群体猝灭酶ai20j修饰在体外牙周生物膜形成

简介

大多数口腔细菌被包裹在宿主和细菌来源的细胞外聚合物基质中，附着在牙齿表面形成生物膜，与浮游细胞相比，表现出不同的表型(Donlan和Costerton, 2002；沼泽,2006)．两种主要的口腔细菌疾病，龋齿和牙周病，是由于局部环境条件的改变，导致口腔微生物群的生态平衡丧失，最终导致致病生物膜(沼泽,1994；沼泽,2003；Belda-Ferre等人，2012；Hajishengallis等人，2012)．因此，不是单一的病原体，而是居住在口腔中的整个群落及其功能活动是导致这些疾病进展的原因(Duran-Pinedo和Frias-Lopez, 2015；约斯特等，2015年)．在这种情况下，通过调节微生物相互作用来干扰生物膜形成过程已被提出作为预防和治疗口腔多微生物疾病的相关策略(Simón-Soro和Mira, 2015)．

细胞密度依赖的基因调控过程，称为群体感应(QS)，已被提出作为发展策略抑制口腔生物膜形成的潜在目标(Muras等，2018b；Muras和Otero, 2020年；Muras等，2020b)．在研究最多的三个QS信号中，革兰氏阳性自诱导肽已在各种口腔链球菌中报道，而通用自诱导肽-2 (AI-2)已在革兰氏阳性和革兰氏阴性口腔病原体中发现(惠特克等人，1996；弗里亚斯等人，2001；Burgess等人，2002年；Kolenbrander等人，2006)．的N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs)是革兰氏阴性菌通常使用的QS信号，传统上被认为与口腔无关，因为过去在口腔病原体纯培养物中检测其产生缺乏成功(惠特克等人，1996；弗里亚斯等人，2001；Burgess等人，2002年；Jakubovics和Kolenbrander, 2010；Huang等，2011；郭等，2014)．尽管如此，在唾液样本和拔牙中发现了多种AHLs，包括C₈奥软,C₁₄-HSL和C₁₈奥软(Kumari等人，2006年；Muras等，2020b)．此外，已从牙本质龋中分离出产生ahl的细菌菌株(Goh等人，2014；Goh等人，2016)和人类舌面(Yin等，2012a；Yin等，2012b；Chen等，2013)．先前的研究观察到AHLs和AHL类似物改变了蛋白质的表达Porphyromonas gingivalis（Komiya-Ito等人，2006；朝日等，2010年)及OC的制作₈-HSL已在这种牙周病原体的纯培养物中被描述(Muras等，2020b)．此外，最近一项关于外源AHLs对在体外口腔生物膜证明，某些AHLs影响细菌乳酸生产和蛋白酶活性，添加C₆-HSL将生物膜的微生物组成转向牙周细菌剖面(Muras等人，2020a)．此外，预测与高丝氨酸内酯生物合成有关的细菌基因簇已在龋齿和牙周炎患者的细菌基因组中被描述(阿莱蒂等人，2019年)．总之，这些结果表明，AHLs在口腔生物膜中细胞间通讯的当前范式中所确立的作用应该被修正(Muras和Otero, 2020年；Muras等，2020b，Muras等，2022)．确认AHLs作为QS信号在口腔生物膜形成中的作用，将为预防和治疗口腔疾病提供广泛的可能性。

在自然环境中存在不同的干扰QS系统的策略。这些策略的使用在自然和在体外条件已成功地减少单一物种的生物膜质量(Sun等，2021年)和多物种生物膜(Jo等人，2016；Huang等，2019；施瓦布等人，2019年；Jeong等人，2020年；Muras等，2020b；Muras等，2022)．使用这些策略比使用抗生素更不可能促进抗菌素耐药性，因为它们不会直接干扰细菌生长(罗梅罗等人，2014；Mayer et al.， 2015；罗梅罗等人，2015年，Mayer等，2018；García-Contreras等，2016；Guendouze等人，2017；Muras等，2018b)．QS信号的酶促失活，也称为quorum quenching (QQ)，已被深入研究(罗梅罗等人，2015年)，尤其是能够破坏ahl的酶(董等，2001)．值得注意的是，QQ活性对AHLs的存在已经在唾液和牙菌斑样本的可培养细菌中被描述(Muras等，2020b)．ai20j是一种广谱、高活性的ahl内酯酶，属于金属-内酰胺酶家族(Mayer et al.， 2015)，在控制革兰氏阴性致病菌中几种ahl调节的表型方面取得了有趣的结果(Mayer et al.， 2015，Mayer等，2018；Mayer等，2020年)和减少口腔生物膜的生长在体外从唾液和六种口腔病原体的混合生物膜(Muras等，2020b)．

在本研究中，我们评估了ai20j对口腔多微生物生物膜生成的影响在体外使用来自健康捐赠者和帕金森病患者的样本。选择龈下样本接种生物膜，因为它们比唾液样本更能代表牙周菌群。在体外生物膜的特点是总生物量和微生物多样性在酶的存在。此外，研究了龈上鸟枪宏基因组中存在的QS和qqq相关序列。

材料与方法

主题招聘

初始组17例患者(女性/男性:11/6;平均年龄:48±13岁)，另外35例(女性/男性:19/16;60±15岁)分别于2019年12月至2020年3月和2020年6月至2022年5月期间从圣地亚哥德孔波斯特拉大学医学和牙科学院的大学牙科诊所招募。在第一组患者中(n= 17)，取唾液和龈下样本优化生物膜生成条件(见2.5节)。在第二组患者中(n= 35)，仅取龈下样本，这是第一组优化的结果。口腔健康状况根据2017年牙周和种植体周围疾病分类世界研讨会论文集进行评估(Papapanou等人，2018；托内蒂等人，2018年) (补充表S1、S2)．采样前一个月的抗生素治疗是本研究设定的排除标准。

