4y2BaPotula等人，2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaVernel-Pauillac and Werts, 2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaSantecchia等人，2019年gydF4y2Ba)．此外，已开发出减毒活突变体，赋予交叉保护免疫，以多种致病性gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba副及伺服器(gydF4y2Ba斯里克拉姆等人，2011年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba默里等人，2018年gydF4y2Ba;gydF4y2BaWunder等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
逆向和结构疫苗学(RSV)已成功用于设计针对几种传染病的更有效的疫苗，在(gydF4y2Ba多米迪奇等人，2012gydF4y2Ba;gydF4y2BaLiljeroos et al.， 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaRappuoli等人，2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaCable等，2020年gydF4y2Ba)．这种方法允许精细的蛋白质设计，以优化抗原结构。结构疫苗学(SV)应用于钩体外膜蛋白(OMPs)已被证明有助于识别和定位免疫可及的表位，这些表位可与MHC-II受体结合(gydF4y2BaHsieh等，2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉塔等人，2018gydF4y2Ba)．此前，我们基于RSV进行了全面的生物信息学分析，鉴定出β-桶跨膜蛋白(βb-OMPs)gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba（gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．βb-OMPs特别有趣，因为它们是真皮细菌外膜(OM)的组成部分(gydF4y2Ba舒尔茨,2002gydF4y2Ba;gydF4y2Ba威尔逊和伯恩斯坦，2016年gydF4y2Ba)，通常在宿主的存活和成功感染中起着至关重要的作用，如养分获取和附着(gydF4y2Ba2015年阿德勒gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
此外，我们利用细胞表面免疫沉淀(CSIP)实验鉴定了定位于宿主适应细胞表面的钩端螺旋蛋白gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba（gydF4y2BaCunha等人，2017gydF4y2Ba)．这种免疫蛋白组学技术最初是为了识别蛋白质gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2Ba将完整的脑膜炎球菌细胞与患者免疫血清结合，并用质谱法鉴定沉淀蛋白(gydF4y2BaMendum等人，2009年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba纽科姆等人，2014年gydF4y2Ba)．这种方法成功地识别了保护性抗原，包括4CMenB疫苗的几个组成部分(gydF4y2BaSerruto等人，2012gydF4y2Ba)．宿主适应钩端螺旋体与恢复期钩端螺旋体患者血清进行CSIP，并通过质谱鉴定免疫沉淀蛋白，以检测潜在的免疫保护血清反应蛋白。gydF4y2Ba
在目前的研究中，我们报道了RSV和CSIP在基于33个新描述的钩端螺旋omp的22个重组结构的选择和设计中的应用。这些蛋白质的结构建模使我们能够预测表面暴露区域，并确定b细胞和主要组织相容性复合体(MHC-II)结合表位。重组蛋白(单独或嵌合体)在急性钩端螺旋体病仓鼠模型中作为候选疫苗进行了评估。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
用于疫苗候选的33种钩端螺旋蛋白的鉴定gydF4y2Ba
使用RSV方法，我们的小组先前确定了165个假定的细螺旋体βb-OMPs，代表了新的候选疫苗(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．此外，我们采用了CSIP技术(gydF4y2BaMendum等人，2009年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba纽科姆等人，2014年gydF4y2Ba)，以证实这些发现gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba（gydF4y2BaCunha等人，2017gydF4y2Ba)．利用CSIP，我们鉴定了宿主适应钩端螺旋体中表达的157种免疫原性蛋白，并被恢复期人类患者血清识别(未发表数据)。在本研究中，我们选择了其中33种蛋白作为22种新型钩端螺旋体疫苗候选蛋白进行评估。其中，6种蛋白通过RSV和CSIP技术鉴定，其余27种蛋白通过RSV (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．选择标准集中在钩端螺旋细胞表面曝光，并基于其预测的3D结构和功能(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．根据RSV预测的身份，我们选择了几个OM转运蛋白家族，包括:8个tonb依赖受体(TBDR): LIC10714、LIC10881*、LIC10896*、LIC10964、LIC11268、LIC12374、LIC20151和LIC20214;三种海藻酸出口(AlgE): LIC13229、LIC13417*、LIC13477(*，见下文);COG4313通道家族的同源物:LIC11086;六种推测的孔蛋白:LIC10544、LIC11271、LIC11366、LIC11506 (OmpG)、LIC11975、LIC20019。七种蛋白也被预测为OM外排蛋白(OEPs)和I型分泌系统成分的同源物:LIC10496 (TolC)、LIC11941、LIC12307、LIC12575、LIC12693、LIC12990、LIC13135;以及钩端螺旋体GspD同源物LIC11570，一种II型分泌系统中的分泌素。来自其他家族在OM生物合成中发挥重要作用的蛋白质，如钩端螺旋lpd同源物(LIC11458);一种属于FadL脂肪酸转运体家族亚家族的蛋白质(LIC11211);还发现了来自Omp85家族的5个蛋白:LIC10539、LIC11623 (BamA)、LIC12252、LIC12254和LIC12258。gydF4y2Ba
表1gydF4y2Ba最接近的PDB结构和分数用于预测β-桶omp的3D模型。gydF4y2Ba
LIC13417及其同源物的多个序列比对强烈表明它很可能是一个截断蛋白，这与我们之前对LIC10881*和LIC10896*的观察相似(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．基因多态性分析gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130基因组，揭示了LIC13417的最后一个核苷酸中存在一个潜在错误的终止密码子。当点突变改变为一个丝氨酸密码子(TAG→TCG)时，我们将LIC13417和LIC13418重组为单个CDS，以下命名为LIC13417*。LIC13417*及其同源物的多序列比对显示，该修饰蛋白全长的氨基酸同源性(AAI)为80-97% (gydF4y2Ba图S1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
候选疫苗在致病性疾病中的保存gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba
