供者来源的无细胞DNA作为移植诊断工具
迈克尔Oellerich
1*,
Klemens布德
2，
Bilgin Osmanodja
2，
克里斯汀•Bornemann-Kolatzki
3.，
茱莉亚•贝克3.，埃克哈德•舒兹3.和菲利普·d·沃森1
- 1德国大学医学中心临床药理学系Göttingen, Göttingen
- 2肾脏学和重症监护科，Charité-Universitätsmedizin柏林，Freie公司成员Universität柏林，Humboldt-Universität zu Berlin，德国柏林柏林卫生研究所
- 3.Chronix Biomedical GmbH, Göttingen，德国
在器官移植中，需要改进个性化免疫抑制以减少移植物过早丢失。需要生物标记物来更好地检测排斥反应、无症状移植物损伤和免疫抑制。评估最低限度的必要暴露以指导减量和预防免疫激活也很重要。大量已发表的研究都提供了强有力的临床证据，支持dd-cfDNA在监测移植物完整性、检测或排除排斥反应方面的作用。Dd-cfDNA表明移植物细胞死亡，而不是排斥特异性的。它可以在血浆中通过液滴数字PCR，使用预先选择的snp或下一代测序进行检测。受体cfDNA的改变(如感染)会影响dd-cfDNA分数测定的结果。这种限制可以通过使用绝对dd-cfDNA定量来克服。建议将包括总cfDNA的分数和绝对测定相结合，以有意义的解释结果。对患者的价值主张包括早期的移植损伤检测和干预，更少的完全排斥风险，侵入性活检的替代方案，以及具有改善长期预后潜力的个性化免疫抑制。 Transplant physicians benefit from better immunosuppressive guidance and having an alternative when biopsies are refused or contraindicated. Further advantages are improved biopsy interpretation, less trial and error changes in immunosuppression, and less time dealing with complications. The laboratory medicine specialist can provide more effective services. Hospital management and insurance companies could benefit from more cost-effective surveillance of transplant recipients. Potential cost savings would result from fewer biopsies as a result of the tests’ high negative predictive value, fewer re-transplantations, and less organ failure with return to dialysis. A pathway to implementation and metrics is suggested to measure the effectiveness of dd-cfDNA testing.
简介
在肾移植中，改善个体化免疫抑制是减少移植物过早丢失的必要条件(Oellerich等人，2021年)．因此，需要更有效的生物标志物，提供有关早期发现或排除排斥反应、无症状移植物损伤和免疫抑制低下的可操作信息(Brunet等，2016)．评估最低限度必要接触的能力对指导减少接种和防止免疫激活也很重要。
目前用于肾脏受体监测的方法，包括血浆肌酐、免疫抑制药物水平、蛋白尿、血尿、供者特异性抗体(DSA)和双工超声检查，具有诊断局限性(布鲁内等人，2019；Bergan等人，2021年；Oellerich等人，2021年)．血浆肌酐是肾功能而不是移植物损伤的衡量指标。血浆肌酐的增加并不是同种异体移植物损伤所特有的[例如，可能由于体积消耗或使用血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂而增加]。因此，血浆肌酐水平升高可能引发不必要的活检(Oellerich等，2019年)．此外，当血浆肌酐明显升高时，移植物可能已经存在明显程度的损伤(美国肾脏病学会，2005)．因此，基于血浆肌酐的干预可能太晚了。