道德声明

加利西亚临床调查伦理委员会(Xunta de Galicia)批准了2017年7月修订的患者招募和样本处理调查规程2009/319。本研究所有参与者均获得书面知情同意。

ahl -内酯酶ai20j的制备与纯化

QQ酶ai20j，一种从QQ海洋细菌中获得的内酯酶Tenacibaculum20 j (罗梅罗等人，2011年；罗梅罗等人，2014)，所得结果如上文所述(Mayer等，2018)．简单地说，通过向重组悬浮液中添加1mm异丙基- d -硫代半乳糖吡喃草苷诱导蛋白表达大肠杆菌BL21(DE3)pLysS含ai20j。超声裂解诱导细胞，用His GraviTrap亲和柱蛋白纯化试剂盒(GE Healthcare)纯化ai20j。纯化缓冲溶液中剩余的咪唑通过d管(MWCO 10 kDa) (Merck KGaA, Darmstadt, DE)在无菌milliq水中透析除去。适当时，将纯化的ai20j以20µg mL的工作浓度加入生物膜中^－1，对应于降解10µM C所需纯化酶最低浓度的10倍₆用常规显色法验证纯化Aii20J的ahl降解能力和生物膜上清液中剩余的Aii20J活性(见下面的“群体猝灭活性固体板测定”部分)。

固体板的群体猝灭活性测定

采用固体板法检测ai20j在生物膜上清液中纯化和总孵育时间后的AHL降解活性。唾液样本中的QQ活性也采用相同的方法进行评估。使用AHL生物传感器菌株进行检测色素细菌subtsugaeCV026用于短链AHLs (McClean等人，1997年；哈里森和索比，2020年),c . violaceumVIR07用于长链AHLs (Morohoshi et al.， 2008)．样品与C₆-HSL(10µM)或C₁₂-HSL(10µM) (Sigma-Aldrich, Merck)。这些ahl通常分别作为短链ahl和长链ahl的代表(Muras等，2020b)．PBS pH为6.5,AHL (10 μM)为阴性对照(Muras等，2018b)．唾液样本的pH值是事先检查的，当pH值超过7时进行酸化，以避免在高pH值下AHLs的内酯环自发打开(耶茨等人，2002年)．所有混合物在22°C下孵育24小时。

ahl的存在是通过将相应的生物传感器和柔软的Luria-Bertani (LB)(0.8%琼脂)以1:4的比例在LB琼脂板上添加过夜培养的混合物来检测的。在琼脂上制造孔，每个孔中放置100 μ L样品。在30°C下孵育24 h。与阴性对照组周围观察到的紫色晕晕相反，紫色色素沉着的缺乏表明QS抑制。该试验允许以相当精确的方式识别QS抑制是由于酶降解还是由于QS抑制分子的存在。酶降解通常表现为缺乏色素晕或相对于阴性对照的直径减小的晕。另一方面，随着AHL加入到样品中，QS抑制剂扩散;两种成分的效价不同，其中AHL通常以更高的效价存在，导致内部无色素晕圈被外部紫色晕圈包围(Muras等，2018a)．此外，该试验允许区分QS抑制(观察生长浑浊晕圈)和细胞生长抑制(观察透明晕圈)(Muras等，2018a)．

样本收集，生物膜生成，生物膜定量

最初的生物膜收集来自7名健康捐赠者(代码H1 - H7)和10名PD患者(代码P1 - P10)的唾液和龈下样本(补充表S1)并立即培养。唾液样本在无菌试管中收集，并在每种培养基中稀释1:100 (Fernandez y Mostajo等人，2017；Muras等人，2020a)．龈下样本包括龈沟液(GCF)，将16个无菌纸点(每个口象限4个)插入龈沟1分钟。在PD患者中，样本取自牙周袋的最深处。样品在1ml巯基乙酸酯肉汤(Merck)中运输，用相应的培养基进行1:53稀释(米拉等人，2019年)．在最初的收集中，唾液和龈下样本分别接种于1)有氧条件下的脑心输液(BHI) (PanReac, Barcelona, ES)和2)添加维生素K1 (0.1 mg L)的Schaedler培养基中^－1) (SCH-K1) (Conda Pronadisa, Madrid, ES)在厌氧条件下。在接种瞬间加入ai20j酶，最终浓度为20µg mL^－1．阴性对照组接受无菌milliq水。纯化的ai20j(大小为35 kDa)通过分子量截断为10 kDa的Centricon(默克公司)过滤，以去除酶，并使用剩余的可溶性部分作为额外对照(补充图S7)．还测试了热灭活的ai20j(121°C 90 min)，该ai20j不保留ahl降解活性(补充图S7)．生物膜在37℃下生长24 h。

在体外口腔生物膜(n= 17)是使用上述培养基和条件生成的，并使用两种不同的方法并行测量。第一个是对阿姆斯特丹主动依恋模型(AAA模型)的修改(Exterkate等人，2010年；Muras等人，2020a)．简单地说，12孔细胞培养板(VWR)的盖子被定制的不锈钢盖子所取代，上面连接了12根硅胶管，允许插入玻璃盖(18 × 18毫米)(Menzel Gläser, Braunschweig, DE)作为生物膜形成的基质。玻璃盖垂直放入培养板孔中，填满3 mL相应调整的接种液(Muras等，2020b)，促使细菌细胞积极附着在它们的表面。最终浓度为20µg mL加入ai20j^－1．AAA模型允许在12小时内通过将带有玻璃盖的盖子转移到一个新盘子上来刷新培养基和处理。当需要时，使用厌氧罐(OXOID, Basingstoke, GB)和AnaeroGen 2.5L大气生成系统(OXOID)实现厌氧。用结晶紫(CV)法对生物膜进行定量。孵育后，盖片在新鲜板中干燥，生物膜用2 mL 0.04% CV溶液(蒸馏水中v/v) (Panreac)染色20分钟。多余的染料用蒸馏水洗涤两次就除去了。在释放CV进行量化之前，拍照对生物膜进行视觉检查。当两名独立观察者发现对照和ai20j处理的生物膜在视觉上可区分时，生物膜被认为具有宏观差异(补充图S2)．最后，将与生物膜结合的CV稀释在3ml 33%的乙酸溶液中(v/v在蒸馏水中)(Scharlab, Barcelona, ES)。在590 nm处测定样品吸光度。所有实验均重复三次。

第二种方法是xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)系统(ACEA, Biosciences Inc.， San Diego, US) (Muras等，2018b，Muras等，2020b；米拉等人，2019年)．e -plate 16 (ACEA, Biosciences Inc.)分别用100 μL相应的培养基和80 μL唾液/龈下样本接种。对内酯酶处理的样品，取20 μL ai20j(至终浓度为20µg mL^－1)，对照井中加入20 μL无菌milliq水。当需要厌氧气氛时，添加无菌石蜡覆盖层。xCELLigence测量细胞附着在e板底部时阻抗的变化，该软件计算细胞指数(CI)值，与生物膜形成的数量相对应。所有实验均重复三次。

