糖尿病和潜伏结核病共同发病机制中宿主-病原体串扰的免疫学方面gydF4y2Ba

1介绍gydF4y2Ba

糖尿病患者是正常人的两倍gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba与非糖尿病患者相比，感染和糖尿病也增加了结核病患者过早死亡的风险(gydF4y2BaFaurholt-Jepsen等人，2013gydF4y2Ba)．结核病和糖尿病之间存在双向关联。虽然糖尿病是结核病的一个强有力的危险因素，并影响治疗结果(gydF4y2Ba贝克等人，2011年gydF4y2Ba)，另一方面，结核病也会影响糖尿病患者的血糖控制(gydF4y2BaFisher-Hoch等人，2013gydF4y2Ba)．目前，结核病与糖尿病之间的关联机制尚不完全清楚。免疫不良在结核病易感性中起着至关重要的作用。由于糖尿病是一种流行病，它现在是众所周知的导致免疫功能低下状态的原因之一，它与艾滋病毒、衰老、营养不良和吸烟一起促进了结核病的发展(gydF4y2Ba福克斯和孟席斯，2013年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba里德,2014gydF4y2Ba)．在糖尿病中，宿主的免疫力gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba“功能失调”是准确的，而不是像其他危险因素那样，对免疫反应夸大或延迟gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba，这使得宿主容易激活潜伏结核病。gydF4y2Ba

单核细胞在结核病中起着至关重要的作用，通过迁移到肺部对gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba暴露并分化为巨噬细胞和树突状细胞，充当抗原提呈细胞和释放细胞因子。慢性高血糖可改变各种趋化因子和细胞因子的表达，引起单核细胞吞噬功能障碍，抑制补体系统，从而直接影响免疫系统(gydF4y2BaStegenga等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHair等人，2012年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRestrepo等人，2014gydF4y2Ba)．糖尿病患者对结核病的免疫易感性尚不清楚。糖尿病患者结核病易感性的增加可归因于多种因素，直接影响与胰岛素抵抗和高血糖有关，而间接影响与淋巴细胞和巨噬细胞功能有关(gydF4y2Ba杜利和柴森，2009年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba雷斯特雷波和施莱辛格，2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba马丁内斯和科恩菲尔德，2014年gydF4y2Ba)．糖尿病患者的免疫功能受损，要么激活潜伏性结核病，要么促进结核病的原发性感染，可能是整体免疫功能受损的可能解释(gydF4y2Ba庞塞-德-利昂等人，2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基质金属蛋白酶受到各种生长因子、激素、细胞因子的严格调控，也受到基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)和内源性基质金属蛋白酶抑制剂(MMPIs)的控制。细胞因子在基因水平上调节基质金属蛋白酶的产生gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba消极或积极的规管因素(gydF4y2BaWoessner 1991gydF4y2Ba)，并可能影响抑制或激活MMPs的蛋白水解酶的产生(gydF4y2BaRies和Petrides, 1995gydF4y2Ba；gydF4y2BaGalboiz等人，2002年gydF4y2Ba)．因此,在gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染时，细胞因子水平升高，基质金属蛋白酶的活性和调节预计是由细胞因子控制的。基质金属蛋白酶在对感染性病原体的免疫反应中起作用(gydF4y2Ba特纳等人，2001年gydF4y2Ba；gydF4y2BaLee et al.， 2005gydF4y2Ba)．据报道，基质金属蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶-9，在各种类型的结核病，包括脑膜炎(gydF4y2BaMatsuura等人，2000年gydF4y2Ba；gydF4y2BaPrice等人，2001年gydF4y2Ba；gydF4y2BaThwaites等人，2003年gydF4y2Ba；gydF4y2BaLee等人，2004年gydF4y2Ba)、活动性空腔结核(gydF4y2BaChang等人，1996年gydF4y2Ba；gydF4y2BaPrice等人，2001年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHrabec等人，2002年gydF4y2Ba)及胸膜炎(gydF4y2BaHoheisel等人，2001gydF4y2Ba；gydF4y2BaHrabec等人，2002年gydF4y2Ba；gydF4y2BaJin等，2004gydF4y2Ba)．在结核病治疗过程中，MMP-9的抑制已显示出结核性脑膜炎的细菌清除增加和炎症抑制(gydF4y2Ba马吉德等人，2016gydF4y2Ba)．因此，新出现的数据表明MMPs在结核病及其各种相关病理状态中起着重要作用。细胞外基质(ECM)在肉芽肿的结构组成中起着至关重要的作用，即白细胞在这种动态环境中进出(gydF4y2Ba罗迪斯1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba冈萨雷斯-华雷罗等人，2001gydF4y2Ba)，但在这一结构重组过程中，形成稳定的肉芽肿或随着肉芽肿溶解向病理病变发展的潜在事件正在缓慢展开。有趣的是，基质金属蛋白酶是肉芽肿形成和肺组织破坏的关键因素(gydF4y2BaSalgame 2011gydF4y2Ba)．因此，本研究的重点是了解之间的串扰gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba在高血糖条件下/糖尿病下潜伏结核感染的宿主，与结核病糖尿病共发病中肉芽肿形成的各种细胞因子和基质金属蛋白酶有关。gydF4y2Ba