九种致病性候选疫苗的保护水平gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba采用多序列比对法对sp进行评价。该比对使用的全长氨基酸序列的蛋白质从gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130基因组及其同源物在另外9个致病种(gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．总的来说，这些蛋白质显示出高度的保守性;病原种AAIs在60.4 ~ 99.0%之间。在所选择的蛋白质中，32/33在病原P1亚分支节点1的8个物种中有同源蛋白gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Baspp。(gydF4y2Ba文森特等人，2019年gydF4y2Ba)．而LIC10496是最不保守的蛋白质，它只在gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . kirschnerigydF4y2Ba而且gydF4y2Bal . noguchiigydF4y2Ba，这些种通常被认为是P1亚分支中毒性最强的种，通常与人类严重的钩端螺旋体病有关。这三个物种的βb-OMPs高度保守，在31/33的疫苗靶点中AAIs >占90%。LIC10496 (TolC)和LIC11506 (OmpG)是最不保守的，而在代谢中发挥重要作用的LIC11623 (BamA)、LIC11570 (GspD)和LIC11458 (ltd)在分析的基因组中表现出较高的AAI(88.6% - 99.0%)。gydF4y2Ba
候选疫苗表面暴露区域的表位预测gydF4y2Ba
由于调理吞噬作用可能在感染过程中对细螺旋体的清除中起重要作用，我们预测了所选βb-OMPs诱导T-和b细胞反应的免疫原性潜力。NetMHCII 2.2服务器和BepiPred 2.0分别用于预测可与51个HLA-DRB等位基因编码的MHCII类分子和线性b细胞表位结合的表位。每个βb-OMPs的3D模型与它们相应的类似物对齐，如I-TASSER (gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．所有βb-OMPs都被预测含有表面暴露的线性b细胞表位。除了LIC13229不含DRB1_1502等位基因的表位外，所有βb-OMPs的表面暴露区域都鉴定出了所有51个HLA-DRB等位基因的t细胞表位。为每个βb-OMP识别的T细胞和b细胞表位列表如下(gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
细螺旋体βb-OMP候选疫苗的构建gydF4y2Ba
利用结构和功能分析数据以及表位定位结果，我们从33个细螺旋体βb-OMPs中构建了22个含有表面暴露区域的重组蛋白，用于评估作为候选疫苗的价值。采用三种不同的克隆策略:1)表面暴露区域，n = 10 (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba）;2)全长蛋白，n = 3 (gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba）;3)包含31个βb-OMPs表面暴露区域组合的嵌合体，n = 9 (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．22种重组蛋白和33种βb-OMPs的结构细节如下(gydF4y2Ba表S2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．重组蛋白用抗his抗体免疫印迹鉴定，见(gydF4y2Ba图S3gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba单个钩端螺旋β-桶omp的3D模型预测和表面暴露区域的映射。三维模型使用I-TASSER确定，图像使用UCSF Chimera软件生成。gydF4y2Ba(一)gydF4y2Ba10个βb-OMPs的表面暴露区域(不含跨膜或质周区域);gydF4y2Ba(B)gydF4y2Ba全长蛋白质结构。βb-OMPs在OM中的取向源于对最佳匹配PDB结构的解释。上面的，表面暴露的区域在3D模型上以彩色显示，这些区域用于重组蛋白的设计。三维模型下的水平条是嵌合体组成的图形表示。gydF4y2Ba
图2gydF4y2Ba嵌合细螺旋体β-桶OMPs的3D模型预测和表面暴露区域的映射。显示了包含表面暴露区域组合的嵌合体。三维模型使用I-TASSER确定，图像使用UCSF Chimera软件生成。βb-OMPs在OM中的取向源于对最佳匹配PDB结构的解释。上面的，表面暴露的区域在3D模型上以彩色显示，这些区域用于重组蛋白的设计。三维模型下的水平条是嵌合体组成的图形表示。gydF4y2Ba
致命钩端螺旋体病βb-OMP候选疫苗的评价gydF4y2Ba
总共进行了13次实验，以确定22种候选疫苗的效力，这些疫苗基于由RSV和CSIP鉴定的33种βb-OMPs， (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．接种方案使用了两种剂量，范围为50 - 125 μg总重组蛋白，吸附在氢氧化铝佐剂上，肌肉注射。终点为50% (EDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)按上文所述计算(gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba)，约有5个钩端螺旋体gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130挑战菌株。在两个独立的实验中，rLIC11570 (GspD)、rLIC13229 (AlgE)、rLIC13417* (AlgE)和rLIC20214 (TBDR)在100%的接种动物中具有显著的保护作用(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)，见(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．然而，当我们在另外三个独立的实验中重新评估这些候选疫苗时，它们未能诱导显著的保护性免疫反应;保护范围为0 - 30% (gydF4y2Ba图2罪犯gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．从挑战后(PC)第9 - 13天开始观察对照组和接种组的终点标准，这些动物立即实施安乐死，所有幸存者在第28天实施安乐死。在oep中，只有rLIC13135显著提高了生存率(Log-rank，gydF4y2BaPgydF4y2Ba在接种仓鼠中< 0.05)，(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．对于LIC11941和LIC12990，虽然保护水平与LIC13135相同(44.4%)，但这些结果在死亡率或生存率方面不显著。另一项实验未能改善这些初步发现(gydF4y2Ba图3 fgydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．在第10 - 15天，仓鼠表现出终点标准。LIC10539 (Omp85)、LIC10544 (porin)和LIC12258 (Omp85)未能在接种疫苗的动物中产生显著的保护作用，其范围为0 - 22.2% (gydF4y2Ba图3 g-hgydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．大多数终点标准在第9 - 14天观察。对于其余的βb-OMPs, LIC10496 (TolC)， LIC10881* (TBDR)和LIC11086 (AlgE)，保护不显著;范围为0 - 20%，请参阅(gydF4y2Ba图3我gydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．