Rhinolophus sinicus病毒研究发现多种新型蚊媒人畜共患病毒

简介

自SARS-CoV-2疫情爆发以来，对蝙蝠携带病毒的研究急剧增加，从蝙蝠身上分离或检测出大量新型病毒(劳拉等人，2022年；Gábor等，2022；凯特和爱德华，2022年)．由于蝙蝠没有明显的感染病毒的临床症状，它们被认为是许多人畜共患病毒的天然宿主(娜塔莉亚等人，2018年)．中国云南省位于四个国家(中国、缅甸、老挝和越南)的交界处。Chao等人，2017；陈睿等，2020)，在这些地区，蝙蝠携带的病毒很容易跨境传播。特别是,Rhinolophus sinicus是这个地区常见的蝙蝠种类(苏珊娜等，2017年)．因此，对特定蝙蝠的病毒监测具有重要的研究用途。为了准确验证有限数量的病毒是否存在，聚合酶链反应(PCR)技术和Western blot技术可能更有用(Micah等人，2021年；Ptasinska等人，2021)．然而，宏基因组测序在发现大量低丰度和未知病毒方面显示出强大的力量(Jenai等人，2019年)．宏基因组测序技术的迅速发展，使病毒鉴定技术突飞猛进(郝明等，2020)．因此，将宏基因组测序应用于蝙蝠，不仅可以用于新型易感病毒的挖掘，还可以有效防止低丰度未知病毒的漏检。

为了更好地评估特定蝙蝠对人类健康的潜在危害，我们进行了这项研究Rhinolophus sinicus为新型易感病毒的诊断、分离和鉴定提供了宝贵的资源。病毒种类丰富，其中包括新型易感病毒Rhinolophus sinicus经转生病毒学技术，产于云南。除CHIKV和Getah病毒的新变种外，还首次分离到日本脑炎病毒(JEV)Rhinolophus sinicus．病毒组的初步研究Rhinolophus sinicus对其他蝙蝠物种的病毒群的鉴定、多样性和监测产生有价值的见解。

材料与方法

蝙蝠收集

在云南省临沧市(北纬23°89′，东经100°09′)，利用雾网对蝙蝠的自然栖息地洞穴进行了采样(图1) 2016年6月至7月。简单地说，在自然栖息地洞穴顶部的蝙蝠受到手电筒光的刺激，掉入预先布置的雾网中。用防咬手套从雾网中救出被困的蝙蝠。使用布袋将蝙蝠单独隔离并运送到实验室设施进行处理。形态学鉴定和Cytb基因鉴定后，采集所有咽拭子Rhinolophus sinicus．将所有咽拭子放入2 ml聚乙烯管中，并将拭子保存液暂时保存在−80°C。涉及动物的研究由温州大学实验动物福利与伦理委员会审核通过。

RNA提取和元病毒测序

试剂、RNA提取方法和元病毒测序已在我们之前的研究中描述(关荣等，2022)．用于元病毒测序的DNA条形码显示在表1．Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与GenBank进行contigs比较，其中E取值≤10e⁵被用于鉴定病毒序列。应用RT-PCR技术，利用特定引物确认病毒序列，并进一步验证元病毒测序结果(表2)．

系统发育分析

用Clustal W 2.0软件对扩增的完整病毒基因与代表性病毒基因进行比较。采用CHIKV基因783 nt的完整C基因序列、GETV基因1266 nt的完整E2基因序列和JEV基因1500 nt的完整E基因序列进行系统发育分析。采用MEGA 7.0最大似然算法构建进化树模型，自举值设置为1000。

病毒分离和鉴定

为了在BHK-21和Vero细胞中分离病毒，细胞在含有8%胎牛血清的培养基(DMEM, HyClone, Logan, UT, USA)中培养。简单地说，将蝙蝠样品研磨液离心，将20 μl上清液加入BHK-21细胞，在37℃下孵育5-7天，直到观察到病毒诱导的细胞病变效应(cpe)。使用JEV- ns1特异性引物检测上清液中的JEV (表2)．采用抗NS1单克隆抗体(Abcam, Cambridge, UK)和酶标兔抗小鼠抗体(Trans, Beijing, China) Western blotting检测NS1蛋白的表达。用负染色电镜观察JEV颗粒，该颗粒由感染BHK-21细胞上清液与6.1%多聚甲醛1:1混合制备，安装在铜网格上，以3%磷钨酸(Duo等人，2022年)．