2材料与方法gydF4y2Ba

2.1动物采购和伦理声明gydF4y2Ba

所有动物实验都在新德里国际基因工程和生物技术中心(ICGEB)的生物安全iii级(BSL-III)设施中进行。动物程序由机构动物伦理委员会批准。89/90/IAEC/616和ICGEB动物伦理委员会，新德里，参考文献编号:ICGEB / IAEC / 02042019 / TACF-PGIMER-16 (gydF4y2BaVerma等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2．2gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaHgydF4y2Ba_37gydF4y2Ba房车培养及保养gydF4y2Ba

结核分枝杆菌gydF4y2BaHgydF4y2Ba_37gydF4y2BaRv (NCTC-7416)，最初从英国伦敦的国家类型培养收藏中采购，在Soutan含有2%甘油和0.05%吐温80的培养基中培养，在200转/分钟的震动条件下培养。通过与麦克法兰标准比较，枚举对数生长的培养物，并在−80°C保存，直到进一步使用。gydF4y2Ba

2.3潜伏性结核和糖尿病小鼠模型gydF4y2Ba

用卡介苗以0.5 od (600 nm)雾化感染5 ~ 6周龄Balb/c小鼠，建立潜伏性结核小鼠模型，6周后，gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv感染剂量为1.1 od (600 nm)。感染4周和6周后通过CFU计数确认潜伏期gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba．感染后六周gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba，将潜伏感染的动物分为3组，即组i:仅潜伏结核(n = 24)，组ii:潜伏结核合并糖尿病(n = 24)，组iii:潜伏结核合并免疫抑制(n = 24)。第一组动物不进行治疗。ii组动物用单剂量链脲佐菌素(150 mg/kg体重)诱导糖尿病，iii组动物用地塞米松诱导免疫抑制(gydF4y2BaAhmad et al.， 2006gydF4y2Ba)．在糖尿病诱导的第9周和第13周处死动物。gydF4y2Ba

2.4组织病理学研究gydF4y2Ba

无菌切除的肺和脾脏转移到10%缓冲福尔马林中，进一步处理石蜡包埋和切片(gydF4y2BaRamos-Vara 2011gydF4y2Ba)．石蜡切片脱蜡后用标准苏木精-伊红染色(H&E)和抗酸杆菌染色(AFB)。gydF4y2Ba

2.5 THP-1细胞系的培养与维持gydF4y2Ba

人类白血病单核细胞细胞系THP-1从印度普纳国家细胞科学中心(NCCS)的细胞库中获得，并在RPMI 1640培养基中常规维持悬浮细胞，添加10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和100 μg/ml Sigma抗生素-抗真菌鸡尾酒(青霉素、链霉素和庆大霉素)，37°C和5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在加湿的培养箱中。细胞生长到2-5 × 10的密度gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/ml 25厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba平底组织培养瓶，每3天传代一次。gydF4y2Ba

2.6gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba潜伏性肺结核模型gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba根据所描述的方法，建立了潜伏性结核的营养饥饿模型gydF4y2Ba贝茨等人(2002)gydF4y2Ba．简单地说,gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaHgydF4y2Ba_37gydF4y2BaRv在富含营养的培养基中培养，即含有2%甘油和0.05%吐温80的Soutan培养基，在200转/分的恒定震动条件下培养7天。7 d后，5000 ×离心培养gydF4y2BaggydF4y2Ba10-15分钟，洗净细菌球，转移到含0.05% Tween 80 (PBST)的PBS中，在培养箱振动筛中以200 rpm的转速震动6周。6周孵育后，将其用作潜伏结核培养物，并在−80°C保存，直到进一步使用。gydF4y2Ba