免疫抑制药物监测显示毒性的风险，但对移植物损伤的预测能力较差(First et al.， 2017)．活检只能很少进行，主要并发症发生率为1%。约25%的活检标本不足，解释的观察者间可变性限制了其有效性(奈特等人，2019年；Oellerich等，2019年)．需要一种基于血液的非侵入性替代监测活检，以排除“沉默的”亚临床排斥(李等人，2020年)．监测免疫抑制的充分性也很重要，因为亚临床组织学异常与慢性损伤的发展相关。
使用供者来源的无细胞DNA作为生物标志物的基本原理
在此背景下，无创供体来源的细胞游离DNA (dd-cfDNA)检测在早期发现移植物损伤和/或排斥反应方面具有很大的潜力。在移植中使用dd-cfDNA作为定量生物标志物(“液体活检”)的基本原理是基于器官移植也是基因组移植这一事实，这为使用它们直接监测异体移植健康提供了可能性(De Vlaminck等人，2014)．在移植物细胞死亡的情况下，核小体作为cfDNA释放到血液中。移植物损伤的原因包括排斥反应、急性肾小管坏死、缺血、创伤和感染。cfDNA释放的机制包括坏死产生大片段(约10,000 bp)或凋亡导致小片段(60-500 bp)的释放。释放的DNA在血液循环中的半衰期中值约为30分钟至2小时(舍伍德和韦默，2018年)．在受者的血液中，dd-cfDNA只占cfDNA总量的一小部分。受体血浆中约90%的cfDNA来自自然凋亡的白细胞(孙等，2015)．dd-cfDNA片段也出现在尿液中(Sigdel等人，2013)，因为它们被滤过肾小球屏障。此外，来自供者尿道的dd-cfDNA也随尿液排出(Oellerich等人，2021年)．
供体来源的无细胞DNA测定方法
dd-cfDNA定量是基于遗传标记(例如，单核苷酸多态性或snp)，允许区分受体和供体中的异源等位基因(Oellerich等人，2021年)．目前在临床试验中，随机(Snyder等人，2011年；沙伦等，2017)或目标(贝克等人，2013；Grskovic等，2016；西德尔等，2019年)方法。随机方法使用适配器结扎和下一代测序(NGS)。靶向方法在液滴数字PCR (ddPCR)中使用预先选择的snp (贝克等人，2013)或有针对性的NGS方法(Grskovic等，2016；西德尔等，2019年)．扩增子长度和cfDNA片段长度影响PCR效率(Dauber等人，2020年；Oellerich等人，2021年)．最近，一种基于供体-受体hla -错配(人白细胞抗原)的dd-cfDNA检测已经被评估HLA-DRB1利用优化的液滴数字PCR (Sorbini等人，2021年)．所有这些方法都可以进行分数测定(%)，但绝对定量不受受体cfDNA变化(如感染)的影响，只对ddPCR (Oellerich等，2019年；Whitlam等人，2019年)．大多数这些方法的定量下限为~ 0.15% dd-cfDNA，不精密度(CV)为3%-12% (Oellerich等，2020年)．心脏移植受者的研究也报告了较低的基线水平0.02% (Agbor-Enoh等人，2021a)、0.04% (Kim等人，2022年)及0.07% (Khush等人，2019年)．在肾脏移植方面，最近发表了0.08%的下限(Halloran等人，2022年)．如果用适当的管子收集，样品可在室温下稳定约1周(Oellerich等，2020年)．
供者来源的无细胞DNA在移植中的临床有效性