然后使用龈下样本进行更广泛的培养条件筛选(n= 35)。按照前面描述的方法收集样本，并在AAA模型中培养。4例初始患者(H8、G1、P11和P12)的培养条件(补充表S2)分别为好氧BHI、厌氧BHI、厌氧SCH-K1、半限定McBain培养基(麦克贝恩等人，2005年；Janus等，2015)的厌氧症。10名健康供体(H9 - H18)、2名牙龈炎患者(G2, G3)和19名牙周炎患者(P13 - P31)的后续生物膜(补充表S2)分别接种bhi -厌氧症和mcbain -厌氧症。生物膜在37°C下生长24小时，培养基和12小时的处理刷新。生物膜定量按照前面所述进行。

共聚焦激光扫描显微术

使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步观察AAA模型中mcbain -厌氧症患者P30和P31的龈下来源生物膜，以比较对照组和ai20j处理的生物膜。用两种核酸染料对玻璃盖上形成的生物膜进行染色;SYTO 9是膜透性的，可进入所有细菌细胞;碘化啶(PI)只进入膜损伤细胞(LIVE/DEAD BacLight bacteria Viability Kit, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US)。将SYTO 9和PI按1:1的比例混合，然后在无菌PBS (pH 7.4)中稀释150倍制备染色液。每层生物膜分别注入约50 μL染色液。样品在室温下保存15分钟并避光，然后使用徕卡Stellaris 8 FALCON共聚焦显微镜进行图像采集，物镜为HC PL APO CS2 20x/0.75 Dry (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, DE)。SYTO 9使用499 nm激光激发和504 - 555 nm发射波段，PI使用561 nm激发激光和570 - 675 nm发射波段观察生物膜。照片是在20倍放大下拍摄的。为了计算生物膜覆盖的面积，每种条件随机选择8个字段，并使用Leica Application Suite X软件(LAS X v.3.7.4, Leica Microsystems)进行处理。从SYTO 9和PI通道发射光子的面积除以总视场。 The results are expressed in percentage of the area covered by biofilm structures in each condition.

生物膜采集和DNA提取

用于测序分析的基因组DNA来自于在AAA模型中生长的生物膜。通过将玻璃盖转移到5ml无菌PBS中收集生物膜。然后，对它们进行15分钟的超声波处理，以分散生物量。按照制造商的说明，使用“DNeasy PowerBiofilm Kit”(Qiagen, Germantown, US)进行基因组DNA提取。简单地说，生物膜受到化学和机械裂解。去除蛋白质和抑制剂，然后ph驱动沉淀大的不溶性大分子。用二氧化硅自旋过滤柱捕获总基因组DNA，最后洗脱。DNA浓度使用NanoDrop (Thermo Scientific)测量。

文库制备和微生物组分析

微生物基因组DNA (5 ngµL^－1在10 mM Tris pH 8.5)用于扩增16S rRNA基因V3-V4高变区。经过尺寸验证后，文库按照供应商的协议(Illumina, Inc.)制备，在PhiX池化文库上得到的11 pM 20%的测序结果在MiSeq测序仪上使用2x300碱基对对端运行(MiSeq Reagent kit V3(MS-102-3001))进行测序。

使用prinseq-lite程序进行质量评估(施米德和爱德华兹，2011年)．管道DADA2 (Callahan等人，2016)对扩增子序列进行分析，聚类为扩增子序列变体，利用SILVA数据库(Quast等人，2013年)．计算及统计均在rrstatistics (R核心团队，2022年)使用针织，针织，markdown (Allaire et al.， 2014；蒂格,2014；谢,2014)、生物串和纯素(Oksanen等人，2017)．用包Phyloseq和DESeq2 (《爱等人》，2014)．用高于2的log2倍变化阈值过滤差异，并根据其基础平均值，丢弃较低的四分位数。Beta多样性是通过使用Phyloseq包加权UniFrac距离的PCoA进行研究的。根据研究变量分组的样本之间的差异，使用包素食的阿多尼斯函数中实现的PERMANOVA检验进行分析(Oksanen等人，2017)．Alpha多样性分析采用R包Phyloseq (McMurdie和Holmes, 2013)，使用Chao1指数和Shannon和Simpson指数作为丰富度和多样性估计量。在选择包含在包统计中的参数或非参数检验之前，评估了数据的正态性和同方差(R核心团队，2022年)．

细菌定量PCR

细菌总数，p . gingivalis,p . endodontalis通过定量PCR (qPCR)在LightCycler 480 II Thermocycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, DE)中对来自牙周炎患者的33个龈下生物膜中存在并在mcbin -厌氧生长的AAA模型中进行评估。反应在20 μL的培养液中进行，培养液中含有LightCycler 480 II Probes Master (Roche Diagnostics GmbH)、每种细菌的特定引物和探针或真细菌(Eubacteria)的通用引物(补充表S3)， 5 μL分离的DNA和PCR级无菌水。阳性和阴性对照和样品反应进行了两次。样品进行95°C - 10 min的初始扩增循环，然后95°C - 10 s的40个循环，60°C - 30 s的退火和72°C - 1 s的扩展。过境点(C)_P)用LightCycler 480 Software 1.5 (Roche Diagnostics GmbH)计算，采用二阶导数极大值法。交叉点值然后外推到菌落形成单位(cfu)使用标准曲线，描述Àlvarez等人(2013)．简单地说，为了获得标准曲线，首先在三个生物重复中产生纯细菌培养物。当培养达到对数期时，进行CFU电镀，同时进行DNA提取以进行qPCR扩增，均采用10倍连续稀释。然后，绘制cfu /mL与C的相关曲线_P用qPCR软件生成值。R²从不同的生物重复中获得的曲线值作为质量标准，以考虑相关性的可靠性(Àlvarez等，2013)．

AHL的提取和制备用于HPLC-MS分析

为了检测未处理生物膜中低浓度AHLs的存在，提取生物膜培养物的上清液，浓缩极性分子，并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析。将AAA模型的玻璃盖片与废培养基一起转移到新鲜管(VWR)中，并超声处理15分钟以分散生物质。然后用HCl 1m酸化样品，以诱导内酯环的环状(耶茨等人，2002年)．样品依次用两卷乙酸乙酯(Scharlab)和两卷二氯甲烷(Scharlab) (Muras等人，2020a)．有机相在Rotavapor-R中蒸发(Büchi)，干样品在1ml乙腈中重悬(Merck)，并在-20°C保存，直到用HPLC-MS定量。新鲜培养基也按相同步骤提取。