2.7 THP-1来源的巨噬细胞感染gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaHgydF4y2Ba_37gydF4y2Ba房车gydF4y2Ba

感染实验:3 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba将THP-1细胞/孔镀于含5%胎牛血清的完整rmi -1640培养基中，不同葡萄糖浓度，即5.5 mM(正常血糖状态)、15 mM和25 mM(高血糖状态)。在相同的摩尔浓度下，使用d -甘露醇作为渗透控制。将大约20 ng/ml的豆蔻酸乙酸佛波酯(MP Biomedicals, USA)加入培养基中24小时，使单核细胞向巨噬细胞分化。24 h后，用不含抗生素和各自葡萄糖浓度的新鲜RPMI培养基覆盖细胞单层，并添加2% FBS，在37°C和5% CO下孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba培养48 h后，将细胞分为未感染组、活性结核组和潜伏结核组。活跃的gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba培养物被用来感染活动性肺结核组的细胞，而休眠组的细胞gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba用培养物以1:5(5菌/1细胞)的感染倍数(MOI)感染潜伏结核组的THP-1细胞3 h (gydF4y2Ba艾奥娜等人，2012gydF4y2Ba)．3 h后，用温热的RPMI 1640洗涤细胞2次，并补充含有不同葡萄糖浓度和阿米卡星(50 μg/ml)的完整RPMI 1640培养基，以防止分枝杆菌的细胞外复制。gydF4y2Ba

2.8菌落形成单位计数gydF4y2Ba

无菌切除肺和脾脏，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质，并镀于含有10%油酸-白蛋白-右糖-过氧化氢酶(OADC)的Middlebrook 7H11琼脂(Becton-Dickinson，美国)(Difco-Becton Dickinson，美国)。潜伏组，注射卡介苗之前gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染后，在7H11琼脂培养基中加入4 mg/ml的2-噻吩羧酸肼(TCH) (Sigma Aldrich)进行选择gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba勒科尔等人，1989年gydF4y2Ba)．在上述葡萄糖浓度下培养潜伏感染和活跃感染的THP-1细胞，分别在感染0天、1天、3天和6天的不同时间点，在0.1% Triton X-100中裂解5 min。裂解物被镀在添加10% OADC的Middlebrook 7H11琼脂板上，一式三次。板在37°C的5% CO中孵育gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵育28天后测定CFU计数。gydF4y2Ba

2.9基质金属蛋白酶基因表达分析gydF4y2Ba

在不同葡萄糖浓度下培养的未感染、潜伏感染和活跃感染的THP-1细胞用不含fbs的RPMI培养基洗涤，并用胰蛋白酶- edta溶液处理。离心1600 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba细胞颗粒在TRIzol中重悬3 min。对于动物的基因表达研究，肺组织直接转移到2-3毫升的TRIzol中，这取决于组织的大小。然后用标准苯酚-氯仿法(gydF4y2BaAdilakshmi等人，2006gydF4y2Ba)．对于定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, USA)对RNA (500 ng)进行逆转录。采用SYBR进行qRT-PCR扩增gydF4y2Ba^®gydF4y2BaRoche LightCycler上的绿色化学gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba96实时PCR系统。用于扩增不同基因的引物序列见gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

2.10细胞因子测定gydF4y2Ba

使用流式细胞仪珠阵列(CBA)人可溶性蛋白主缓冲试剂盒(Becton Dickinson，美国)检测THP-1培养上清液中的细胞因子，使用CBA小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒检测小鼠血清中的细胞因子。在血清和培养上清液中，添加蛋白抑制剂鸡尾酒(Sigma Aldrich, USA)并保存在−80°C。细胞因子检测按照制造商的规程进行。gydF4y2Ba

2.11基质金属蛋白酶测定gydF4y2Ba

采用美国ImmunoTag公司的ELISA试剂盒检测小鼠血清中的基质金属蛋白酶。将蛋白抑制剂鸡尾酒(PIC) (Sigma Aldrich, USA)添加到血清中并保存在−80°C。检测按照制造商的规程进行。gydF4y2Ba

2.12统计分析gydF4y2Ba

显著性水平由Mann-Whitney检验和Kruskal-Wallis检验确定，使用GraphPad Prism软件包，8.0版(GraphPad Software, San Diego, USA) (gydF4y2BaVerma等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3的结果gydF4y2Ba