dd-cfDNA在肾移植中的临床有效性已在20多项研究中得到证实(奈特等人，2019年；Wijtvliet等人，2020年；Filippone和Farber, 2021年；Oellerich等人，2021年；肖等人，2021年；Steggerda等人，2022年)．在移植后的前2周内，通常呈指数下降至基线水平(Oellerich等，2019年)，可以用来区分移植物损伤。由于尿路感染、血液动力学问题或手术并发症，在一些患者中观察到dd-cfDNA异常的非指数性下降(Gielis等，2018)．大多数调查dd-cfDNA(%)的研究使用了0.74%到1.0%之间的临界值(Oellerich等人，2021年)．基于灵敏度和特异性同时最大化的阈值，发现分数次测定值为0.43%，适当的绝对定量值为52 cp/ml (Oellerich等，2019年)．虽然使用了不同的概念来建立检测排斥反应的阈值，但参考人群中dd-cfDNA的中位数值非常相似，从0.21%到0.40% (布鲁姆等，2017；Oellerich等，2019年；西德尔等，2019年；Oellerich等人，2021年)．
在长期监测中，观察到dd-cfDNA(%)从0.8%增加到2.1%(第90百分位)的时间依赖性增加，这是总cfDNA系统性并发下降的结果，可能是由于钙调磷酸酶抑制剂暴露时间的减少(Schuetz等，2020年)．由此产生的dd-cfDNA分数(%)随时间而增加，使长期治疗中使用单一截止值的问题(Schuetz等，2020年)．与分数dd-cfDNA(%)相比，在长期监测期间绝对定量阈值(cp/ml)不受影响(Schuetz等，2020年)．
在t细胞介导的排斥反应(TCMR)或抗体介导的排斥反应(ABMR)患者中，绝大多数研究都观察到dd-cfDNA的升高(奈特等人，2019年；西德尔等，2019年；Oellerich等人，2021年；Halloran等人，2022年)．ABMR与20%-30%同种异体移植物损失相关(Kim等人，2014)．早期和亚临床ABMR检测使早期适应治疗干预成为可能，并可能改善预后(Mayer等人，2022年)．
在DSA +患者中，ABMR的早期检测是很重要的，dd-cfDNA也可能有助于鉴别“惰性”DSA患者和因DSA导致移植物损伤的患者(Kataria等人，2021年)．一项证明这一假设的临床试验(NCT04897438)正在进行中。检测dd-cfDNA对监测新型ABMR疗法对器官损伤的潜在治疗效果也很有意义，如抗cd38单克隆抗体Felzertamab (Mayer等人，2022年)．
在多中心DART研究中(布鲁姆等，2017)通过测定dd-cfDNA(%)可以很好地检测急性和慢性ABMR。对于TCMR，用所采用的检测方法无法充分检测到dd-cfDNA的升高。这已在一项独立研究中得到证实(黄等人，2019)．观察到的TCMR假阴性结果可能是由于在这两项研究中使用了相对较长的扩增子(100-130 bp)，导致短DNA片段检测不足(Grskovic等，2016)．与ABMR相比，TCMR主要是肾小管间质间隙的过程，可能存在更广泛的dd-cfDNA片段化。这一假设需要进一步的调查来证实。
INDEL q PCR已经证明，使用更小的扩增子可以显著提高dd-cfDNA的定量(Dauber等人，2020年)．在一项进一步的回顾性研究中，使用基于SNP的多重PCR NGS检测TCMR(小管炎评分>2，间质炎评分>2)可以很好地检测到(西德尔等，2019年)．使用同样的方法，在最近的前瞻性三叶多中心研究Halloran等(Halloran等人，2022年)将部分dd-cfDNA水平与基于微阵列的分子显微镜诊断系统(MMDx)和传统组织学获得的指征活检结果进行比较。Dd-cfDNA与分子和组织学排斥结果密切相关，表明这种检测有可能减少不必要的活检。绝对定量也能很好地区分TCMR、ABMR、边缘TCMR和急性管状坏死患者与稳定和活检阴性患者(表1)．检测急性排斥反应的诊断准确性(AUC-ROC)在绝对定量(83%)方面优于dd-cfDNA分数测定(73%)(Oellerich等，2019年)．
表1．ktx后第一年用dd-cfDNA绝对定量检测排斥反应。
dd-cfDNA分数测定的一个问题是，它受到由白细胞减少、白细胞增多和炎症疾病引起的总cf-DNA水平变化的影响;导致错误的升高或降低结果(Whitlam等人，2019年；Osmanodja等人，2021年)．尤其重要的是，当CNI逐渐变细时，由于CNI对白细胞稳定性的影响，dd-cfDNA百分比的系统性增加(Schuetz等，2020年)．在临床实践中，将dd-cfDNA的绝对定量和丰度分数与总cfDNA相结合似乎可以提供最全面的诊断信息(Oellerich等，2019年；Whitlam等人，2019年；Oellerich等人，2021年；Osmanodja等人，2021年)．