HPLC- ms分析在色谱技术和水分析单元(A大学Coruña, ES)使用HPLC 1100系列(安捷伦)进行。质谱仪(MS)使用API 4000三重四极杆(应用生物系统公司)。运行标准合成的ahl(有或没有氧和羟基取代，酰基链上的碳从4到18个不等)得到了校准曲线。使用校准曲线定量样品中的AHLs。用标准合成AHLs的洗脱时间和分子光谱来鉴定样品中存在的AHLs (罗梅罗等人，2010年；Mayer等，2018)．

口腔宏基因组群体相关序列的研究

通过手动搜索NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的注释核苷酸和氨基酸序列与证明的活性。所选QS序列包含AHL合成酶(n= 36)， AHL受体(n= 28)， AI-2合成酶LuxS (n= 11)和AI-2受体(n= 3). PQS合成酶(n= 2)和PQS受体(n= 1)，也包括在内。QS“方言”系统也被选择，包括非ahl合成酶(n= 5)和受体(n= 10)在分析。所选QQ序列包括三种酶:内酯酶(n= 63)，酰基酶(n= 20)和对氧磷酶(n= 3).利用Expasy软件将核苷酸序列转化为氨基酸序列(Duvaud等人，2021)．

最初的182个序列用CD-HIT (Fu等，2012)，建立最少70%的长度覆盖和40%的序列标识，以减少冗余。即使有几个蛋白质序列具有相同的注释，但也有一些被聚成不同的蛋白质家族，这反映了进化上的分歧，如LuxS序列被聚成四组，其代表性的类型序列对应于哈韦氏弧菌化脓性链球菌苏云金芽孢杆菌,拟杆菌heparinolyticus．182个序列按功能聚类和分组，得到78个蛋白质家族。每个蛋白质家族序列的登录号可在补充表S4．

然后，为每个蛋白质家族选择的代表性序列用于查询来自人类微生物组计划(HMP)的118个鸟枪口服宏基因组(人类微生物组项目联盟，2012a；人类微生物组工程，2012b) (https://portal.hmpdacc.org/) (补充表S5)和取自西班牙收藏的7个口腔宏基因组(Belda-Ferre等人，2012)．这125个宏基因组对应于龈上斑块样本。由于缺乏HMP中牙龈下位点的宏基因组数据，因此产生了一个“合成的”牙龈下宏基因组(补充表S6)．为了选择包含在这个宏基因组中的信息，从HMP中可用的龈下和龈上位点的16S rRNA基因测序数据(人类微生物组工程，2012b)进行了调查。首先，比较存在于龈下和龈上壁龛的细菌属的相对丰度，以评估两者之间的相似性(补充表S7)．然后选取丰度值大于1%的龈下部位细菌属，检索每个属中最具代表性的种基因组(补充表S6)生成合成的龈下宏基因组。

序列搜索使用DIAMOND (Buchfink等人，2021)，最少科目覆盖率为70%，电子价值分界点为1e-10。对齐结果使用内部脚本(可在https://github.com/genomica-fciencias-unam/tabla_genes)．统计分析使用R (R核心团队，2022年)与phyloseq (McMurdie和Holmes, 2013)， ggplot2 (韦翰,2009)，素食主义者(Oksanen等人，2017)，以及tydiversity (维克汉姆等人，2019年)包。所有R程序都可以作为jupyter笔记本在补充材料．

统计分析

使用Prism 8.3.0进行统计分析(GraphPad, San Diego, CA, USA，www.graphpad.com)或R (R核心团队，2022年)．双尾学生的t -测试(在文本中称为t -对正态分布的样品进行方差分析。对非正态分布样本进行Mann-Whitney检验，比较同一供体内对照和ai20j处理的生物膜质量和细胞指数值。进行了Wilcoxon配对符号秩检验(在文本中称为Wilcoxon检验)，以评估在酶存在时生物膜减少和在酶存在时生物膜增加之间差异的显著性，受试者按其口腔健康状况分组。定量PCR结果采用独立样本的Mann-Whitney检验进行分析。所有统计分析均有显著差异，α = 0.05。

结果

样品来源和培养系统对在体外口腔生物膜对ahl -内酯酶ai20j的反应

为了评估ai20j在预防口腔疾病方面的潜在用途，首先使用两种培养技术探索了该酶的生物膜抑制能力:AAA模型(Exterkate等人，2010年；Muras等人，2020a)和xCELLigence系统(ACEA, Biosciences Inc.)。AAA模型由垂直放置的玻璃罩组装而成，细菌细胞只能以活跃的方式附着在玻璃罩上。AAA模型允许培养基的更新，进一步促进生物膜的形成。此外，在孵育时间结束时，基质可以很容易地进行定量分析，显微镜观察和DNA提取，允许对生物膜进行完整的表征，这是由单独使用CV试验所阻碍的(Muras等，2018b)．另一方面，xCELLigence系统是一种基于细胞指数(CI)值的实时监测技术，该值与在改良培养板底部形成的生物膜数量相关(米拉等人，2019年)．该系统已用于监测口腔生物膜的形成(米拉等人，2019年)，但不适用于检测生物膜的结构差异。两种系统分别接种了17名受试者的唾液和龈下样本(补充表S1)．样品在BHI培养基中有氧生长，在SCH-K1中厌氧生长。两种培养基都含有较高的蛋白质负荷，但Schaedler培养基有额外的成分，有利于厌氧菌的生长，如半胱氨酸和血红素，除了商业配方，维生素K1 (穆雷,1978；Marsh等人，2016)．使用好氧或厌氧环境的目的是评估酶对在这种条件下生长的细菌群落的影响是否会有所不同。我们观察到样本间生物膜形成能力的重要差异(补充图S3, S4)，在AAA模型中生长的健康组和PD组之间生物量值没有显著差异(t -测试)(补充图S3)．在xCELLigence系统中，在BHI中生长的牙龈下生物膜和SCH-K1中生长的唾液生物膜中，PD样本的细胞指数显著高于健康样本(t -测试)(补充图S4A, D)．此外，在对照条件下获得的初始生物膜质量与任何培养系统中对ai20j的敏感性无关(Pearson r)(数据未显示)。关于Aii20J对生物膜形成的影响，在AAA模型中培养时，龈下生物膜在两种培养基中都比唾液生物膜对酶更敏感(图1)．根据患者的口腔健康状况，对酶对龈下生物膜的影响进行了分析，结果显示，在BHI中生长的pd衍生生物膜显著减少，而在ch - k1中生长的健康和pd衍生生物膜均显著减少(Wilcoxon检验)(图1A、B)．对于AAA模型中在相同条件下培养的唾液生物膜，只有在schc - k1中培养的PD样品出现了显著的生物量下降(Wilcoxon检验)(图1C、D)．然而，xCELLigence系统在检测Aii20J的效果方面远不如AAA模型敏感，因为仅在BHI或sche - k1中发现了Aii20J处理的两种唾液来源生物膜的显著变化(t -测试)(补充图S2)．因此，选择AAA生物膜培养模型和龈下样品进行进一步实验。