3.1潜伏性结核小鼠模型的杆菌量gydF4y2Ba

免疫后1 d，小鼠肺中卡介苗CFU平均计数为1.92±0.04 loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(数据未显示)。六周后，平均值gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染1 d后CFU计数为1.84±0.03 loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba(数据未显示)。挑战后四周，平均值gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba与活跃肺结核组相比，潜伏肺结核组的肺和脾脏中的CFU计数显著降低(gydF4y2Ba图1A、BgydF4y2Ba)．同样，在感染6周后，潜伏结核组肺和脾脏的平均CFU计数明显低于活跃结核组(gydF4y2Ba图1C、DgydF4y2Ba)．潜伏结核组感染8周后肺、脾CFU计数均值为3.79±0.034 loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba和3.02±0.04 loggydF4y2Ba_10gydF4y2Ba，分别(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)．潜伏结核组感染4周和6周后CFU计数gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba确认建立潜伏性肺结核。潜伏感染持续到感染后第8周，潜伏结核组动物的肺和脾脏中观察到稳定的CFU计数。gydF4y2Ba

3.2潜伏结核感染小鼠肺部肉芽肿形成gydF4y2Ba

感染4周和6周后，活动性肺结核组动物的肺部观察到支气管周围和血管周围炎症(gydF4y2Ba图2A、CgydF4y2Ba)，而在潜伏结核组，肺部出现实质炎症和炎症细胞聚集在气隙。此外，潜伏结核组感染4周后观察到组织细胞聚集导致稀疏肉芽肿的形成(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)．感染6周后，潜伏结核组观察到肺气隙胸膜表面炎症细胞聚集，并观察到畸形肉芽肿(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)．潜伏结核组动物的肺组织在感染8周后也显示出淋巴样和组织细胞聚集，这表明形成了畸形肉芽肿(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.3潜伏型结核模型肺中休眠相关基因的表达gydF4y2Ba

各种延迟相关基因的表达gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba进行了研究，包括gydF4y2BahspX, tgs1, tgs3gydF4y2Ba,gydF4y2Batgs5gydF4y2Ba．基因表达gydF4y2Batgs1gydF4y2Ba而且gydF4y2Batgs5gydF4y2Ba与活跃结核组相比，潜伏结核组的基因表达分别上调3.8倍和2.6倍，且未见明显变化gydF4y2BahspXgydF4y2Ba感染4周后的基因(gydF4y2Ba图3 a - cgydF4y2Ba)．然而，表达的gydF4y2BahspXgydF4y2Ba发现约3.5倍上调，约1.4倍增加表达gydF4y2Batgs5gydF4y2Ba与活跃肺结核组相比，潜伏肺结核组在治疗6周后有显著差异gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba感染(gydF4y2Ba图3D, FgydF4y2Ba)，表示潜伏结核组潜伏期的发展。的表达gydF4y2Batgs1gydF4y2Ba与活跃肺结核组相比，潜伏肺结核组在第6周时无明显增加(gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba)．的表达无明显变化gydF4y2Batgs3gydF4y2Ba潜伏结核病组和活动性结核病组感染4周和6周后(数据未显示)。gydF4y2Ba

3.4潜伏感染小鼠糖尿病的发生gydF4y2Ba

最初，我们试图用多种低剂量的链脲佐菌素在潜伏感染的小鼠中建立糖尿病，并测量血糖水平。然而，潜伏感染动物的糖尿病不能建立，因为血糖水平低于200毫克/分升，直到第7周的链脲佐菌素治疗剂量(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．因此，在第一次链脲佐菌素治疗的第7周，对这些动物给予了另一单次高剂量的链脲佐菌素，并在第8周发现潜伏结核病组动物成功地建立了糖尿病，因为发现血糖水平大于200 mg/dl (gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．此外，潜伏结核病和糖尿病动物的胰腺组织在第9周(糖尿病发生后2周)和第13周(糖尿病发生后6周)出现炎症。朗格汉斯岛密集发炎，细胞减少，坏死，细胞混杂(gydF4y2Ba补充图1B, DgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.5基质金属蛋白酶表达分析gydF4y2Ba

