利用单细胞RNA测序数据全面分析晚期骨肉瘤中潜在的细胞通信网络
Ning徐
小菁王
丽丽王1
__，
仙游郑
海胡- 1上海市第八人民医院骨科，上海，中国
- 2安徽医科大学附属第一医院神经内科，中国合肥
- 3.上海交通大学附属第六人民医院骨科，中国上海
骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是儿童和青少年常见的骨癌，转移和复发是导致治疗效果差的主要原因。为了开发一种有效的OS治疗方法，需要更好地了解肿瘤微环境。本文利用单细胞RNA测序数据集进行了系统的遗传分析，并探索了与骨肉瘤发展相关的潜在信号通路。我们的研究结果在11个骨肉瘤组织中发现了25个簇，包含11种细胞类型，包括“成软骨细胞”、“成骨细胞”、“髓系细胞”、“周细胞”、“成纤维细胞”、“增殖成骨细胞”、“破骨细胞”、“TILs”、“内皮细胞”、“间充质干细胞”和“成肌细胞”。细胞通讯分析结果显示有17个潜在的细胞通讯网络，包括“COLLAGEN信号通路网络”、“CD99信号通路网络”、“PTN信号通路网络”、“MIF信号通路网络”、“SPP1信号通路网络”、“FN1信号通路网络”、“LAMININ信号通路网络”、“FGF信号通路网络”、“VEGF信号通路网络”、“GALECTIN信号通路网络”、“PERIOSTIN信号通路网络”、“VISFATIN信号通路网络”、“ITGB2信号通路网络”、“NOTCH信号通路网络”、“IGF信号通路网络”、“VWF信号通路网络”、“PDGF信号通路网络”。这项研究可能为骨肉瘤的分子过程的病理生理学提供新的见解。
简介
骨肉瘤(OS)是一种高度恶性的实体骨肿瘤，其特征是恶性间充质细胞产生病理性骨样和/或骨基质;约占所有儿科恶性肿瘤的60% (Bousquet等人，2016年；Guo等，2022；Ho等人，2017)，而在全港人口中，OS的发病率为每年200万至300万(Shao等，2022)．骨肉瘤的临床症状影响胫骨近端、肱骨近端和股骨远端，主要表现为局部不适、水肿和关节活动减少(Rothzerg等人，2021年)．目前，这种癌症的治疗方法是手术切除和多种药物的化疗。不幸的是，在局限性骨肉瘤患者中，骨肉瘤患者的5年总生存率仅为约60%，而在转移或复发性疾病患者中仅为20% (Meltzer和Helman, 2021年)．OS的病理生理特征是复杂细胞的大量浸润，包括恶性间充质干细胞、增殖成骨细胞、成骨细胞、免疫细胞和血管网络，表明存在高度复杂的肿瘤微环境(TME) (Kansara等人，2014)．然而，这些细胞潜在的细胞通信网络仍然没有完全阐明。
为了了解癌症生物学和免疫学，并充分利用肿瘤免疫疗法，弄清楚这个生态系统的细胞是如何协同工作的，以及它们是如何相互交流的，这一点很重要。生物活动的最终单位是单细胞，遗传过程与细胞环境相互作用，决定包括组织和器官在内的复杂结构的发育和功能。要理解在正常和疾病状态下几乎所有生命现象的生物学，就必须解剖和描述它们的组成和特征，以及评估它们在单细胞水平上的相互作用、动态和功能。Ren等人，2018)．然而，从技术上讲，由于TME的复杂性，以前的基因组、转录组和蛋白质组癌症研究一直无法全面阐述TME。（Liu等，2021)．基于单细胞测序的新技术的出现，在捕捉不同肿瘤分期和了解肿瘤异质性方面实现了无与伦比的分辨率和规模(Vegliante等人，2022)．单细胞技术的快速发展为我们在单细胞水平上研究TME的多种变构状态和潜在的细胞通信网络提供了一种有效的方法。
本研究使用scRNA-seq研究骨肉瘤TME中潜在的细胞通信网络，以及间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞之间的轨迹分析和转录因子富集分析。
材料与方法
数据源的收集和处理
基于10X Genomics平台的11个带有scRNA-seq数据的OS样本通过基因表达Omnibus数据库从GSE152048下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．使用Seurat包(v4.1.1)将每个样本的10X基因组数据加载到R软件(v4.1.3)中。我们排除了鉴定基因<300或线粒体基因百分比超过总表达基因10%的细胞。我们剔除了检测到基因≥7500个的低质量细胞，以及在少于3个细胞中检测到的基因。此外，使用DoubletFinder包(v2.0.3)，我们消除了在封装过程中可能发生的任何双态，或者在样品制备过程中未分离的细胞随机配对。