在第10 - 14天，仓鼠表现出终点标准。基于嵌合体结构物(C1 - C9)的疫苗制剂中每个嵌合体蛋白含量为25 μg;每次剂量为50 ~ 125 μg总重组蛋白。在三个独立的实验中，大多数嵌合体未能诱导显著的保护性反应，其范围为0 - 22.2%，见(gydF4y2Ba图3 j-lgydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．然而，与对照组相比，接种C1嵌合体(TBDRs: LIC10896* + LIC10964 + LIC12374)和C3嵌合体(LIC11458 (ltd) + LIC11506 (OmpG) + LIC11086 (OM通道)+ LIC20019 (porin))的生存率提高(ln -rank，gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，见(gydF4y2Ba图3我gydF4y2Ba;gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．在第7 - 20天观察表现出终点标准的仓鼠。gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba急性钩端螺旋体病仓鼠模型对致命挑战的保护作用。具有代表性的实验显示，用两剂量的rβb-OMPs候选疫苗接种(-28和-14天)或注射PBS对照，然后用致命剂量的b- omps挑战(第0天)，仓鼠存活gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba血清型哥本哈根菌Fiocruz L1-130，见(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．各组仓鼠接种以下疫苗:gydF4y2Ba(一)gydF4y2BarLIC11570 (GspD)， rLIC13229 (AlgE)， rLIC13417* (AlgE)， rLIC20214 (TBDR)或PBS对照。所有rβb-OMPs均诱导100%保护(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.0001)和消毒免疫;gydF4y2Ba(罪犯)gydF4y2Ba重复实验未能重现之前看到的保护性免疫反应;gydF4y2Ba(E)gydF4y2Ba用rLIC11941、rLIC12290、rLIC13135或PBS对照接种。虽然对所有蛋白质的保护水平是相同的(44.4%)，但只有rLIC13135显著提高了存活率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba与PBS对照组相比< 0.05);gydF4y2Ba(F)gydF4y2Ba使用oep的重复实验未能重现这些结果;gydF4y2Ba(G H)gydF4y2Ba用rLIC10539 (Omp85)、rLIC10544 (porin)、rLIC12258 (Omp85)接种或PBS对照。没有一种疫苗制剂能抵御挑战剂量;gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba接种rLIC10496 (TolC)、rLIC10881* (TBDR)、rLIC11086 (AlgE)或PBS对照。没有一种疫苗制剂能抵御挑战剂量;gydF4y2Ba(J)gydF4y2Ba时，用嵌合体C1-C5或PBS接种仓鼠。虽然没有一个嵌合体能够抵御致命的挑战，但与PBS对照组相比，嵌合体C1 (TBDRs: LIC10896* + LIC10964 + LIC12374)和C3 (LIC11458 (ltd) + LIC11506 (OmpG) + LIC11086 (OM通道)+ LIC20019 (porin))显著提高了生存率;gydF4y2Ba(K, L)gydF4y2Ba接种嵌合体C6-C9的仓鼠或PBS对照组。这些嵌合体都没有引起明显的保护性免疫反应。gydF4y2Ba
表2gydF4y2Ba急性钩端螺旋体病仓鼠模型候选疫苗的评价。gydF4y2Ba
免疫仓鼠体液免疫反应gydF4y2Ba
采用免疫前第0天和免疫后第28天采集的血清样本和抗仓鼠IgG二抗(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．在重组结构中，20/22诱导显著(gydF4y2BaPgydF4y2Ba免疫仓鼠IgG抗体水平< 0.05)。与免疫前血清相比，只有嵌合体C2 (LIC10714 + LIC10881* + LIC20151)和C4 (LIC11623 + LIC12254 + LIC11268)未能诱导显著水平的循环抗βb- omps抗体(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．免疫球蛋白g亚类的分析是从感染存活的动物身上采集的血清样本(gydF4y2Ba图S5gydF4y2Ba)．与PBS/ al水凝胶对照组相比，rLIC11570免疫显著刺激了IgG1和IgG2水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。rLIC13229和rLIC13417*诱导了主要的IgG2反应(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，而rLIC20214诱导IgG2和IgG3的显著生成(gydF4y2BaPgydF4y2Ba与对照组相比< 0.05)。在免疫前样本中未发现可检测到的抗体水平(数据未显示)。gydF4y2Ba
图4gydF4y2Ba免疫仓鼠特异性体液免疫反应(IgG)采用elisa法测定重组蛋白或PBS对照组免疫仓鼠的抗体水平(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．免疫前和攻毒前血清样本使用抗仓鼠IgG二抗进行特征分析。除rLIC10881和C6(1:50)、rLIC11570、rLIC13229、rLIC13417*、rLIC20214(1:200)、LIC10496和LIC11086(1:400)外，其余血清样品按1:100稀释。结果代表了平均光密度(ODgydF4y2Ba492gydF4y2Ba)±标准差(bar)，由单个血清样本计算，每次重复3次。显著性差异(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)采用单因素方差分析(Tukey多重比较)。*，表明免疫前血清与免疫后28天血清之间存在显著差异。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
由于致病性钩端螺旋体病具有广泛的抗原多样性，因此开发一种通用疫苗是一项挑战gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Baspp。(gydF4y2BaPicardeau 2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba文森特等人，2019年gydF4y2Ba)．RSV是gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba，高通量的方法，识别所有蛋白质，在给定的基因组中，定位于OM和表面暴露(gydF4y2BaRappuoli等人，2016gydF4y2Ba)．RSV已应用于广泛的微生物，并在发现新的候选疫苗方面取得了关键的成功，在(gydF4y2Ba多米迪奇等人，2012gydF4y2Ba)．我们将这种方法应用于gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130基因组，初步鉴定出165个βb-OMPs，这些βb-OMPs被精炼到18个表面暴露的高度保守的致病性βb-OMPsgydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Baspp。(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．