在潜伏感染小鼠中建立糖尿病后，将动物分为三组，即组i(仅潜伏结核病)、组ii(潜伏结核病合并糖尿病)和组iii(潜伏结核病合并免疫抑制)。糖尿病发生两周后，即第9周，表达gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba与i组相比，ii组表达明显下调，而iii组表达无明显变化(gydF4y2Ba补充图2AgydF4y2Ba)．基因表达未见明显变化gydF4y2Bammp-2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bammp-9gydF4y2Ba第二组和第三组与第一组比较(数据未显示)。在糖尿病发展6周后，即第13周，观察到的表达增加gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba，但增加不显著(gydF4y2Ba补充图2BgydF4y2Ba)．的表达未见明显变化gydF4y2Bammp-2gydF4y2Ba而且gydF4y2Bammp-9gydF4y2Ba分别位于- i、-II和-III组(数据未显示)。因此，表达的增加gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba在糖尿病组合并感染潜伏性结核病中观察到，尽管增加不显著。同时测定动物血清中MMP-1、MMP-2、MMP-9的水平。第9周，在i组、-II组和-III组之间，MMP-1、MMP-2和MMP-9水平没有明显变化(数据未显示)。第13周时，与i组和-II组相比，iii组MMP-1水平显著升高。与i组相比，ii组MMP-1和MMP-2水平显著降低(gydF4y2Ba补充图2C, DgydF4y2Ba)．两组间MMP-9水平相同。在组iii中，MMP-9水平明显高于组ii (gydF4y2Ba补充图2EgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.6血液中细胞因子水平gydF4y2Ba

第9周时，i组TNF-α水平较高，但增加不显著。ⅲ组IL-10、IFN-γ、IL-4、IL-17水平较对照组、ⅰ组和ⅱ组明显升高，ⅰ组和ⅱ组之间无变化(数据未显示)。与i组相比，ii组IL-6水平明显降低(gydF4y2Ba补充图3AgydF4y2Ba)．各组中IL-2和TNF-α水平未见明显变化(数据未显示)。第13周时，各组中IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17水平均未见明显变化(数据未显示)。与对照组、组i和组ii相比，组iii的IL-2和IL-6水平显著降低(gydF4y2Ba补充图3B, CgydF4y2Ba)．与i组相比，iii组IL-4水平显著升高，但其他组间IL-4水平无变化(gydF4y2Ba补充图3DgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.7高糖条件影响巨噬细胞细菌清除效率gydF4y2Ba

在THP-1细胞感染的活性和潜伏培养gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2BaH37Rv，在第0天和第1天，与5.5 mM和15 mM葡萄糖浓度相比，在25 mM葡萄糖浓度下，活跃组和潜伏组的平均CFU计数显著增加(gydF4y2Ba图5A、BgydF4y2Ba)．在第3天，活跃组在25 mM葡萄糖下的平均CFU计数与5.5 mM葡萄糖相比显著增加，而潜伏组在15 mM和25 mM葡萄糖浓度下的平均CFU计数与5.5 mM葡萄糖浓度相比显著增加(gydF4y2Ba图5 cgydF4y2Ba)．同样，在第6天，活跃组和潜伏组的平均CFU计数也随着葡萄糖浓度的增加而显著增加(gydF4y2Ba图5 dgydF4y2Ba)．CFU数据表明，随着葡萄糖浓度的增加，活动性和潜伏性感染中巨噬细胞的细菌清除能力下降。gydF4y2Ba

3.8gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba基质金属蛋白酶表达分析gydF4y2Ba

随着葡萄糖浓度的增加，表达gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba在第0天、第1天、第3天、第6天，与未感染组相比，活跃组和潜伏组的基因均有上调。在25 mM葡萄糖浓度下，与未感染组相比，在第0天，活性组的表达上调了21倍，潜伏组上调了约29倍，而在第1天，与未感染组相比，活性组增加了16.7倍，潜伏组增加了19.7倍(gydF4y2Ba图6模拟gydF4y2Ba)．的表达式gydF4y2Bammp-9gydF4y2Ba在25 mM的葡萄糖浓度下，活性组和潜伏组在所有时间点均低于15 mM的葡萄糖浓度，但在高糖条件下，潜伏组在随后的时间点与活性组相比表达显著下调(gydF4y2Ba图7模拟gydF4y2Ba)．在较高的葡萄糖浓度下，基因表达gydF4y2Bammp-2gydF4y2Ba活跃组在较早的时间点显著升高，而在较晚的时间点观察到其下调。然而，在潜伏组中，在第6天25 mM葡萄糖浓度下，与5.5 mM和15 mM葡萄糖浓度相比，表达显著降低(gydF4y2Ba图8模拟gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.9gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba细胞因子分析gydF4y2Ba