此外，我们评估了在初始唾液样本中对短(C₆-HSL)和长链(C₁₂-HSL) AHLs与标准化生物测定(罗梅罗等人，2011年)．QQ活动对抗C₁₂-HSL是常见的，来自健康捐赠者的7个唾液样本中有5个和PD来源的8个唾液样本中有7个抑制了生物传感器菌株VIR07 (补充图S5)．相反，QQ对C₆-HSL是稀缺的，只有两个健康和一个PD唾液样本降低了生物传感器菌株CV026 (补充图S5)．收集的唾液样本体积小，无法评估这些样本中AHLs的存在。

为了评估哪种培养基和培养条件导致pd衍生生物膜内的微生物多样性更高，我们选择了四种培养条件:bhi -好氧，bhi -厌氧，sch - k1 -厌氧，此外，mcbain -厌氧(图2A、B)．使用McBain培养基可提供高蛋白负荷，与SCH-K1培养基一样，McBain培养基含有半胱氨酸、血红素和维生素K1，有利于革兰氏阴性厌氧菌的增殖。为了达到与口腔环境更高的相似度，McBain培养基还含有黏蛋白，这是一种主要的唾液多肽，存在于获得性牙釉质膜中。实验使用牙龈下样本进行，因为它们比唾液样本更能代表牙周微生物群。关于微生物多样性，属链球菌在所有生物膜中占主导地位(图2 b)，但McBain培养基具有最多样化的生物膜，如属的比例增加细孔菌，细粒菌，芽孢菌,嗜血杆菌在对照组和ai20j处理的生物膜中，与其他培养基相比。QQ酶的存在导致牙龈下来源的生物膜质量显著减少，即使是在BHI和SCH-K1培养基中获得的革兰氏阳性为主的生物膜，也没有显著改变属水平上的细菌相对丰度(图2A、B)．

ahl -内酯酶ai20j对在体外牙龈下生物膜的形成和细菌多样性

一旦我们在AAA模型中建立了获得多种口腔生物膜的最佳条件，我们就研究了更多的样本，评估ai20j存在时生物膜质量和微生物多样性的变化。选择龈下样本作为接种剂，因为龈下样本对ai20j的敏感性高于唾液样本，如之前的实验所见(图1)．在这些实验中，招募了35名患者;11名健康捐赠者、3名牙龈炎患者及21名牙周炎患者(补充表S2)．生物膜分别在bhi -厌氧和mcbain -厌氧条件下生长，以比较ai20j对革兰氏阳性菌为主的生物膜和更多样化的生物膜群落的影响。从最初的患者组中可以看出，生物膜形成能力因供体的不同而有很大差异(补充图S6)，健康组与帕金森病组之间的生物量值无显著差异(t -测试)(补充图S6)．未处理生物膜的生物量值与对ai20j的敏感性无关(Pearson r)(数据未显示)。

在bhi -厌氧和mcbain -厌氧条件下生长的生物膜中，ai20j的存在导致生物量减少，很少有例外(图3)，证实了链球菌-主导生物膜(图1)．当根据患者的口腔健康分类对生物膜进行分组分析ai20j的作用时，pd来源的生物膜在所有培养条件下均显著减少，而健康来源的生物膜仅在BHI中生长时显著减少(Wilcoxon检验)(图3)．在牙龈下，pd衍生的生物膜，宏观差异(补充图S1在ai20j存在的情况下，在BHI和McBain生长的生物膜中分别检测到71%和38%的生物膜，生物量分别在50%和42%的样本中显著下降(t -测试)(图3)．在牙龈下，健康来源的生物膜中，在BHI生长的生物膜中发现了91%的宏观差异，而在McBain生长的生物膜中发现了18%的宏观差异。此外，在BHI中生长的64%的健康生物膜和McBain中生长的18%的健康生物膜中，ai20j导致的生物量减少显著。t -测试)(图3)．评估其他对照，即纯化Aii20J溶液和热灭活Aii20J产生的小于10 kDa的分数，与仅水的生物膜阴性对照相比，来自两个对Aii20J易感的牙周供者的生物膜质量没有差异(补充图S7)．

在CLSM下观察McBain培养的患者P30和P31的龈下生物膜，以比较CV试验中对ai20j有不同反应的生物膜(图3 b)．在CV试验中，患者P30的生物膜的生物量显著减少，并且在对比对照的CLSM照片(11.0±4.9%)和ai20j处理的生物膜(5.8±3.7%)时，生物膜的覆盖率也显著降低(t -测试)(补充图S8)．另一方面，在CV试验中，来自P31患者的生物膜在对照组(3.26±2.57%)和ai20j处理的生物膜(3.57±1.43%)之间的生物膜质量和生物膜覆盖率均无显著差异(补充图S8)．然而，对照患者P31的生物膜主要是PI染色，而ai20j处理的生物膜主要是SYTO 9染色(补充图S8)．

在生物膜定量的同时，从McBain培养的对照组和ai20j处理过的样品中收集生物膜块用于DNA提取，因为我们之前观察到，这种培养基允许牙龈下样品的生物膜中有更高的微生物多样性(图2)．16S rRNA基因测序证实了该属的优势链球菌，生物膜的相对丰度达到45 - 61% (图4 a - c)．细孔菌，嗜血杆菌，细粒菌，芽孢菌,Aggregatibacter在前十个相对丰富的属的所有生物膜中也发现了。主坐标分析(PCoA)和α多样性指数显示，对照组和ai20j处理的生物膜之间的微生物组成没有显著差异(图4 d-f，补充图S9)．除了多样性指数外，还根据供体的口腔健康状况对生物膜进行了分组差异丰度分析。在牙周炎衍生的生物膜中，属Porphyromonas，在ai20j的存在下，其差异丰度显著降低(图5一个)．进一步量化Porphyromonas gingivalis而且Porphyromonas endodontalis，这两个物种都与口腔疾病有关(Hajishengallis等人，2012；德布里托等人，2020年)，利用qPCR对牙周炎来源的生物膜(n =19)。没有发现显著差异p . gingivalis也不p . endodontalis对照组和ai20j处理的生物膜之间的cfu (Mann-Whitney试验)(图5 b)．真菌总16S rRNA基因定量作为归一化对照。