在这项研究中，我们重点研究了βb-OMPs，通常被认为是唾手可得的果实，因为它们是革兰氏阴性细菌中最容易预测的跨膜蛋白之一，因为它们的3D结构，而且它们只存在于OM (gydF4y2Ba舒尔茨,2002gydF4y2Ba)．我们更新了原有的βb-OMP列表，并选择了33种新的表面暴露蛋白用于评价钩端螺旋体病仓鼠模型。为了进一步验证gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba我们将这些发现与我们CSIP实验的最新数据进行交叉检查，并发现实验证据表明患者血清中有6种蛋白质被识别(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．βb-OMP的免疫信息学分析和3D结构建模允许我们设计22种重组结构，使每个βb-OMP在一个或多个挑战实验中进行评估。重组结构基于以下两种:全长蛋白;surface-exposed地区;或含有2 - 5 βb-OMPs的表面相关免疫原表位(SRIEs)的嵌合体。在考虑通用疫苗时，主要标准之一是候选疫苗应在目标微生物的致病种中得到很好的保存。在本研究中选择的候选疫苗中，31/33含有致病性同源物gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba最常与人类疾病有关的种(gydF4y2Ba文森特等人，2019年gydF4y2Ba)， AAIs > 60%， (gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．尽管LIC10496只存在于gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba，gydF4y2Bal . kirschnerigydF4y2Ba而且gydF4y2Bal . noguchiigydF4y2Ba，我们纳入该候选疫苗是因为这三个物种最有可能引起严重的人类钩端螺旋体病。gydF4y2Ba
在两个实验中，我们观察到接种了rLIC13229、rLIC13417、rLIC11570或rLIC20214的仓鼠具有100%的免疫保护和杀菌免疫，见(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．此外，与对照组相比，rLIC13135、C1 (LIC10896* + LIC10964 + LIC12374)和C3 (LIC11458 + LIC11506 + LIC11086 + LIC20019)显著提高了接种疫苗动物的存活率。此外，四种rβb-OMPs诱导了显著水平的IgG抗体，其特征是几个IgG亚类，表明Th1和Th2的特征(gydF4y2Ba莫斯曼和科夫曼，1989年gydF4y2Ba)．这些观察结果与先前关于钩端螺旋体病重组亚单位疫苗的研究基本一致(gydF4y2Ba林等人，2016gydF4y2Ba;gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba费尔南德斯等人，2017gydF4y2Ba;gydF4y2BaOliveira等人，2018gydF4y2Ba)．然而，在随后的实验中，保护结果是不可重复的，见(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．关于这些蛋白质在人体中的功能知之甚少gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Basp .和大多数被注释为保守假设蛋白。据报道，LIC13229在受感染仓鼠的尿液中排泄(gydF4y2BaSegawa等人，2014gydF4y2Ba)，其基因表达随着温度从37°C到28°C的变化而下调(gydF4y2Ba秦等，2006gydF4y2Ba)，提示LIC13229参与感染。LIC13417*基因在dmc中表达显著下调，可能在感染早期起作用(gydF4y2Ba凯马诺等人，2014年gydF4y2Ba)．与我们的RSV分析一致，几份报告通过基因组比较和反向疫苗学研究确定LIC20214为OMP和潜在的候选疫苗(gydF4y2BaLouvel等人，2006年gydF4y2Ba;gydF4y2BaViratyosin等人，2008gydF4y2Ba;gydF4y2Ba曾等，2017gydF4y2Ba)．在13个独立的实验过程中，我们评估了不同数量的重组蛋白、醛凝胶佐剂和不同批次的仓鼠，没有在最初的实验中看到成功。这些发现和我们之前的经验以及其他研究小组报告的经验使我们对仓鼠模型用于评估钩端螺旋体病候选疫苗的适用性提出了质疑，我们将在下面进一步讨论这个问题。gydF4y2Ba
omp被认为是革兰氏阴性细菌OM的重要细胞结构，因此是很好的候选疫苗(gydF4y2Ba西尔哈维等人，2010年gydF4y2Ba;gydF4y2BaSperandeo等人，2019年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba沃克和布莱克，2021年出版gydF4y2Ba)．它们经常成为基于抗体的疗法和疫苗的靶点，原因有几个:OMPs含有表面暴露的表位，使它们有可能被抗体或t细胞受体接触到;它们参与基本的细胞功能，如粘附、生物膜形成、群体感应调节和有毒物质的输出;这些蛋白质趋于保守和高表达，从而增加了它们的生物利用度(gydF4y2BaMaiti等人，2020年gydF4y2Ba)．RV使用基于基因组学的方法来识别所有潜在的表面暴露蛋白(gydF4y2BaRappuoli等人，2016gydF4y2Ba)．SV将RV进一步推进一步，根据omp的结构特征(3D模型)识别系列(gydF4y2BaCozzi等人，2013gydF4y2Ba)．最终目标是识别和选择蛋白质靶点，可以引发强大的免疫和记忆反应，从而导致特定和持久的保护(gydF4y2Ba德·泰默曼等人，2011年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
在疫苗开发过程中，除了一些例外，线性表位以外的抗原呈递在很大程度上被忽视了(gydF4y2Ba费萨尔等，2009agydF4y2Ba;gydF4y2Ba费萨尔等，2009bgydF4y2Ba)．亚单位疫苗配方的使用可能在观察到的失败中发挥作用，尽管免疫信息学分析的结果很有希望。在目前的研究中，我们评估了重组嵌合体构建物(C1)中的三种tbdr。虽然C1未能产生显著的保护作用，但它确实显著提高了生存率(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05, Log-rank)与对照组(gydF4y2Ba图3 jgydF4y2Ba，gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．这可能表明，TBDRs是有前途的候选疫苗，如果使用替代方法将它们提交给免疫系统，可能会导致改善。就像我们看到的gydF4y2Ba牛结核分枝杆菌gydF4y2Ba用表达这些TBDRs嵌合体的卡介苗载体疫苗接种仓鼠，免疫效果100%，杀菌免疫(gydF4y2BaBettin等人，2022gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
目前研究中所有33个βb-OMPs在用于嵌合体构建的表面暴露区域均含有推定的抗原B和t细胞表位。这些序列被预测可诱导体液免疫和细胞免疫。尽管观察到20/22的重组构建物具有免疫原性，但线性表位的使用可能限制了其影响。与重组βb-OMPs的不溶性表达相关的实际挑战导致它们被排除在gydF4y2Ba脑膜炎奈瑟氏菌gydF4y2Ba乙型血清疫苗(gydF4y2Ba比萨等人，2000年gydF4y2Ba)．然而，OM囊泡疫苗保留了天然蛋白的构象表位，并在临床试验中提高了保护作用(gydF4y2BaAwanye等人，2019年gydF4y2Ba)．在疫苗中使用OM囊泡传递βb-OMPs是维持构象表位的一种有趣的方法(gydF4y2Bavan de Waterbeemd等人，2010gydF4y2Ba)．构象表位的重要性通过衣原体OM复合物(COMC)得到证实gydF4y2Ba衣原体muridarumgydF4y2Ba包含多个omp (gydF4y2BaYu等，2020年gydF4y2Ba)．COMC疫苗具有高度免疫原性，对感染具有保护作用。然而，当COMC疫苗变性后，保护作用显著降低，这表明需要构象表位来保护。此外，第一份关于预防钩端螺旋体病的报告报告了OmpL1和LipL41之间的协同作用，表达为gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba膜相关蛋白(gydF4y2BaHaake et al.， 1999gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