根据迄今报道的数据，dd-cfDNA在检测KTx后的排斥反应方面的总体诊断性能似乎是足够的(Oellerich等人，2021年)．根据已发表研究的汇总数据，dd-cfDNA(%)的诊断准确性(ROC AUC)平均为0.81(7项研究)，dd-cfDNA (cp/ml)的诊断准确性(ROC AUC)平均为0.87(2项研究)。Oellerich等人，2021年)．灵敏度平均值dd-cfDNA为80% (%)，dd-cfDNA为79% (cp/ml)。对于特异性，dd-cfDNA(%)和(cp/ml)的平均值均为76%。dd-cfDNA阳性预测值(取决于研究人群中不同的排异率)为56% (%)，dd-cfDNA阳性预测值为33% (cp/ml)。90%的dd-cfDNA阴性预测值(%)和97%的dd-cfDNA阴性预测值(cp/ml)表明该试验有助于排除高概率的排斥反应。然而，其他可能引起升高的因素，如复发性原发疾病，只有通过肾移植活检才能排除高概率。（Oellerich等人，2021年)．
Dd-cfDNA在肝脏中也能检测到排斥反应(Schuetz等，2017；Levitsky等人，2022年)，心(Snyder等人，2011年；De Vlaminck等人，2014；Khush等人，2019年；里士满等人，2020年；Agbor-Enoh等人，2021a；Sorbini等人，2021年)、肺(Rosenheck等人，2022a)和胰肾同步(Ventura-Aguiar等人，2022年)移植病人的准确率较高(表2)．ld - cfdna分数也显著升高。De Vlaminck等，2015)．在心脏移植受者中97%的高阴性预测值(Khush等人，2019年；Kim等人，2022年；Knuettgen等人，2022年)有可能减少严重并发症发生率为0.5%-1%的心内膜心肌活检的数量(米勒等人，2013；Knuettgen等人，2022年)．
表2．血浆dd-cfDNA对实体器官移植排斥反应的诊断性能。
监测dd-cfDNA也可能有助于指导免疫抑制最小化。在他克莫司水平变化的肾移植患者中，增加的dd-cfDNA值与亚治疗他克莫司浓度相关(Oellerich等，2019年)．因此，dd-cfDNA可能有助于检测免疫抑制不足导致的免疫激活引起的亚临床移植物损伤(Oellerich等人，2021年)．这对于表位错配负担高、免疫能力强或不粘附的肾受体非常有用。
在最近的一项研究中，在肝移植后亚临床移植物损伤期间检测了dd-cfDNA的分数，并通过监测活检证实(鲍曼等人，2022年)．定量下限为0.15%，检测间CV范围为3% ~ 5.4%。从无组织学排斥迹象的患者(中位数2.2%)，亚临床TCMR(中位数3.5%)到临床明显TCMR(中位数23%)，Dd-cfDNA显著增加。数据证实了肝脏的10%临界值(Schuetz等，2017)对急性排斥反应具有类似的敏感性和特异性。在免疫抑制最小化之前，应排除亚临床TCMR。纵向dd-cfDNA监测亚临床损伤的有效性应在未来的前瞻性研究中进行评估。
大多数研究发现，dd-cfDNA在识别有或没有急性排斥反应的患者方面明显优于eGFR (布鲁姆等，2017；西德尔等，2019年；Whitlam等人，2019年；Oellerich等人，2021年)．然而，Dd-cfDNA释放不是排斥特异性的，由于移植物损伤的其他原因，也可以观察到升高(布鲁姆等，2017；Oellerich等人，2021年)．肾盂肾炎和经活检证实的BKV肾病患者中也发现dd-cfDNA水平升高(Sigdel等人，2013；布鲁姆等，2017；Oellerich等人，2021年)．特别是BKV肾病患者尿中dd-cfDNA浓度显著升高(Sigdel等人，2013；Chen等人，2022)．在间质纤维化/管状萎缩(IFTA)患者中，只观察到少量的dd-cfDNA增加(Sigdel等人，2013；布鲁姆等，2017；Oellerich等，2019年；Whitlam等人，2019年)可能是由于存活细胞数量较低。由于纤维化过程缓慢，IFTA可能与缓慢死亡的肾细胞释放的DNA和存活细胞随时间的推移而逐渐减少无关。然而，在活动性疾病进展阶段，在IFTA中dd-cfDNA值可能升高。