最后，未处理生物膜的上清液(n =调查了16)最常见的ahl的存在(从C₄-HSL to C₁₈-HSL，含或不含氧基和羟基取代基)通过HPLC-MS分析。在任何样本中都没有发现这些标准ahl。

口腔龈上宏基因组中群体相关序列的丰度

由于生物膜培养的上清液中缺乏标准AHL，而且由于原始唾液和龈下样本体积减少，不可能执行相同的分析程序来检测AHL，这促使研究与AHL合成和感测相关的序列，以及公共数据库中可获得的龈上斑块样本中125个宏基因组中的AHL酶降解(Belda-Ferre等人，2012；人类微生物组项目联盟，2012a；人类微生物组工程，2012b)，以及一个合成的牙龈下宏基因组，其中包括牙龈下生态位中最具代表性的细菌种类(补充表S6)，在发现的序列和丰度方面显示出与龈上宏基因组非常相似的结果。对这些宏基因组的分析显示，与AHL合成酶HdtS同源的蛋白质丰度惊人地高(图6，补充表S4)．该蛋白家族由三个HdtS序列组成假单胞菌，它几乎出现在每个宏基因组中，几乎与LuxS的四个蛋白质家族一样丰富，在本分析中作为参考(图6)．在研究的AHL受体中，牙龈上宏基因组和合成的牙龈下宏基因组中都出现了三个蛋白质家族的丰度升高。这些家庭的代表成员是阿巴不动杆菌， RhlR的假单胞菌的ahl受体混杂的SdiA洋葱（图6)．这些蛋白质家族出现在大量的宏基因组中，尽管它们的丰度低于观察到的HdtS。值得一提的是，以RhlR为代表的蛋白家族还包含多个SdiA序列，包括来自大肠杆菌而且沙门氏菌的SdiA序列与与SdiA序列一起分类的序列有差异洋葱家庭。

除了AHL合酶和受体外，我们还研究了牙龈上和牙龈下的宏基因组中存在的AHL灭活酶:内酯酶、酰基酶和副轴索酶。内酯酶和酰基酶的蛋白质家族出现了极高的丰度，在某些情况下甚至高于LuxS序列(图6)．这些在网上结果与所得结果一致在体外唾液样本中QS抑制活性的高丰度(补充图S5)．

讨论

本工作旨在评估QQ酶ai20j在预防牙周起源生物膜形成方面的潜力在体外研究。鉴于牙科抗菌素耐药性的上升，需要探索控制牙周病的替代方法(Cieplik等人，2014；拉姆斯等人，2014)．一些研究已经描述了QQ策略对抗单特异性(Sun等，2021年)和多微生物生物膜(Jo等人，2016；Huang等，2019；施瓦布等人，2019年；Jeong等人，2020年)．具体来说，ahl -内酯酶ai20j对唾液样本中生物膜形成的抑制作用已经被描述(Muras等，2020b)．ai20j是一种广谱、极耐热的酶，没有遗传毒性(UNE-EN ISO 10993-3:2015)，在真核细胞中没有细胞毒性(OECD指南471)(未发表的结果)。此外，我们已经证实ai20j在常温下在商用漱口水中浸泡24个月后仍保持其活性(未发表结果)。尽管ai20j是金属- β -内酰胺酶超家族的成员，但它不影响β -内酰胺类抗生素(Mayer et al.， 2015)亦不会干扰细菌生长(Muras等，2018b)，降低诱发抗菌素耐药性的风险。这些特性使ai20j成为口腔健康环境下开发抗生素膜策略的有前途的候选者。

我们的结果表明，在检测生物膜对Aii20J的不同反应时，AAA模型和CV染色比xCELLigence系统更敏感。图1)．AAA模型允许量化、宏观评价(补充图S1)，以及显微成像(补充图S8)，以补充CV法检测结构差异(Muras等，2018b)．AAA模型还促进了治疗和培养基的更新，为附着细胞提供更多的营养物质，消除松散的细菌和代谢废物，并确保仅对积极附着的细胞进行评估。另一方面，xCELLigence系统在早期粘附阶段监测生物膜的生长(Muras等，2018b；米拉等人，2019年)，在孵育10小时后达到饱和(Muras等，2018b)．在AAA模型(终点量化技术)中，我们描述了ai20j引起的显著生物膜改变。相比之下，在实时监测技术xCELLigence系统中，大多数样品没有发现明显的变化。因此，ai20j可能在生物膜的成熟阶段而不是最初的附着阶段影响生物膜。

研究了不同的培养基和条件，以获得含有较高比例厌氧革兰氏阴性细菌的生物膜。接种BHI和SCH-K1的生物膜以该属为主链球菌（图2而且4)．然而，与其他培养基相比，McBain培养基含有更高的蛋白质负荷，允许更多样化的群体增殖(图4)．这些条件(McBain在厌氧症中的使用)已经被提出作为重建牙龈缝隙生态位的适当选择在体外（Janus等，2015)，因为营养物质的高可用性和低氧条件已被描述为有利于糖和蛋白水解细菌的增殖在活的有机体内（德鲁克,2000)．