病毒传代和变异分析

新分离的JEV跨物种传代到Vero细胞，随后在细胞水平上模拟自然感染。具体来说，JEV首先被传递到10^th然后从上清液中提取病毒，接种到Vero细胞中10传代，共20传代。的TCID₅₀在BHK细胞5^th和10^th代病毒和15个Vero细胞^th和20^th采用Reed-Muench法(Krah 1991)．随后，利用MEGA 7.0对上述4个传代的NS1基因进行测序和比较。

统计分析

采用SPSS 26.0统计软件进行统计。t正态性检验后，各组间比较采用-test。每个实验通过设置3个重复，重复3次进行迭代验证。P< 0.05为有统计学意义。

数据可用性

宏基因组测序产生的数据已在GenBank中登记(登录号:;SRR15292018)。扩增病毒序列已存入GenBank，登录号分别为:CHIKV-China/B2016C-1/2/3 (OM799585-OM799587)、CHIKV-China/B2016NS1-1/2 (OM799577-OM799578)、GETV-China/B2016E2-1/2 (OM799568-OM799569)、JEV-China/B2016E-1/2/3/4 (OM799548-OM799551)、JEV-China/B2016NS1-1/2/3/4 (OM799558-OM799561)。

结果

蝙蝠virome

来自29只蝙蝠的29个咽拭子被归为Rhinolophus sinicus样本用于元病毒测序。序列用3.67 × 10进行病毒排序⁷读取(平均长度为186.52 nt)，包括已知和未分类的病毒。许多蝙蝠病毒和未知或未分类的病毒已被确认具有感染人类和动物的潜在风险。不同病毒分类的病毒读数丰度不同。共检出22个病毒科(图2)，其中黄而且Togaviridae，由已知的重要人类病原体组成Rhinolophus sinicus．转生病毒分析结果表明Rhinolophus sinicus携带大量潜在的人畜共患病毒共获得40351个contigsdDe新生组装。一些有吸引力的组装contigs显示出与病毒序列的相似性黄而且Togaviridae其中，GETV-like contigs 37条，CHIKV-like contigs 84条，JEV-like contigs 206条，读取覆盖率分别为27× (223-816 nt)、32× (238-1035 nt)和38× (255-1841 nt)。此外，与已知GETV、CHIKV和JEV序列的nt同源性分别为83.1 ~ 92.5%、82.7 ~ 94.1%和84.0 ~ 93.6%。随后，用设计的病毒特异性引物扩增检测到的病毒样序列(表2)，从而验证了元病毒测序结果。

chikv样序列的验证

本研究鉴定的chikv样片段通过PCR扩增，克隆到pMD19-T (Takara, Tokyo, Japan)中并测序。结果表明，两个NS1基因序列长度均为1605个核苷酸(CHIKV-China/B2016NS1-1/2)，其中nt同源性为95.8%，aa同源性为91.2%。获得3个783 bp片段(CHIKV-China/B2016C-1/2/3)，其中C基因nt和aa序列的相似性分别为89.5-93.7%和89.5-93.7%。BLASTN分析结果表明，CHIKV- china /B2016C-2/3与2007年分离的泰国CHIKV的nt和aa同源性最高，分别为96.7%和93.1%;CHIKV- china /B2016C-1与2007年分离的意大利CHIKV的nt和aa同源性最高，分别为96.8%和92.3%，分别为ECS非洲基因型(图3)．

getv类序列的验证

在pMD19-T载体(Takara, Tokyo, Japan)中克隆getv样片段的RT-PCR产物，并进行测序。获得2个1266 bp片段(GETV-China/B2016E2-1/2)。分离株E2基因nn和aa序列的同源性分别为~96.9%和~95.5%。BLASTN结果显示，扩增后的GETV样片段与2017年从菌丝中分离的泰国GETV E2基因同源性最高(nt为94.2%，aa为93.8%)(图4)．

类jev序列的验证

在pMD19-T载体(Takara, Tokyo, Japan)中克隆jev样基因扩增片段，并进行测序。测序结果显示，该序列共4个1500 bp片段(JEV-China/B2016E-1/2/3/4)， nt序列同源性为92.9 ~ 97.1%，aa序列同源性为85.6 ~ 94.4%。在1056 bp的4个片段(JEV-China/B2016NS1-1/2/3/4)中，核苷酸水平的同源性为95.1 ~ 96.3%，氨基酸水平的同源性为87.2 ~ 91.2%。BLASTN分析结果表明，与1988年分离的韩国JEV基因型同源性最高(nt为91.3%，aa为85.6%)，属于基因型III型JEV (图5)．