另一个潜在的问题是在革兰氏阴性细菌中βb-OMPs抗体的可及性，有几份报告称脂多糖(LPS)具有屏蔽作用，导致缺乏保护性免疫反应(gydF4y2Bavan der Ley等人，1986gydF4y2Ba;gydF4y2BaBentley和Klebba, 1988年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba墨菲等人，1990年gydF4y2Ba;gydF4y2BaMichaelsen等人，2001gydF4y2Ba;gydF4y2Ba帕特尔等人，2016gydF4y2Ba;gydF4y2BaDominguez-Medina等人，2020年gydF4y2Ba)．这种屏蔽效应被认为是革兰氏阴性病原体的进化优势。Patel和他的同事们建立了LPS与细胞相互作用的模型gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaOmpF多肽，在感染期间有效地伪装其表位而不被宿主免疫识别(gydF4y2Ba帕特尔等人，2016gydF4y2Ba)．抗体可达OM蛋白gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Basp .是另一个应该考虑的问题，特别是考虑到其不寻常的LPS组成(gydF4y2BaVinh等人，1986年gydF4y2Ba;gydF4y2BaQue-Gewirth等人，2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
抗体对细胞外病原体有多种生物学作用，如中和、吞噬、抗体依赖的细胞毒性和补体介导的裂解(gydF4y2BaHeesterbeek等人，2018gydF4y2Ba;gydF4y2BaSiegrist 2018gydF4y2Ba)．在目前的研究中，观察到20/22评估的重组结构诱导了显著水平的总IgG (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．然而，免疫球蛋白水平与生存无关，正如先前在其他候选疫苗中观察到的那样(gydF4y2Ba库蒂尼奥等，2011gydF4y2Ba;gydF4y2BaMonaris等，2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba;gydF4y2Ba拉贾等，2018年gydF4y2Ba)．与疫苗相比，重组疫苗的现有数据表明，体液反应不足以将细菌从宿主中清除。这些发现表明，控制感染需要更复杂的免疫反应，可能涉及细胞免疫。此外，使用启动-促进方案接种RecA和FliD的动物中，TNF-α、IL-10、IL-4、IL-12p40和IFN-γ mRNA水平与异体保护之间观察到正相关;RecA/FliD重组疫苗仅诱导部分保护(gydF4y2Ba拉贾等，2018年gydF4y2Ba)．同样，抗体水平和保护之间没有可观察到的联系。虽然只能通过定量实时RT-PCR来推断仓鼠模型中的细胞因子水平，但mRNA水平和蛋白质丰度之间可能缺乏相关性，这意味着数据解释需要谨慎(gydF4y2BaKoussounadis等人，2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba刘等，2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
重组蛋白gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba通常被LPS污染，这种内毒素是已知的免疫系统刺激物，是细菌感染期间感染性休克的主要原因。在临床试验期间，疫苗制剂中内毒素的存在受到严格控制，因为即使微量的内毒素也会产生重大影响(gydF4y2BaPetsch和Anspach, 2000gydF4y2Ba;gydF4y2BaWakelin et al.， 2006gydF4y2Ba)．鉴于内毒素刺激免疫系统的能力，它们在重组疫苗中的存在需要进一步研究。值得注意的是，C3H/HeJ小鼠模型对LPS休克具有抗性，进一步支持其作为候选疫苗评估的替代模型(gydF4y2Ba戈麦斯-索莱茨基等人，2017年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba谢蒂等人，2021年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKundu等人，2022年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
抗体水平与重组疫苗诱导的保护之间缺乏相关性，以及细胞免疫在保护性免疫反应中的潜在作用，是发现候选疫苗的关键挑战。缺乏免疫相关物是筛选RSV和CSIP鉴定的数百个新靶点的主要限制。gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017bgydF4y2Ba;gydF4y2BaFelix等人，2020年gydF4y2Ba;gydF4y2BaVernel-Pauillac等人，2021gydF4y2Ba)．只能使用动物模型筛选数量显著减少的候选疫苗，有可能会错过有希望的靶点。免疫关联的发现将大大减少动物的使用，并允许筛选数百个目标。然而，尽管对调理吞噬试验进行了评估，但在其他螺旋体中，如gydF4y2Ba密螺旋体属gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba包柔氏螺旋体gydF4y2Baspp。(gydF4y2Ba克鲁兹等人，2008年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba霍利等人，2017年gydF4y2Ba)，这仍然是难以捉摸的gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba
叙利亚仓鼠(gydF4y2BaMesocricetus auratusgydF4y2Ba)一直被用作隔离的模型gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba，恢复实验室减毒菌株的毒力，研究致病机制，筛选突变菌株的毒力，并在研究实验室评估候选疫苗(gydF4y2BaHaake 2006gydF4y2Ba;gydF4y2BaZuerner 2015gydF4y2Ba)．此外，仓鼠也被用来评估预防钩端螺旋体病的商业疫苗的疗效(gydF4y2BaSrinivas等人，2013gydF4y2Ba)．它们是首选的模型，因为仓鼠易受该病影响，重现人类钩端螺旋体病的严重症状，而且很容易在动物单位繁殖，而小鼠和大鼠对钩端螺旋体病具有天然抵抗力，在(gydF4y2Ba戈麦斯-索莱茨基等人，2017年gydF4y2Ba)．然而，缺乏免疫相关物和缺乏商业上可用的试剂来研究仓鼠的免疫反应，阻碍了该领域的进一步进展(gydF4y2Ba阿德勒,2015 bgydF4y2Ba;gydF4y2BaFelix等人，2020年gydF4y2Ba)．仓鼠极易感染钩端螺旋体病，即使只有一个钩端螺旋体也会被感染(gydF4y2BaHaake 2006gydF4y2Ba)．因此，仓鼠模型作为亚致死或慢性感染的模型用途有限。gydF4y2Ba