这项研究不需要伦理批准，因为我们使用的数据来自一个公众可访问的数据库。
细胞类型鉴定
对于每个细胞，基因表达量表示为基因的一个分数乘以10000，采用log (x+1)法进行自然对数变换。我们从归一化表达矩阵中识别并缩放了前2000个高变量基因(HVGs)，然后对这些HVGs进行主成分分析(PCA)。基于识别出的前50个PCA组件，使用R Harmony包(版本1.0)(Zhou等，2020)．在谐波校正数据的基础上，估计k近邻，形成共享近邻图(SNN)。然后调整模块化函数，实现基于聚类算法的聚类识别。在采用t分布随机邻居嵌入(tSNE)或统一流形近似和投影降维(UMAP)方法生成的二维地图上，显示已识别的聚类。
使用“FindAllMarkers”函数，每个聚类的标记基因按照以下标准进行识别:Threshold = 0.25, min. PCT = 0.25, min. div . PCT = 0.25。利用Seurat中的“DotPlot”工具，显示各标记基因在聚类中的表达模式。细胞分组是基于deg和科学文献中描述的知名细胞标记(Zhou等，2020)．
单细胞的假时间排序
Monocle包(v2.22.0)用于生成单细胞伪时间轨迹。利用scRNA-seq数据的伪时间分析，Monocle旨在破译分化过程中的细胞变化。在将原始UMI计数的尺度及其聚类信息输入到“newCellDataSet”函数中后，使用最近的流形学习算法——树判别降维(DDRTree)方法将其计算到较低维空间。间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞按假时间顺序排列。图伪时间热图用于计算和说明其表达随伪时间而变化的基因。
信息交流
CellChat包(版本1.4.0)基于单细胞RNA测序数据预测所有细胞类型的细胞间通信(Jin等，2021)．只有配体与受体相互作用p-value 0.05用于预测不同细胞类型的细胞-细胞相互作用。
景观分析
SCENIC是一种利用scRNA-seq数据重建基因调控网络的技术，同时也识别稳定的细胞状态。使用SCENIC包(version 1.3.1)评估转录因子富集和调控活性(Aibar等，2017)．基于共表达和DNA基序分析，建立基因调控网络，并评估网络在每个细胞中的活性，以确定细胞状态。对于转录因子调控网络的发育，以两个基因基序排序(转录起始位点附近10 kb或转录起始位点上游500 bp和下游100 bp)为指导，在转录起始位点周围设置搜索空间。人类的基因基序排序由https://resources.aertslab.org/cistarget/．所使用的数据库为分子特征数据库(MsigDB)的Hallmark Gene Set (Liberzon等人，2015)．此外，使用R包GENIE3(版本1.16.0)、RcisTarget(版本1.14.0)和AUCell(版本1.16.0)构建基因调控。
结果
质量控制和批次效应的消除
本研究纳入了11名具有scRNA-seq数据的OS患者。使用R Harmony包(1.0版)，基于前50个PCA分量消除了样品之间的批效应。去除批效应后，我们使用t-SNE和UMAP技术降维，然后将结果绘制为2D散点图(图1一个)．在质量控制过程中，我们剔除了鉴定基因少于300个或线粒体基因比例超过所有表达基因10%的细胞(图1 b)．scRNA-seq数据质量控制的点图如图所示图1 c．
图1．质量控制的过程。(一):和谐后的t-SNE和UMAP图。(B):小提琴特征图，计数，百分比。mt和百分比。(C):计数和特征的相关图，百分比。太,百分比。HB。
利用scRNA-seq数据鉴定骨肉瘤微环境中的25个细胞簇，揭示了高度的细胞异质性
按照质量控制标准，我们最终将110042个细胞纳入分析。这些细胞被聚成25个原代细胞群(图2 a, B；图3 a, C)．调整后的值p值<0.01显示为红色，而调整后的值p数值≥0.01时以黑色显示(图2 b)．基因表达差异分析显示所有聚类中均存在上调和下调基因。利用集群特异性标记标记细胞类型(图3 b、D、E):成软骨细胞(Sox9, Acan, Pth1r)，成骨细胞(Runx2, Col1a1, Cdh11, Ibsp)，髓系细胞(Cd74, Cd14, Fcgr3a)，周细胞(Rgs5, Acta2)，成纤维细胞(Dcn, Col1a1)，增殖成骨细胞(Mki67, Top2a, Pcna)，破骨细胞(ACP5, Ctsk, Mmp9)， TILs (IL7R, CD3D, NKG7)，内皮细胞(Pecam1, Vwf)，间充质干细胞(Mme, Thy1, Cxcl12, Sfrp2)，成肌细胞(Myl1, Mylpf)。