在大多数测试条件下，ai20j的加入导致生物膜质量显著下降。在不同接种菌的bhi -好氧和sch - k1 -厌氧条件下生长的初始生物膜组中，高达41%的牙龈下生物膜显著减少，而唾液生物膜显著减少的比例为29% (图1)．这种生物膜对酶的不同反应可以用唾液和龈下样本之间细菌群落的变化来解释(Simón-Soro等，2013)．我们还描述了与健康样本相比，PD样本对ai20j的敏感性增加，发现在四种测试条件中的三种条件下，用ai20j处理的PD衍生生物膜显著减少(图1)．健康和pd衍生的生物膜对酶的行为差异可以归因于相对丰度较低的属的差异。在随后的实验中，健康和帕金森病患者的牙龈下样本在驱动更多样化生物膜的条件下生长。再一次，ai20j在不同生物膜(mcbain -厌氧)和革兰氏阳性类群(bhi -厌氧)主导的生物膜中引起生物量的显著减少，分别有35 - 87%的样本表现出宏观差异(图3)．这些结果进一步证实了该酶的有效性在体外生物膜抑制策略。即使在无反应的生物膜中，如患者P31，我们可以使用CLSM观察酶对生物膜的影响(补充图S8)．具体来说，患者P31未处理的生物膜主要由PI染色，即主要包含膜损伤细胞，而aii20j处理的生物膜主要由SYTO 9染色，表明大多数细胞是膜完整的(补充图S8)．Aii20J对几种生物膜的反应减少幅度为初始生物量的50 - 99%，对大多数生物膜的反应减少幅度为初始生物量的20 - 50%，而当使用Aii20J处理时，一小部分生物膜的反应减少幅度很小或没有减少。不同患者产生的生物膜之间的这种对比行为已经用抗生素阿莫西林(米拉等人，2019年)．观察到的生物膜形成能力和对QQ酶反应的异质性表明，使用来自不同患者的样本来评估任何口服治疗的重要性，因为它允许在考虑治疗管理时观察个体之间的不同反应。在当前口腔健康的背景下，这是特别重要的，越来越多的人同意个性化治疗，并建议在治疗前研究复杂样本的个体反应(Bartold 2017；Belibasakis et al.， 2019)．

对McBain培养的生物膜的微生物多样性的进一步调查显示，对照和ai20j处理样品之间的微生物相对丰度没有显著变化(图4，补充图S9)．事实上，关于内酯酶对多微生物生物膜群落影响的类似研究也报告了QQ剂存在时微生物种群的相对丰度没有改变(Jo等人，2016；施瓦布等人，2019年)．相反地，一些研究确实观察到相对丰富的口腔- (Muras等，2020b)及与水有关的社区(Huang等，2019)内酯酶存在时。研究Muras等人(2020b)本研究将研究对象数量增加到33个，并使用龈下样本而不是唾液来调查ai20j影响下微生物种群的变化。这些差异可以解释两项研究结果的对比。此外,Muras等人(2020b)仅在种水平上描述了细菌种群的变化，因为99.74%的种群属于属链球菌。相反，在本研究中，生物膜种群包括链球菌比例为45 - 63%，细菌种群变化的评估是在属水平上进行的，这也可以解释两项研究结果的差异。

令人惊讶的是，尽管在ai20j内酯酶的存在下观察到明显的抑制作用，但在本研究中未处理的生物膜培养的上清液中没有检测到最常见的AHLs。然而，ahl如C₈-HSL已经被检测到体外C₈奥软,C₁₄-HSL和C₁₈-HSL已经找到了在活的有机体内在唾液样本中(Muras等，2020b)．此外，一些口服分离株已被证明在纯培养或受控混合培养中产生AHLs在体外（Kumari等人，2006年；Yin等，2012a；Yin等，2012b；Chen等，2013；Goh等人，2014；Goh等人，2016；Muras等，2020b)，并在口腔基因组中描述了预测的ahl相关基因(阿莱蒂等人，2019年)．在这里，培养条件可能会影响AHLs的生产在体外生物膜，要么是选择非AHL产生菌的结果，要么是培养条件影响AHL产生菌的结果。后者先前已在人类病原体中得到证实不动杆菌它会根据培养条件打开和关闭其产生ahl的系统在体外（Mayer等，2018)．此外，用于提取AHL的生物膜和培养基体积小，可能阻碍了HPLC-MS的检测，我们不能完全排除AHL在生物膜内发挥微观作用的可能性。

对125个龈上斑块宏基因组和另外一个合成的龈下宏基因组的分析揭示了与AHL生物合成途径相关的高丰度蛋白质。LuxS的丰度被用作参考，因为它涉及中枢代谢，因此在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中广泛存在。然而，在某些物种中，LuxS解毒s -腺苷甲硫氨酸后产生的分子AI-2也可作为QS信号(Schauder et al.， 2001；Winzer等人，2002年)．事实上，AI-2的反应调节器，LuxR蛋白鳗（肖沃尔特等人，1990年)，在所研究的宏基因组中以较低的丰度存在(蛋白质家族“AI−2−受体−1−LsrR”)(图6)，表明LuxS在这些样品中的主要代谢作用。在本研究中，我们在龈上宏基因组和合成的龈下宏基因组中描述了与HdtS合成酶相关的高丰度序列(图6)．HdtS不属于主要的AHL合酶家族，它已被证明能产生几种AHL，包括OHC_14:1-HSL，一种不常见的AHL，可作为细菌素(Laue等人，2000年)．此外，对龈上宏基因组的分析显示，在这些宏基因组中，AHL受体蛋白家族的丰度较高(图6)．其中两个家族包含多个SdiA序列。SdiA被描述为单独的LuxR，即一种不能产生ahl但对ahl有反应的细菌受体(迈克尔等人，2001年)．SdiA已被证明是高度混杂的，呈现出广泛的配体结合特异性，并能够对ahl以外的分子做出反应(Nguyen等人，2015；斯泰尔斯和布莱克威尔出版社，2018年出版)．因此，我们不能完全忽视不同于AHLs的信号分子作为SdiA受体同源配体存在于口腔环境中的可能性。越来越多关于LuxR的研究表明，这些受体可以结合广泛的AHL衍生物和含有来自脂肪酸代谢途径的芳香基团的分子(Tobias等人，2020年)．这些意见与……的意见一致阿莱蒂等人(2019)他在人类口腔类群的基因组中发现了推定的ahl生物合成基因。总而言之，这些结果表明不常见的ahl或尚未描述的ahl样分子在口腔生物膜中的作用，当使用标准ahl作为参考时无法识别，但可以被广谱特异性受体(如SdiA和其他LuxR单受体)感知。本文报道的发现与龈上宏基因组的使用构成了口腔中ahl相关代谢的新知识。从牙龈下生态位评估细菌中这些序列丰度的第一种方法已经用合成的牙龈下宏基因组完成。随着宏基因组研究和公开的宏基因组数据的增加，进一步的研究将有助于确认口腔中，特别是龈下生态位中，qs相关序列的丰度。