在不同葡萄糖浓度存在的不同时间间隔(感染后0小时、6小时、18小时和24小时)下，测定未感染组、活跃组和潜伏组THP-1细胞培养上清液中IL-12、MCP-1、TNF-α和MIP-1α的水平。随着葡萄糖浓度的增加，MCP-1水平在未感染组、活跃组和潜伏组各时间点均下降。与葡萄糖浓度增加的未感染组相比，活跃组MCP-1水平的下降更为剧烈，这进一步解释了随着葡萄糖浓度增加的趋化性降低(gydF4y2Ba补充图4A-DgydF4y2Ba)．随着葡萄糖浓度的增加，活性组和潜伏组的TNF-α水平都非常高(gydF4y2Ba补充图5A-DgydF4y2Ba)．然而，在5.5 mM、15 mM和25 mM葡萄糖组中，MIP-1α和IL-12水平大致相似(数据未显示)。gydF4y2Ba

4讨论gydF4y2Ba

糖尿病被认为是结核病传播的一个促成因素。糖尿病与活动性结核病密切相关，但潜伏性结核病与糖尿病之间的联系尚未被探索。因此，我们建立了小鼠隐性结核模型gydF4y2Ba张等(2009)gydF4y2Ba同时在潜伏期建立后诱发糖尿病，潜伏期建立后通过感染gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba．CFU计数小于10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba并保持稳定，这肯定了潜伏结核病的建立。假定LTBI的细菌负荷≤10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaCFU，因为抗酸涂片的检测下限为10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaCFU /毫升(gydF4y2Ba纽姆伯格等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang et al.， 2009gydF4y2Ba)．组织学研究也支持了潜伏结核模型的建立，因为术后在肺部发现了肉芽肿gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba挑战。这一结果得到了gydF4y2BaDutta et al. (2014)gydF4y2Ba感染后可见肺坏死肉芽肿gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba在先前接种过卡介苗的C3HeB/FeJ小鼠中。低气雾剂感染2周和10周后肉芽肿病变的发展gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba在C57BL/6小鼠的肺部也有报道(gydF4y2BaBotha和Ryffel, 2002gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

α -结晶蛋白在结核杆菌的潜伏或潜伏阶段维持结核杆菌，因此HspX有资格作为潜伏结核感染的潜在生物标志物(gydF4y2Ba穆斯塔法等人，1999gydF4y2Ba；gydF4y2BaBotha和Ryffel, 2002gydF4y2Ba)．在我们的研究中，基因表达gydF4y2BahspXgydF4y2Ba与活动性肺结核组相比，潜伏肺结核组明显上调。这一观察结果与一项研究一致，该研究显示，在潜伏状态下，结核杆菌的HspX水平升高，当恢复指数增长时，其水平反转至正常水平(gydF4y2BaHu et al.， 2006gydF4y2Ba)．众所周知，gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba可以合成或积聚三酰甘油(TG)，从而导致其在应激条件下长期存活或持续或休眠(gydF4y2Ba丹尼尔等人，2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba合成不同的甘油三酯合成酶，这些合成酶负责在不同的应激条件下甘油三酯的积累(gydF4y2BaSirakova等人，2006gydF4y2Ba)．的表达式gydF4y2Batgs1gydF4y2Ba而且gydF4y2Batgs5gydF4y2Ba基因已被观察到在潜伏结核病组中与活跃结核病组相比上调。这一结果得到了一项研究的支持gydF4y2Batgs1gydF4y2Ba基因被发现是TG合成的主要贡献者gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba在缺氧和一氧化氮胁迫条件下生长的培养物(gydF4y2Ba丹尼尔等人，2004年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，在潜伏感染的小鼠中使用多种低剂量的链脲佐菌素诱导糖尿病。Leiter于1982年用C57BL/6小鼠建立了一个多剂量低剂量链霉素诱导的糖尿病模型(gydF4y2Ba莱特,1982gydF4y2Ba)．此后，许多研究人员也使用这种多剂量低剂量模型来发展糖尿病(gydF4y2Ba麦克沃伊等人，1984年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSun et al.， 2005gydF4y2Ba；gydF4y2BaVentura-Sobrevilla等人，2011gydF4y2Ba)．然而，在本研究中，没有使用多剂量低剂量的链脲佐菌素诱导糖尿病，这被认为是由于卡介苗免疫，因为它在预防糖尿病方面具有重要作用。多项研究观察到，在先前接种卡介苗的小鼠中，多次低剂量的链脲佐菌素不会诱发糖尿病(gydF4y2BaBaik et al.， 1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗莎等人，2013年gydF4y2Ba)．因此，另一种高剂量的链脲佐菌素被给予动物。在潜伏感染的小鼠体内成功诱导了糖尿病。gydF4y2Ba