供者来源的无细胞DNA检测的好处
先前发表的价值主张概念(普莱斯等，2016)可用于描述dd- cfdna检测对参与器官移植的利益攸关方的好处(Oellerich等，2020年)．
在移植中，各种利益攸关方都参与到提供和接受护理中。有一些移植病人的护理可能会因对移植物损伤的低侵入性检测而改变，有管理实体器官移植病人的临床医生，有分析和解释检查结果的实验室医学专家，还有医院管理层，有参与提供基于价值的保健服务的保险公司、公共支付人和政策制定者。在这种情况下，价值被定义为相对于成本的结果。对于患者而言，与结果相关的以下好处是:发现或排除移植物损伤或排斥反应，早期发现移植损伤和随后的干预，活检替代，亚临床抗体介导排斥反应的早期诊断，免疫抑制不足的检测，评估同种异体肾移植的感染并发症和个性化免疫抑制。移植医生的好处包括更好的个性化免疫抑制指导;例如，在减量过程中，增强的活检解释，较少的免疫抑制的试错变化，较少的时间处理并发症，排斥治疗的反应指征。检验医学专家将更多地参与分子诊断学的使用和解释检测。医院管理、保险公司、公共支付人和政策制定者可以预期，由于照顾者的负担减轻，可以节省费用;例如，由于很少再移植或较少返回到KTx透析。
Dd-cfDNA在节约成本方面具有巨大潜力。急性排异反应与护理费用的显著增加相关(17000 - 28000美元/年)(First et al.， 2017)．在超过60%的移植物失败病例中，TCMR和ABMR导致移植物损失(Mayrdorfer等人，2021年)．移植失败后再进行透析的患者每年平均花费约7.5万美元。如果患者再次移植，平均费用约为11万1000美元。移植的年化成本低于透析成本的25%(16,844美元vs. 70,581美元)(First et al.， 2017)．与这些费用相比，ddPCR的dd-cfDNA检测是合理的，根据德国医疗费用法典(GOÄ)，每次检测约401美元(Oellerich等人，2021年)．正如这些数据显示的，移植结果的改善可以节省大量的成本。
为了在临床实践中实施dd-cfDNA，以下几点是相关的。根据所需的周转时间，移植中心可以自行设置测试，也可以利用合格的外部中心实验室。使用ddPCR的结果约需1个工作天，而使用NGS的结果需2-3个工作天(Oellerich等人，2021年)．实验室内的实施需要有适当的仪器(例如，Illumina NGS仪器或Biorad ddPCR)。合格的检验医学专家和质量管理程序也是必要的。前瞻性随机结局研究的临床效用评估和临床实践建议的发展是可取的。用于监视实现测试的影响的度量在表3．
表3．监控实施影响的量度(Oellerich等，2020年)．
结论和未来展望
总之，有关临床有效性的证据表明，dd-cfDNA监测可以促进个性化免疫抑制，从而潜在地减少移植物过早丢失和医疗保健费用(奈特等人，2019年；Agbor-Enoh等，2021b；Filippone和Farber, 2021年；Oellerich等人，2021年)．因此，在美国，医疗保险已经为dd-cfDNA常规检测提供了覆盖范围。该测试为早期发现或排除排斥反应提供了可操作的信息。这可能有助于发现免疫抑制不足，指导免疫抑制最小化。目前正在研究肾移植受者的临床应用(NCT 03326076)，使用dd-cfDNA监测的患者的临床结果将与没有监测的匹配对照队列进行比较(奈特等人，2019年)．在另一项研究(精准医疗可以预防AMR:在加拿大应用精准医疗技术预防抗体介导的排斥反应和过早肾移植损失)中，dd-cfDNA正在与其他免疫策略结合进行测试。这些包括HLA表位供体匹配、T细胞受体测序、免疫细胞亚群的深层细胞表型分析和常规DSA监测，以实现个性化免疫抑制。dd-cfDNA与传统和其他新型生物标记物的结合，如趋化因子CXCL9和CXCL10 (诺兰等人，2020年；杨等人，2020)，应进一步探讨。对微rna的研究尚处于探索阶段，联合使用可能提高肾移植排斥反应检测的临床应用价值(Matz等，2016；Ledeganck等人，2019年)．此外，免疫序列测序具有移植后免疫监测的潜力。未来的研究可能会测试dd-cfDNA序列测定与免疫监测(T细胞受体测序、激活B细胞测序)的结合是否有助于早期发现导致移植物损伤的免疫激活(Alachkar等，2016；皮内达等人，2019)．预期所有这些研究将为dd-cfDNA监测对临床结果的影响提供见解。