图2．标记基因在OS中的表达。(一):标记基因的小提琴图。(B): deg的柱状散点图。
图3．OS病变的单细胞转录组分析。(A, C): t-SNE和UMAP分析，显示降序聚类结果。(B、D、E): t-SNE和UMAP分析显示OS组织细胞中细胞亚群的注释结果。
骨肉瘤微环境中潜在的细胞通讯网络
为了识别细胞间潜在的分子连接，我们利用R的CellChat包(版本1.4.0)来寻找配体-受体对与主要细胞类型之间潜在的分子相互作用，从而构建细胞通信网络。首先，CellChat用于分析成软骨细胞、成骨细胞、髓系细胞、周细胞、成纤维细胞、增殖成骨细胞、破骨细胞、TILs、内皮细胞、间充质干细胞和成肌细胞之间的细胞通信。CellChat分析的结果揭示了所有细胞类型中配体受体的数量和重量(图4 a, B)．传出和传入信号模式显示在(图4 c, D)．传出和传入相互作用强度表示为(图4 b, C) (B:所有信号通路网络已识别;C:选择信号通路网络)。此外，它们所有的配体-受体相互作用已被确定(图5 d)．
图4．不同细胞类型之间的细胞-细胞通信网络。(A, B):各种细胞类型中配体受体的数量和重量。(C, D):所有细胞类型之间的外向和传入相互作用强度。
图5．OS中所有配体-受体相互作用的细胞概述。(一): OS中所有细胞配体-受体相互作用。(B, C):所有已识别的信令通路网络，选定的信令通路网络。
所识别的所有信号通路网络的细节也显示在图6 a - c(A:所有细胞类型中配体受体的数量;B:各细胞类型中配体受体的权重;C:所有细胞类型之间配体-受体相互作用的弦图)。在57条信号通路中，与骨肉瘤相关的信号通路有:COLLAGEN (鲍曼和亨内特，2016年；Elenjord等人，2009年；莱文森等人，2002年；山口等人，2005年)， cd99 (Manara等人，2006；Sciandra等人，2014年；西葫芦等人，2014年)、PTN (他等人，2019年；秦等，2022；Sun等人，2020年), MIF (刘等，2014), SPP1 (达拉-托雷等人，2006年；李等，2017), FN1 (Saba等人，2019年；Zhou等，2019)、层粘连蛋白(Heino和Massague, 1989)、FGF (Kurogi等人，1996年；Laulederkind等人，2000年；李等，2019；徐等，2010)， vegf (Ji等，2020；雷等，2018；小田等，2006；Tsai等，2017；Zhang等，2019), GALECTIN (戈麦斯-布鲁歇等人，2010年；苗等，2014；Park等，2015；Zhou et al.， 2014), PERIOSTIN (Ma等人，2020年；徐等，2022), VISFATIN (Cheng等，2015；王等，2019，2016)， itgb2 (戴等，2018),切口(Jin等，2017；Mu et al.， 2013；Ongaro等人，2016年；田中等人，2009年；Zhang et al.， 2010)， igf (Armakolas等人，2016年；Giatagana等人，2022年；Gvozdenovic等人，2017；莫利纳等人，2019；谭等，2015)、VWF (王等，2020)和PDGF (Chen et al.， 2009；埃格纳斯等人，2018；Heldin等人，1986年)．这些与骨肉瘤相关的信号通路的配体-受体相互作用在图6 d．此外，根据本研究结果，间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞的潜在通讯主要围绕SPP1 (图7)、FGF (图8)， notch (图9)．
图6．每个主要细胞类型所表达的配体的详细视图。(一):提供了每个主要细胞类型表达的配体和表达信号接收受体的细胞的详细视图，线条的粗细表示每个细胞间链接的配体-受体对的数量。(B):线条的粗细表示每个细胞间连接配体-受体对的权重。(C):弦图显示操作系统微环境中潜在的细胞串扰。(D):选择与OS相关的配体-受体相互作用。
图7．SPP1信号通路。(两者):细胞配体-受体相互作用。(D, E):各主要细胞类型所表达的配体受体。(F, G): SPP1信号通路网络。