为了了解细胞内分枝杆菌和宿主巨噬细胞之间的对话，在高血糖条件下培养THP-1单核细胞，并感染潜伏和活性培养物gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba因此，研究了高糖条件下巨噬细胞对分枝杆菌的吞噬作用。以THP-1细胞为吞噬细胞模型(gydF4y2BaRanaivomanana等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaRiaz等人，2020年gydF4y2Ba)．正常血糖条件下的CFU计数表明，与活跃杆菌相比，休眠杆菌更好地包含在巨噬细胞中。该数据得到了一项研究的支持，其中巨噬细胞比好氧杆菌更能抑制休眠杆菌的生长(gydF4y2Ba艾奥娜等人，2012gydF4y2Ba)．然而，随着葡萄糖浓度的增加，活动性和潜伏性结核病组的CFU计数在每个时间点与正常葡萄糖条件相比都显著增加。在一项研究中，从糖尿病小鼠中分离出的巨噬细胞减少了细菌的内化和杀伤，也得到了类似的结果(gydF4y2BaAlim等人，2017gydF4y2Ba)．此外，Gomez等人观察到，从糖尿病患者分离的单核细胞摄入量减少gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba与从非糖尿病患者中分离的单核细胞相比(gydF4y2Ba戈麦斯等人，2013gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细胞因子在活动性和潜伏性结核病感染中起着关键作用。Th1细胞因子可以区分潜伏性结核病和活动性结核病，因为它们在LTBI中的水平较高(gydF4y2Ba吴等，2017gydF4y2Ba)．Kumar等人的一项研究发现，潜伏性结核感染和糖尿病共同病理的特征是降低全身Th1细胞因子水平(gydF4y2Ba库马尔等人，2014gydF4y2Ba)．本研究发现，在0 h时，潜伏组TNF-α水平低于活性组。然而，随着时间的增加，在高糖条件下，潜伏组TNF-α水平高于活性组。在潜伏性结核病小鼠模型中，在糖尿病诱导第9周，与单独潜伏性结核病相比，潜伏性结核病合并糖尿病组的TNF-α水平无显著降低;然而，在第13周，两组之间的水平是相当的。该结果与一项研究结果相反，该研究报告，与无糖尿病的潜伏结核病患者相比，潜伏结核病患者和糖尿病患者中1型和17型细胞因子水平降低，同时促炎细胞因子循环水平降低(gydF4y2Ba库马尔和巴布，2017年gydF4y2Ba)．这种差异的可能原因可能是物种差异，因为本研究是在小鼠身上进行的，另一个可能的原因可能是早期的时间点，因为牺牲是在糖尿病建立的第二周(第9周)和第6周(第13周)之后进行的。Th2细胞因子，即IL-4, IL-6, IL-10, IL-13等，抑制Th1反应，从而交叉调节和影响活动性结核病的进展(gydF4y2BaO 'Garra等，2013gydF4y2Ba)．在小鼠模型中，与单纯潜伏结核组相比，潜伏结核合并糖尿病组IL-6和IL-10水平明显降低。该结果得到了一项研究的支持，该研究报告了潜伏感染糖尿病患者和非糖尿病患者之间IL-4、IL-5、IL-6和IL-13水平的差异和IL-10水平的下降(gydF4y2Ba库马尔等人，2014gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

除细胞因子外，还测量了趋化因子水平，即单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)和巨噬细胞炎症蛋白-1a (MIP-1α)。MCP-1在潜伏感染中起着重要作用，主要是通过在感染部位招募白细胞来建立和维持肉芽肿(gydF4y2BaDeshmane等人，2009年gydF4y2Ba)．在本研究中，我们发现活跃组的培养上清液中MCP-1水平较潜伏组和未感染组有所降低，在较高葡萄糖浓度下，活跃组和潜伏组的MCP-1水平均较正常葡萄糖浓度下大幅降低。一项对糖尿病小鼠的研究支持了这一结果gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba，结果显示肺裂解物中MCP-1水平降低，导致树突细胞从肺到淋巴结的迁移延迟(gydF4y2BaVallerskog等人，2010gydF4y2Ba)．趋化因子如MIP-1α， CCL4和CCL5与IFN-γ协同作用，作为促炎趋化因子(gydF4y2BaDorner等人，2002年gydF4y2Ba)．然而，培养上清液中MIP-1α的水平在未感染组、活跃组和潜伏组之间以及正常葡萄糖和高糖状态之间没有观察到变化。该结果得到了一项研究的支持，该研究没有观察到CCL3的分泌和mRNA表达的差异gydF4y2Ba结核分枝杆菌gydF4y2Ba肺外结核患者与肺结核患者之间的感染(gydF4y2BaHasan et al.， 2009gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