相比之下，大多数钩端螺旋体的自然宿主会发展为慢性感染，并伴有肾脏定植、尿脱落和很少或没有疾病的临床症状(gydF4y2BaAthanazio等人，2008年gydF4y2Ba;gydF4y2Barich et al.， 2015gydF4y2Ba;gydF4y2BaZuerner 2015gydF4y2Ba;gydF4y2Ba戈麦斯-索莱茨基等人，2017年gydF4y2Ba)．小鼠模型已用于评估候选疫苗;它被用于LigA疫苗的首次评估(gydF4y2Ba小泉和渡边，2004gydF4y2Ba)．重要的是，有大量的商业可用试剂用于描述免疫反应。此外，还有小鼠突变体，如C3H/HeJ TLR4突变体，SCID和gydF4y2BaRag1gydF4y2Ba易受钩端螺旋体感染的KO老鼠(gydF4y2Ba班德拉等人，2011gydF4y2Ba;gydF4y2Ba谢蒂等人，2021年gydF4y2Ba;gydF4y2BaGrassmann等人，2021年gydF4y2Ba;gydF4y2BaKundu等人，2022年gydF4y2Ba)．小鼠模型的使用将使致命性和亚致命性钩端螺旋体病的研究成为可能，有可能发现可用于筛选候选疫苗的免疫相关物(gydF4y2BaPereira等人，1998年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba桑托斯等，2010年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba戈麦斯-索莱茨基等人，2017年gydF4y2Ba;gydF4y2BaFelix等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
本研究的局限性包括:内毒素对重组疫苗制剂诱导的免疫应答的影响尚不清楚，需要进一步研究;由于缺乏市售试剂，无法在仓鼠模型中评估细胞反应;缺乏与钩端螺旋体病相关的免疫因子是筛选候选疫苗的主要限制gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．使用C3H/HeJ小鼠模型可以解决前两个限制;它易患钩端螺旋体病，不承认gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba脂多糖，有广泛的商业试剂可用来研究体液和细胞免疫反应。此外，这些试剂可以帮助发展钩端螺旋体病的免疫关联。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba
我们报告了使用RSV和CSIP来鉴定候选疫苗gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz l2 -130基因组和22种候选钩端螺旋体疫苗(基于33种βb-OMPs)的评估，其中4种疫苗在两个独立的实验中诱导了显著的保护作用。此外，这些重组蛋白刺激免疫仓鼠显著的体液免疫反应和杀菌免疫。此外，两种嵌合体结构显著提高了接种疫苗动物的存活率，这表明它们有可能成为候选疫苗。然而，当我们在其他实验中测试这些候选疫苗的可重复性时，它们未能诱导保护性免疫反应。这些结果以及文献中的其他报告使我们对钩端螺旋体病仓鼠模型用于评估候选疫苗的适用性提出了质疑。我们进一步建议，替代方案，如小鼠急性和慢性模型，应重新评估。gydF4y2Ba
材料与方法gydF4y2Ba
菌株及培养gydF4y2Ba
大肠杆菌gydF4y2Ba菌株分别在液体Luria-Bertani (LB)培养基(180 rpm)或固体LB培养基中37°C生长。必要时选用氨苄西林(100µg/ml)和氯霉素(34µg/ml)。gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba血清组黄疸出血血清型哥本哈根菌株Fiocruz L1-130在Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) (Difco, BD，巴西)液体中保持在28°C，并辅以钩端螺旋体富集EMJH商业补充剂(Difco, BD，巴西)。gydF4y2Ba
正交元的功能注释与序列守恒gydF4y2Ba
我们的研究小组RSV先前确定的165个假定βb-OMPs的列表更新如下所述(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．使用UniProt和InterProScan进行功能注释(gydF4y2BaZdobnov和Apweiler, 2001gydF4y2Ba)．在另外20个基因组序列中鉴定了同源物gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba，使用基于蛋白质BLAST (BLASTp)搜索的倒数最佳命中(RBH)方法(gydF4y2BaAltschul等人，1997年gydF4y2Ba)，如上文所述(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．>相似性为70%，>覆盖率为40%的蛋白质序列被认为是同源的。利用现有病原的同源物进行了多序列比对gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Basp .使用Clustal Omega工具(gydF4y2Ba西弗斯等人，2011gydF4y2Ba)．当进行此分析时，有10个致病gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Basp .基因组，见(gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)，对应于病原P1亚分支的节点1(9种)gydF4y2Ba钩端螺旋体gydF4y2Ba基于最新的基因组多样性研究和gydF4y2Bal . alsontiigydF4y2Ba（gydF4y2Ba文森特等人，2019年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
结构建模和功能注释gydF4y2Ba
考虑到在感染过程中吞噬和清除钩体的重要性，我们证实了βb-OMPs中存在SRIEs。这取决于预测βb-OMPs在OM中的取向的能力，这是通过分析与膜数据库中蛋白质取向最接近的PDB模型来实现的。因此，这些表位很可能暴露在钩端螺旋体表面，并能够与MHC II类受体结合，从而刺激宿主的免疫反应。以I-TASSER生成的每个三维模型的PDB中最接近的结构类似物为参考，确定了薄螺旋βb-OMPs在OM中的取向，以及可能的表面暴露区域。分别使用NetMHCII软件和BepiPred-2.0预测OM上暴露片段中MHCII表位(HLA-DRB等位基因)和线性B细胞表位的存在(gydF4y2BaLundegaard等人，2008gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
βb-OMP结构膜分配和表位预测gydF4y2Ba
为了鉴定含有β-barrel跨膜结构域的蛋白质，我们利用I-TASSER server (gydF4y2Ba张,2008gydF4y2Ba)．使用具有桶状结构的顶级模型的I-TASSER结果来识别与目标蛋白模型结构最接近的PDB条目。对于二级或三级I-TASSER排名的蛋白质3D模型，使用COFACTOR (gydF4y2Ba罗伊等人，2012年gydF4y2Ba)，如上文所述(gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2017agydF4y2Ba)．三维结构使用UCSF Chimera软件V. 1.11.2 (gydF4y2Ba彼得森等人，2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
细胞表面免疫沉淀法(CSIP)鉴定候选疫苗gydF4y2Ba
该技术被用于实验鉴定定位于宿主适应细胞表面的钩端螺旋蛋白gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba，如上文所述(gydF4y2BaCunha等人，2017gydF4y2Ba)．简单地说，我们产生了宿主适应钩体(gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130)通过在手术植入Wistar大鼠腹腔的透析膜腔中培养，培养9 - 12天(gydF4y2Ba凯马诺等人，2014年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba格拉斯曼等人，2015年gydF4y2Ba)．完整的，宿主适应的钩端螺旋体被回收，表面暴露的蛋白质被免疫沉淀使用汇集的康复期钩端螺旋体患者的血清。血清样本由巴西里约热内卢里约热内卢(RJ)和阿雷格里港(RS)的公共卫生中心实验室(LACEN)捐赠。钩端螺旋体病经显微凝集试验(MAT)和酶联免疫吸附试验(WHO and ILS, 2003)确诊。恢复后，用质谱法鉴定了免疫沉淀蛋白(gydF4y2Ba纽科姆等人，2014年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