图8．FGF信号通路。(两者):细胞配体-受体相互作用。(D, E):各主要细胞类型所表达的配体受体。(F, G): FGF信号通路网络。
图9．NOTCH信号通路。(两者):细胞配体-受体相互作用。(D, E):各主要细胞类型所表达的配体受体。(F, G): NOTCH信号通路网络。
间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞的分化轨迹分析
利用基于Monocle包的伪时间分析评估细胞状态传输。对间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞进行分化轨迹分析。我们进行了伪时间分析，以探索间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞之间的细胞状态转换(数字10 a e)．此外，我们绘制了这些细胞之间分化轨迹的热图(图10 f)．轨迹分析结果显示，成骨细胞的分化轨迹主要始于间充质干细胞簇和增殖成骨细胞，并由间充质干细胞簇分化为成骨细胞。
图10．间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞的轨迹分析。(安妮):显示这些细胞类型分化的轨迹图。(F):动态基因随时间比例表达的热图。热图的行反映了沿伪时间表现出动态变化的基因，这些基因根据它们在伪时间内的表达模式被分为四类。
间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞的单细胞调节网络
采用SCENIC分析检测间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞的TFs。tf基因(XBP1(杨等，2015；Yu等人，2022)， atf4 (罗等，2017，2019；西安等，2017)， SOX9(Y。陈山等，2020；He et al.， 2017；王等，2018)在成骨细胞(图11模拟)，并在骨肉瘤中表达。
图11．SCENIC分析预测了TF。(两者): tSNE图和直方图显示了间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞中前三种TF活性。(D):热图显示这些细胞类型的前50个TF。
讨论
骨肉瘤是儿童、青少年和年轻人中最常见的恶性骨肿瘤，中位年龄为16岁。约占骨肉瘤的56%，转移是治疗失败和预后差的主要原因(Chen等人，2021)．尽管先前的分子生物学研究已经为骨肉瘤的发病机制提供了大量信息，但调节骨肉瘤发生和发展所必需的几种致癌损伤的机制仍然未知(Isakoff et al.， 2015；Kansara等人，2014)．它仍然是一个严重的问题，由于不典型的癌变过程和有限的治疗方案。因此，找到促进多样性、扩张、入侵和最终殖民身体其他区域的重要亚种群驱动突变是至关重要的。此外，骨肉瘤中潜在的细胞通讯网络以及肿瘤异质性对细胞聚集的影响也至关重要。
单细胞RNA测序(scRNA-seq)可以显示细胞群内的差异。它可以区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞，并通过分析单个细胞内的转录物来检查肿瘤微环境中的细胞间连接。它有助于发现独特的细胞类型，研究肿瘤的异质性和细胞间通信的潜在网络，并显示不同的发育路径。这为今后研究骨肉瘤生长和转移的分子过程提供了理论基础。Guo等，2022)．
越来越多的临床和实验数据表明，起源于间充质干细胞的骨肉瘤干细胞可能是骨肉瘤的生物学起源，并表现出成骨细胞分化，产生恶性骨样(布朗等人，2017；)．此外，骨肉瘤与成骨细胞谱系密切相关，并在增殖、细胞外基质分泌和骨化诱导中显示成骨分化相关活动(Zeng等，2022)．因此，本研究通过对骨肉瘤单细胞RNA测序(scRNA-seq)的综合分析，确定了间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞之间潜在的细胞通信网络，说明了晚期骨肉瘤微环境中复杂的调节网络。此外，我们对这些细胞进行了转录因子调控网络分析和轨迹分析。