乙型脑炎病毒分离鉴定

成功地从经验证的病毒中分离出乙脑病毒。新分离的JEV经CPE验证(图6)、基因层面的聚合酶链反应(图6 b)和蛋白质水平的Western blotting (图6 c)，结果均为阳性。我们用负电子显微镜观察病毒颗粒，便于更直观地验证新分离的JEV。病毒呈直径30-40纳米的圆形，表面有细小的突起(图6 d)．

连续传代后JEV的变异性

JEV-China/B2016-1感染滴度值为5分之一^th代BHK细胞为5.26 × 10^3.TCID₅₀/0.1毫升，10毫升^th代数为4.67 × 10^3.TCID₅₀10^th代与5代相比^th世代，但差异并不显著，P> 0.05 (t以及)。有趣的是，在Vero细胞中，第15代的感染滴度为^th和20^th为8.33 × 10^3.TCID₅₀/0.1 ml和1.13 × 10⁴TCID₅₀/0.1 ml，两者在第5代的传染性均显著高于BHK^th和10^th，P< 0.05 (t以及)。因此，可以推测，跨物种传播可能是病毒传染性增强的原因之一。进一步的序列分析表明，这15例患者E基因的关键氨基酸位点(E138D)均发生突变^th和20^th代与5^th和10^th一代又一代。

讨论

蝙蝠是许多人畜共患病毒的载体和中间宿主，对人类生命和健康构成重大威胁(2022年传承,；Sarah等人，2022年；伊恩等人，2020年)．的Rhinolophus sinicus是中国云南省常见的一种蝙蝠(Hayes等人，2019年；林苗等，2022)．几项研究已经证实了这一点Rhinolophus sinicus可传播多种重要病毒，包括SARS-CoV-2 (洪亮等，2021)、乙型肝炎病毒(Bornali等人，2021年)，以及波卡波病毒(苏珊娜等人，2016年；苏珊娜等，2017年)．在我们的研究中，我们对病毒谱进行了初步探索Rhinolophus sinicus利用转生病毒技术，在云南发现了一组丰富的病毒序列，属于22个病毒科。这项研究为关注在该地区流行的常见蝙蝠物种的病毒谱宽度提供了支持。此外，它还表明了开展针对生物媒介的监测的重要性。

转生病毒组结果显示，CHIKV和Getah病毒同时被扩增Rhinolophus sinicus说明CHIKV和Getah病毒在同一蝙蝠种和地理位置存在潜在的传播和流行，存在共同传播的可能性。有趣的是，JEV被成功分离。据我们所知，这是分离出乙脑病毒的第一份报告Rhinolophus sinicus．这表明，脑炎病毒有可能扩大易感蝙蝠的种类，从而扩大流行的地理范围。对jev敏感的蝙蝠的物种范围背后的机制需要进一步研究。

JEV的变异分析表明，与5^th和10^th第15代和第20代E基因在一个关键氨基酸位点(138)发生突变。据报道，E-138突变会显著改变病毒的传染性(Ni等，1994)．在本研究中，与第5代和第10代相比，第15代和第20代的传染性都有显著增强，这意味着JEV可能能够跨物种屏障传播，从而增强传染性。

我们的研究显示了潜在的病毒谱Rhinolophus sinicus在这个地区。然而，具体的病毒格局Rhinolophus sinicus没有很好的确立。由于样本量和采样范围的限制，还有很多潜在的病毒尚未被挖掘出来。特定蝙蝠物种的潜在病毒需要进一步研究来证实。总之，我们的研究为特定蝙蝠传播的病毒谱以及发现它们新的易感病毒提供了宝贵的见解。对生物载体病毒的分子流行病学研究具有重要的参考价值。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和登录号可以在article/中找到补充材料．

道德声明

本实验经温州大学实验动物福利伦理委员会审核通过。

作者的贡献

PX和NL构思并设计了实验。CP、DZ、CL、HZ进行实验。PX和YL对数据进行分析。CL贡献了试剂/材料/分析工具。PX和NL撰写了论文。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

资金

国家自然科学基金项目(no . 32002312)、浙江省自然科学基金项目(no . LQ21H160001)、浙江省温州市科技计划项目(no . Y20210080、Y2020103)资助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fcimb.2022.960507/full#supplementary-material

参考文献