β-桶OMPs的设计与克隆gydF4y2Ba
利用预测的βb-OMPs三维模型设计重组蛋白。我们采用三种策略克隆候选疫苗:1)10个βb-OMPs的细胞表面暴露区域(没有跨膜或质周区域)，用于以下蛋白质:LIC10539、LIC10544、LIC11570、LIC11941、LIC12258、LIC12990、LIC13135、LIC13229、LIC13417*和LIC20214;2) 3个全长蛋白:LIC10496、LIC10881*和LIC11086;3) 9个多嵌合结构中29个蛋白质的细胞表面暴露区域:嵌合1 (C1): LIC10896* + LIC10964 + LIC12374;嵌合体2 (C2): LIC10714 + LIC10881* + LIC20151;嵌合体3 (C3): LIC11458 + LIC11506 + LIC11086 + LIC20019;嵌合体4 (C4): LIC11623 + LIC12254 + LIC11268;嵌合体5 (C5): LIC10496 + LIC12575 + LIC11211 + LIC13417*;嵌合体6 (C6): LIC10496 + LIC10881*;C7嵌合体:LIC10539 + LIC10544 + LIC12258; chimera 8 (C8): LIC11271 + LIC11366 + LIC11975 + LIC12252; chimera 9 (C9): LIC11941 + LIC12290 + LIC13135 + LIC12693 + LIC12307. The chimera constructs were designed to include a range of protein functions in each construct. For design strategies 1 and 3, the surface-related regions were synthesised in series without linkers, see (表S2gydF4y2Ba在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)．每个蛋白质的区域使用Vector NTI v.11进行组装，并进行商业生产，包括密码子优化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba表达，克隆到表达载体pAE (gydF4y2BaRamos等人，2004年gydF4y2Ba),使用gydF4y2BaBamgydF4y2Ba你好,gydF4y2BaKpngydF4y2Ba我或gydF4y2Ba欣gydF4y2BadIII限制位点。gydF4y2Ba
重组蛋白的表达与纯化gydF4y2Ba
工程重组蛋白在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21 (DE3) Star或pLysS细胞如前所述(gydF4y2BaBettin等人，2022gydF4y2Ba)．简单地说，就是两者的乘积gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在含氨苄西林和氯霉素100 μg/ml (34 μg/ml)的LB培养基中培养热休克转化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BapLysS)，在37°C。当培养达到中对数相(ODgydF4y2Ba600gydF4y2Ba0.6 - 0.8)，加入IPTG诱导蛋白表达3-4 hgydF4y2Ba2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， 0.5 M NaCl和20 mM咪唑，pH 8.0)，在冰上超声6× 30s循环，离心(11.000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba， 40分钟，在4℃)。裂解后直接从上清液中纯化可溶性重组蛋白。为了回收不溶性蛋白质(包含在包涵体中)，将裂解后离心产生的微球溶解在变性缓冲液(裂解缓冲液，8 M尿素)中。重组蛋白经固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化，使用HisTrap FF柱(GE Healthcare，巴西)，使用AKTA Start层析系统(GE Healthcare，巴西)，如先前所述(gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba)．含有可溶性蛋白的部分在pH为7.5的PBS或50 mM Tris pH 8.5的缓冲液中在4℃下透析24小时。含有不溶蛋白的部分在pH为7.5的PBS或含有0.05% Triton X-100的50 mM Tris pH 8.5的PBS中在4℃下透析。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Brazil)测定蛋白质浓度，并将蛋白质储存在-20°C。gydF4y2Ba
确定对仓鼠模型的刺激剂量gydF4y2Ba
雄性和雌性叙利亚仓鼠(gydF4y2BaMesocricetus auratusgydF4y2Ba)作为急性钩端螺旋体病的动物模型。致病物种的挑战剂量gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2Ba血清组哥本哈根黄疸出血血清型菌株Fiocruz L1-130是用8周龄的仓鼠测定的，如前所述(gydF4y2Ba席尔瓦等人，2007年gydF4y2Ba)．简单地说，三组仓鼠通过腹腔注射10gydF4y2Ba0gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba钩体在1ml EMJH培养基中。使用Petroff-Hauser计数室和暗场显微镜对钩端螺旋体进行计数，并且只对活动的钩端螺旋体进行计数。在28天的时间里，每天监测仓鼠的钩端螺旋体病临床症状。终点标准包括:体重减轻10%(见gydF4y2Ba图S4gydF4y2Ba)、鼻出血、俯卧及对刺激无反应(gydF4y2Ba库蒂尼奥等，2011gydF4y2Ba)．达到一个或多个终点标准的动物立即被CO安乐死gydF4y2Ba2gydF4y2Ba麻醉。在50%的感染动物中引起终点标准的终点剂量(EDgydF4y2Ba50gydF4y2Ba)的计算方法如上文所述(gydF4y2Ba里德和穆恩克，1938年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba
致死性钩端螺旋体病鼠模型免疫保护作用的评价gydF4y2Ba
用于细胞表面暴露区域的疫苗制剂和全长蛋白含有50µg重组蛋白，而嵌合结构物中每种蛋白含有25µg (gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba）;这是基于先前发表的数据，参见例如，(gydF4y2Ba席尔瓦等人，2007年gydF4y2Ba;gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba)．对于疫苗配方，重组蛋白制备为最终浓度为15% (v/v)的氢氧化铝佐剂(2% Alhydrogel, 2% Alhydrogel)，gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2BaGen, USA)，在4°C下轻轻混合16小时。为了进行免疫，将4-6周龄的雄性和雌性金色叙利亚仓鼠随机分配到每组9-10只。每隔14天肌肉注射2次。为了评估疫苗诱导的保护作用，在第一次免疫后28天，用10 - 20× ED进行腹腔刺激gydF4y2Ba50gydF4y2Ba的gydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz l1 - 130。每天监测3次，连续观察28天。达到终点标准或存活到第28天PC的动物被CO安乐死gydF4y2Ba2gydF4y2Ba麻醉。免疫前血液样本分别于接种前第0天和攻毒前第28天采集，并保存于-20°C。进行了13个独立实验来评估22种重组蛋白结构。gydF4y2Ba