细胞通讯网络结果显示，间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞主要参与SPP1、FGF和NOTCH信号通路。SPP1基因(骨桥蛋白，分泌磷酸化蛋白1)编码一种具有多种活性的蛋白质，包括骨重塑、粘连、肿瘤侵袭和转移(达拉-托雷等人，2006年)．它由多种细胞类型产生，包括成骨细胞、破骨细胞和内皮细胞(刘等，2013；Wang和Yang, 2015)．溶酶体相关膜蛋白3 (LAMP3)通过SPP1信号通路增强骨肉瘤细胞的侵袭李等，2017)．在结直肠癌(CRC)中，SPP1高度上调并通过促进上皮-间充质转化(EMT)增加CRC转移(徐等，2017)．此外，先前的研究发现抑制SPP1基因可能对舌癌有治疗益处，可能是一个有用的治疗靶点(Zhang等，2020)．此外，在胰腺肿瘤微环境因子中，SPP1-CD44轴可促进肿瘤干性(Nallasamy等，2021)．在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中，SPP1过表达是较差生存结果的预后(Bie和Zhang, 2021)．然而，也有学者发现SPP1的过表达与骨肉瘤总生存期、无事件生存期和诊断时无复发生存期的提高有关(达拉-托雷等人，2006年)．我们的研究结果显示，骨髓细胞、周细胞和破骨细胞可以通过SPP1-CD44信号通路影响间充质干细胞和增殖成骨细胞。此外，在这些细胞通信网络中，破骨细胞扮演着信号的主要发送者、介质和影响者的角色。
成纤维细胞生长因子(FGF)信号对胚胎器官发育和肿瘤进展至关重要(布鲁尔等人，2016)并增加肿瘤细胞的增殖、侵袭和上皮细胞向间充质转化。（波诺等，2013年)．在大多数恶性肿瘤中，许多FGF增加，不同的FGF受体(FGFR)亚型在肿瘤和基质细胞上被激活。（特纳和格罗斯，2010年)．此外，癌症、炎症和肿瘤血管化对VEGF抑制剂治疗的抵抗都与FGFR信号通路有关。（Beenken和Mohammadi, 2009年；卡萨诺瓦斯等人，2005年；费舍尔等人，2007年；特纳和格罗斯，2010年)．此外，在癌症的发展过程中，病理性FGF/FGFR信号通路增强了致癌细胞与其微环境之间的交叉对话，最终导致癌细胞增殖、血管生成和迁移。（李等，2018)．例如，在食管癌的肿瘤微环境中，NCAM-和fgf -2介导的FGFR1信号通路调节肿瘤相关巨噬细胞和癌细胞的生存和迁移(Takase等人，2016)．此外，FGFs激活髓细胞、与肿瘤相关的巨噬细胞、癌症相关的成纤维细胞和破骨细胞(Berardi等人，1995年；collins - osdoby等人，2002年；伊藤,2007)．最近的研究发现，在骨肉瘤的进化过程中，FGF已成为一个至关重要的调节因子。根据前期研究，LHX9通过FGF和TGF - / - catenin信号通路在骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和转移中起关键作用(李等，2019)．有学者发现fgf诱导的LHX9通过FRS2/TGF−/ - catenin通路控制骨肉瘤的发展和迁移(李等，2019)．
我们的研究发现，通过FGF7-FGFR1信号通路，间充质干细胞、周细胞和成肌细胞可能影响间充质干细胞、增殖成骨细胞和成骨细胞。在间充质干细胞和周细胞中检测到大量的FGFR1和FGF7。此外，在这些细胞通信网络中，间充质干细胞和周细胞是重要的信号发送者、介质和影响者。
Notch通路在某些恶性肿瘤中调控形态发生、谱系确定、凋亡和增殖的各种机制(2006年布雷)，并已被确定为肿瘤抑制因子和癌基因(Jin等，2017；田中等人，2009年；Zhang et al.， 2010)．细胞表面的Delta-Serrate-Lag (DSL)配体家族(jagged 1/Jag1, Jag2, delta-like-1/DLL1, DLL3和DLL4)与不同细胞上的膜结合Notch受体(Notch1-4)连接，启动Notch信号通路，这是正常骨生长的关键步骤，也被认为是各种不同恶性肿瘤(Iso等人，2003年)．
根据以往的研究，notch通路与骨肉瘤的发生发展密切相关。Erk磷酸化促进骨肉瘤的增殖和迁移响应Notch刺激(秦等，2019)．通过激活细胞分裂周期20,Notch-1增加骨肉瘤向恶性状态的演变(Gao等，2020)．Jagged1的表达升高与骨肉瘤的转移和复发密切相关。相反，Jagged1的下调显著降低了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭(Zhang等，2021)．此外，Notch信号也调节肿瘤微环境的免疫系统。抑制Notch信号系统增强了TAM向M2基因型的极化，从而促进骨肉瘤的生长和扩散(Ren等人，2020年)．我们的研究发现成肌细胞通过DLK1- NOTCH2信号通路影响间充质干细胞，增殖成骨细胞。此外，成肌细胞也是重要的信号发送者、介质和影响者。