最后，对ahl -淬灭相关序列的搜索也获得了令人惊讶的结果，在龈上宏基因组和龈下合成宏基因组中广泛存在丰富的QQ酶(图6)．发现蛋白质家族“qq - lacttonase -14- ahlk”在最丰富的群体中是特别有趣的(图6)．该蛋白家族包含亚投行酶根癌土壤杆菌，是一种具有广泛底物特异性的内酯酶(Liu et al.， 2007)．几种QQ酶的存在能够降解AHL衍生物，甚至AHL以外的分子已在文献中描述(Hiblot等人，2013；Bergonzi等人，2019年)．QQ酶的龈上和龈下宏基因组的高丰度可能会降解除AHLs之外的其他分子，这与在这些宏基因组中发现混杂受体一致(图6)，强化了口腔中存在ahl样分子的观点。因此，我们假设本文所述Aii20J介导的生物膜抑制作用可能不是来自于Aii20J对AHLs的作用，而是来自于其他相关结构的信号分子。一个类似的病例已经描述了QQ内酯酶soopox，其抗生素膜活性抗铜绿假单胞菌单种生物膜更依赖于它的混杂活性铜绿假单胞菌PQS信号比其对AHLs的活性(Rémy等，2020)．当Rémy et al. (2020)将soopox与对PQS无活性的内酯酶进行比较，后者表现出低得多的抗生素膜活性，尽管对AHLs更有活性，这表明范围更广的内酯酶具有更好的抗生素膜特性。因此，我们关于Aii20J内酯酶在口腔样品上的抗生素膜活性的结果可以解释为不常见的ahl或ahl样分子对Aii20J酶活性的可能敏感性。PQS合酶(蛋白质家族“PQS- synthase - pqsabc”)的发现进一步加强了这一点，在龈上和龈下宏基因组中含量很高(图6)．这种分子的存在的确认意味着口腔生物膜中比目前建立的更复杂的信号网络。此外，ai20j对生物膜的影响以链球菌这是一种革兰氏阳性菌，既不会对AHLs产生反应，也不会受到这种QQ酶的影响在体外纯文化(Muras等，2018b)，部分原因可能是在场景中引入了非ahl信号。未来关于ai20j对标准ahl以外分子的底物特异性的研究将有助于验证这一假设。

我们描述了QQ策略的使用，特别是QQ内酯酶ai20j，成功地减少了多物种生物膜体外。我们建议使用ai20j作为口腔疾病控制的调节策略，因为它可以降低生物膜内的细菌负荷。在酶的存在下产生的生物膜预计会对其他治疗(如抗生素治疗)产生更好的反应，因为它们的结构密度降低了，而且它们的潜在孔隙度增加了，这使得QQ策略可能成为这些治疗的辅助剂。尽管这些结果很有希望，但进一步在体外研究，包括在转录和蛋白质组学水平上评估ai20j的影响，以了解在这种生物膜中检测到的行为变化背后的机制。此外，必须评估这些多微生物群落中酶活性的变化，因为蛋白酶或铁载体生产等功能活动与细菌毒性密切相关。以前的研究已经描述了由AHLs的存在驱动的酶活性的变化在体外口腔生物膜(Muras等人，2020a)，表明使用ahl降解酶也能观察到类似的变化。关于口腔宏基因组中QS相关序列的丰度，由于所有可用的宏基因组都起源于龈上，对牙龈下样本中存在ahl相关序列的调查将阐明它们在口腔中的分布程度，确认与牙周病的相关性，并支持针对QS成分的口腔保健策略的使用。测试QS-targeting策略的最终目标是它们从在体外实验在活的有机体内还有临床试验。要做到这一点，评估ai20j与抗菌素可能的协同作用将是有趣的。此外，还需要评估最优方案在活的有机体内在考虑口服产品中添加QQ酶时，需要考虑给药剂量、保留时间和其他药理学方面的因素。

这项工作的发现表明了ahl或ahl样分子在口腔生物膜形成中的重要作用。针对这些分子会导致生物量显著减少在体外微生物相对丰度没有显著变化。这项研究首次描述了龈上和龈下宏基因组上AHL合酶的丰度和AHL受体的混杂。总的来说，这些结果表明QQ策略可能有助于控制口腔生物膜的形成，同时强调了临床实践中个性化评估的重要性。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和登录号可以在article/中找到补充材料．

道德声明

涉及人类参与者的研究由加利西亚临床研究伦理委员会(Xunta de Galicia)审查并批准(研究方案2009/319，于2017年7月修改)。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。

作者的贡献

所有作者都对本文的工作做出了广泛的贡献。AP和AMu在AA, AS-O, GA, LDA的帮助下进行实验，分析数据，撰写手稿。PO-C招募患者，收集样本，并提供每个患者的口腔健康状况分类。AMi有助于实验的平面化和形式化分析。VB提供了技术支持和概念建议。AO构思了这个项目，利用VB的贡献设计了实验，修改了手稿，并监督了研究。所有作者都在各个阶段讨论了结果和影响，并对手稿进行了评论。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了卡洛斯三世Salud Carlos III研究所(DTS21/00015)的PDTS项目的支持。美联社由Consellería de Cultura, Educación和Ordenación巽塔加利西亚大学(ED481A-2019/194)提供的博士预科奖学金支持。

致谢

我们要感谢Dentaid研究中心的Rubén León博士在选择取样和培养条件方面的帮助，以及在讨论方法方法时的宝贵意见。我们要感谢RIAIDT-USC分析设备对共聚焦显微镜成像和分析的支持。

利益冲突

本研究中使用的ai20j酶受以下专利保护:Otero, A.， Romero, M.， and Mayer, C. 2016。具有群体感应抑制活性的肽，编码所述肽的多核苷酸及其用途。PCT / ES2014/070569。

其余作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fcimb.2023.1118630/full#supplementary-material

缩写

AAA模型、阿姆斯特丹主动依恋模型;AE,好氧生活;ahl分子,N-acyl-homoserine内酯;一、乏氧生活;脑心输液;cfu，菌落形成单位;CI，细胞指数;C_P，交叉点;共聚焦激光扫描显微术;CV，结晶紫;龈沟液;人类微生物组计划;HPLC-MS，高效液相色谱-质谱;HSL，高丝氨酸内酯;IQR，四分位间距;磅,Luria-Bertani;MWCO，分子量截止值; PBS, phosphate-buffered saline; PCA, Principal Components analysis; PCoA, Principal Coordinates analysis; PD, periodontal disease; PI, propidium iodide; qPCR, quantitative polymerase chain reaction; QQ, quorum quenching; QS, quorum sensing; SCH-K1, Schaedler medium supplemented with 0.1 mg L^－1维生素K1的摄入量

参考文献