钩端肾负担gydF4y2Ba
收集肾脏样本，浸渍并接种到EMJH培养基中，如前所述(gydF4y2BaWHO和ILS, 2003gydF4y2Ba)．培养物在被认为是阴性之前，定期用暗场显微镜检查长达12周。如前所述，用实时定量PCR (qPCR)评估钩端螺旋肾负荷(gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba)，两者的区别如下。使用SV基因组DNA纯化试剂盒(Promega，巴西)从受感染动物的肾脏中提取基因组DNA。DNAgydF4y2Bal . interrogansgydF4y2BaFiocruz L1-130使用Illustra Bacterium Genomic Prep Mini Spin试剂盒(GE Healthcare，巴西)提取，并使用quantitative - it dsDNA检测试剂盒和Qubit荧光计(Thermo Fisher Scientific Inc.，美国)按照制造商说明进行定量。纯化的基因组DNA被稀释以生成从2×10的标准曲线gydF4y2Ba1gydF4y2Ba2×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba拷贝/反应。使用LipL32-f 5 ' -CTGAGCGAGGACACAATC和LipL32-r 5 ' -ATTACGGCAGGAATCCAA引物进行三次反应。gydF4y2Ba
体液免疫反应评估gydF4y2Ba
抗体为基础的免疫反应的诱导是使用纯化的重组蛋白(如前所述)进行间接ELISA评估的。gydF4y2Ba康拉德等人，2017gydF4y2Ba)，并进行了如下修改:聚苯乙烯96孔微量滴定板上涂有50-200 ng/well每个单独的重组蛋白。用5%的脱脂牛奶溶液在PBS-T中堵塞培养皿，并按1:50 - 1:400稀释添加仓鼠血清。使用过氧化物酶偶联抗叙利亚仓鼠IgG抗体(Jackson ImmunoResearch, USA)或抗IgG亚类(anti-IgG1, IgG2/3和IgG3) (Southern Biotech, USA)作为二抗。通过加入邻苯二胺二盐酸盐(Sigma-Aldrich，巴西)和过氧化氢来进行反应，并在加入3N H时停止反应gydF4y2Ba2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．在492 nm处读取光密度，并从三次血清样本中获得平均值。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
分别使用双尾Fisher精确测试(GraphPad QuickCalcs)和Log-rank测试(GraphPad Prism)评估对致命钩端螺旋体病的保护和生存率。抗体水平用方差分析比较组间的差异(Tukey的多重比较)。GraphPad Prism v.8。用于进行统计分析，以及gydF4y2BaPgydF4y2Ba值< 0.05为显著。gydF4y2Ba
数据可用性声明gydF4y2Ba
该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba．进一步的查询可以联系通讯作者。gydF4y2Ba
道德声明gydF4y2Ba
所有动物实验都是按照《巴西用于教学活动和科学研究的动物生产、维护和使用指南》进行的，并遵守国际准则。所有协议均由佩洛塔斯联邦大学(UFPel)的动物使用伦理委员会(CEUA编号:8230- 2017,59050 -2018和19193-2018)审查并批准。在UFPel的CEUA由巴西国家动物实验控制委员会(CONCEA)认可。目前研究中使用的仓鼠是由UFPel的动物单位提供的。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
OD、JM和AM为研究的概念和设计做出了贡献。MM、EB、LB、NO进行生物信息学分析，进行统计分析，并撰写初稿。MM、EB、LB、NO、TB、AP、GR、ER、AS进行室内实验。EB、NO和AM创建了图形和表格。所有作者均参与了稿件的修改、阅读和审定。gydF4y2Ba
资金gydF4y2Ba
这项工作得到了英国皇家学会的拨款IC170171，巴西国家科学和技术发展委员会(CNPq)的拨款311212/2021-2和315550/2020-1，以及Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES)的拨款001。gydF4y2Ba
利益冲突gydF4y2Ba
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba
出版商的注意gydF4y2Ba
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fcimb.2022.940966/full#supplementary-materialgydF4y2Ba
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关键词:gydF4y2Ba钩端螺旋体interrogansgydF4y2Ba外膜蛋白，逆向和结构疫苗学，细胞表面免疫沉淀，动物模型gydF4y2Ba
引用:gydF4y2BaMaia MAC, Bettin EB, Barbosa LN, de Oliveira NR, Bunde TT, Pedra ACK, Rosa GA, da Rosa EEB, Seixas Neto ACP, Grassmann AA, McFadden J, Dellagostin OA和McBride AJA(2022)通过对22种候选疫苗的评估揭示了开发对抗钩端螺旋体病通用疫苗的挑战。gydF4y2Ba前面。细胞。感染。Microbiol。gydF4y2Ba12:940966。doi: 10.3389 / fcimb.2022.940966gydF4y2Ba
收到:gydF4y2Ba2022年5月10日;gydF4y2Ba接受:gydF4y2Ba2022年9月20日;gydF4y2Ba
发表:gydF4y2Ba2022年10月7日。gydF4y2Ba
编辑:gydF4y2Ba
卢尔德艾萨克gydF4y2BaSão圣保罗大学，巴西gydF4y2Ba版权gydF4y2Ba©2022 Maia, Bettin, Barbosa, de Oliveira, Bunde, Pedra, Rosa, da Rosa, Seixas Neto, Grassmann, McFadden, Dellagostin和McBride。这是一篇开放获取的文章，根据gydF4y2Ba创作共用署名许可(CC BY)gydF4y2Ba．在其他论坛上的使用、分发或复制是允许的，前提是原作者和版权所有者注明出处，并按照公认的学术惯例引用本刊上的原始出版物。不得使用、分发或复制不符合这些条款的内容。gydF4y2Ba
*通信:gydF4y2Ba艾伦·j·a·麦克布莱德，gydF4y2Baalan.mcbride@ufpel.edu.brgydF4y2Ba
__gydF4y2Ba目前地址gydF4y2Ba:埃弗顿·b·贝丁，美国康涅狄格州法明顿康涅狄格卫生大学医学系gydF4y2Ba
Liana N. Barbosa，美国田纳西州诺克斯维尔田纳西大学生物医学和诊断科学系gydF4y2Ba
‡gydF4y2Ba这些作者对这项工作做出了同等的贡献，并共享第一作者身份gydF4y2Ba
§gydF4y2Ba这些作者对这项工作做出了同等的贡献，并共享最后的作者身份gydF4y2Ba