在人类癌症的发展中，最普遍的问题之一是转录因子的失调，它在疾病的发病机制中起着重要作用。SCENIC分析显示，XBP1、ATF4和SOX9在间充质干细胞和增殖成骨细胞中的调控活性均下调。X-box结合蛋白(XBP1)是未折叠蛋白反应的重要转录调节因子。缺氧刺激了XBP1 mRNA的转录和翻译，导致XBP1蛋白活性增加(罗梅罗-拉米雷斯等人，2004年)．它最初被确定为B细胞主要组织相容性复合体II类(MHC)基因表达的关键调节因子(S。陈毅等，2020)．高XBP1水平与OS临床分期晚期、恶性指数高、肿瘤坏死率低相关。XBP1的下调会降低骨肉瘤细胞的生长和存活(杨等，2015)．最近的研究表明，XBP1增加了HOS骨肉瘤细胞对焦磷酸盐- α甲酯介导的光动力药物的敏感性(Yu等人，2022)．激活转录因子4 (ATF4)，综合应激反应系统的主要调节因子，激活一组转录沉默基因的转录，调节细胞的生存和死亡(Ishizawa等人，2016)．近年来，大量关于ATF4参与骨肉瘤的研究被报道。在人骨肉瘤中，抑制GRP78通过去泛素化和CHOP的稳定性增加atf4诱导的细胞死亡(罗等，2017)．此外，通过内质网(ER)应激介导的PERK/eIF2/ATF4/CHOP激活和Wnt/β-catenin信号抑制人骨肉瘤的发展(赵等，2020)．ATF4通过抑制非经典GRP78来破坏RET，增加骨肉瘤对硼替佐米的化学敏感性(罗等人，2019)．性别决定区Y (SRY)- box 9蛋白(SOX9)是多种疾病，特别是恶性肿瘤的重要转录因子。最近的研究表明，SOX9在肿瘤微环境(TME)的控制中起着重要的作用。此外，SOX9信号通路或SOX9控制信号通路在癌症发生和转移中发挥重要作用(潘达等，2021年)．此外，通过sox9介导的正反馈环，MAFB有助于骨肉瘤的癌干性进展和肿瘤发生(Y。陈山等，2020)．此外，先前的研究发现，软骨母细胞性骨肉瘤的cFOS-SOX9轴将骨髓来源的间充质干细胞重编程为软骨母细胞(He et al.， 2017)．
总之，本研究揭示了晚期骨肉瘤中几种细胞类型之间潜在的细胞通信网络。SPP1、FGF和NOTCH信号通路可能在骨肉瘤TME调控中发挥关键作用。这项研究可能为骨肉瘤的分子过程的病理生理学带来新的见解。然而，本文存在以下局限性:没有进行额外的实验来验证本研究中提出的数据挖掘结果;没有使用骨肉瘤bulk RNA-seq数据库进行进一步验证。
数据可用性声明
本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和登录号可以在article/中找到补充材料．
道德声明
根据当地立法和机构要求，对人类参与者的研究不需要伦理审查和批准。根据国家立法和机构要求，本研究不需要参与书面知情同意。
作者的贡献
NX, XW, LW, YS, XZ和HH构思并设计了研究。LW和YS下载并收集数据。NX, XW分析数据，XW和NX撰写文章。LW、YS、XZ、HH对文章进行质量控制，指导投稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
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补充材料
本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fgene.2022.1013737/full#supplementary-material
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关键词:骨肉瘤，细胞类型，细胞通信网络，调节活性，ScRNA-seq
引用:徐楠，王旭，王玲，宋勇，郑旭，胡宏(2022)利用单细胞RNA测序数据综合分析晚期骨肉瘤潜在的细胞通信网络。前面。麝猫。13:1013737。doi: 10.3389 / fgene.2022.1013737
收到:2022年8月7日;接受:2022年9月26日;
发表:2022年10月11日。
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