ECM在肉芽肿的结构组成中起着至关重要的作用，即白细胞在这种动态环境中的进出(gydF4y2Ba冈萨雷斯-华雷罗等人，2001gydF4y2Ba)．有趣的是，MMPs似乎在肉芽肿形成和肺组织破坏中都起着关键作用。在本研究中，表达的gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba与非糖尿病小鼠相比，潜伏感染糖尿病小鼠的基因在第13周时无明显增加。同样,在gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究，基因表达gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba在高糖浓度下，与活跃组相比，潜伏组显著上调。该结果得到了一项研究的支持，该研究发现活动性肺结核患者的循环MMP-1水平与LTBI患者相比有所升高(gydF4y2BaAndrade等人，2015年gydF4y2Ba)．然而，在第9周时，MMP-1的蛋白质水平没有观察到显著变化，在第13周时，与没有糖尿病的小鼠相比，潜伏感染的糖尿病小鼠血清中MMP-1的水平显著下降。结果可与一项研究相比较，该研究在伴有或不伴有糖尿病的结核病患者的血浆MMP-1水平中未观察到显著差异(gydF4y2BaAndrade等人，2014gydF4y2Ba)．MMP-9的升高与单核细胞和巨噬细胞的募集有关，这对肉芽肿的成熟至关重要(gydF4y2Ba沃克曼等人，2010年gydF4y2Ba)．在本研究中，基因表达gydF4y2Bammp-9gydF4y2Ba在高糖浓度下，THP-1细胞中潜伏组较活跃组明显降低。该结果与一项关于HIV-TB的研究一致，该研究发现，与未感染HIV的结核病患者相比，感染HIV的结核病患者痰中MMP-1、-2、-3和-9的浓度均有所下降(gydF4y2Ba沃克等人，2017gydF4y2Ba)．然而,gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba研究没有显示活跃感染小鼠或潜伏感染小鼠的基因表达或血清MMP-9水平有任何显著差异。该结果得到另一项研究的支持，在患有或不患有糖尿病的结核病患者中，MMP-9的循环水平没有变化(gydF4y2Ba库马尔等人，2018gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

总之，利用动物模型研究潜伏性结核病和糖尿病。虽然过去已经建立了结核病和糖尿病共发病的动物模型，但迄今为止还没有建立潜伏结核病和糖尿病的动物模型。进一步利用该潜伏性结核和糖尿病模型研究糖尿病在潜伏性结核激活中的作用(gydF4y2BaVerma等人，2021年gydF4y2Ba)．此外，糖尿病和高血糖状况导致MCP-1水平下降，MCP-1基因表达增加gydF4y2Ba金属蛋白酶- 1gydF4y2Ba的基因表达降低gydF4y2Bammp-9gydF4y2Ba这些因素共同可能导致肉芽肿形成过程的中断和潜伏性结核感染的激活。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba．进一步的查询可以联系通讯作者。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

该动物研究由机构动物伦理委员会(PGIMER, Chandigarh)审查并批准。89/90/IAEC/616和动物伦理委员会，ICGEB，新德里，参考文献号。ICGEB / IAEC / 02042019 / TACF-PGIMER-16。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

av -作品的构思与设计，数据的获取、分析、解读，主要稿件文字的撰写和图表的准备。MK, PL, ls -数据采集。DA, IV, BR, sb -数据解释。ss -概念和设计的工作，解释数据和实质性修订的工作。所有列出的作者都对该工作做出了实质性的、直接的和智力上的贡献，并批准了其出版。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者非常感谢印度医学研究理事会(印度医学研究理事会)。5/8/5/14/2014/ECD-1和3/1/3 JRF-2015/HRD-LS/20/10882/33)资助这项工作。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

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参考文献gydF4y2Ba