将所有相关临床和诊断结果的可用数据与dd-cfDNA结果进行整合，可以实现个体化移植患者治疗(Oellerich等人，2021年)．
作者的贡献
所有列出的作者都对这本书做出了实质性的、直接的和智力上的贡献，并批准其出版。
利益冲突
MO担任Oncocyte的顾问(Irvine, California, United States)。KB-K、JB和ES是Chronix Biomedical GmbH的员工，该公司是Chronix Biomedical Inc.(一家肿瘤细胞公司)的子公司，拥有知识产权(EP 3004388B1、EP3201361B1和US10570443B2和US11155872B2)。KB获得了Abbvie、Alexion、Astellas、Astra-Zeneca、Bristol-Myers Squibb、CareDx、Fresensius、Hansa、Hexal、MSD、Natera、诺华、大鼠、辉瑞、罗氏、山德士、Veloxis和Vifor的研究资金和/或酬金。
其余作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。
出版商的注意
本文中表达的所有主张仅代表作者的观点，并不代表其附属组织的观点，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
缩写
抗体介导的排斥反应;AR，急性排斥反应;BKV、BK多瘤病毒;BKV N、BK多瘤病毒相关肾病;cfDNA，无细胞DNA;慢性同种异体肺移植功能障碍;CXCL10, cxc -趋化因子配体10;CXCL9, cxc -趋化因子配体9;dd-cfDNA，供体来源的无细胞DNA;ddPCR，液滴数字PCR; DSA, Donor-specific antibodies; HLA, Human leukocyte antigen; IFTA, Interstitial fibrosis/tubular atrophy; INDEL, Insertion/deletion; MMDx, Molecular Microscope Diagnostic System; NGS, Next-generation sequencing; NPV, Negative predictive value; PCR, Polymerase chain reaction; PPV, Positive predictive value; ROC AUC, Receiver operating characteristic area under the curve; SNP, Single nucleotide polymorphism; TCMR, T-cell mediated rejection.
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关键词:供者来源的无细胞DNA，移植监测，移植物损伤，个性化免疫抑制，液体活检
引用:Oellerich M, Budde K, Osmanodja B, Bornemann-Kolatzki K, Beck J, Schütz E和Walson PD(2022)供者来源的无细胞DNA作为移植诊断工具。前面。麝猫。13:1031894。doi: 10.3389 / fgene.2022.1031894
收到:2022年8月30日;接受:2022年10月11日;
发表:2022年10月21日。
编辑:
Sophie Visvikis-Siest (Sofia Siest)法国洛林大学版权©2022 Oellerich, Budde, Osmanodja, Bornemann-Kolatzki, Beck, Schütz和Walson。这是一篇开放获取的文章创作共用署名许可(CC BY)。允许在其他论坛使用、分发或复制，前提是根据公认的学术惯例，注明原作者和版权所有人，并引用本期刊的原始出版物。任何不符合这些条款的使用、分发或复制都是不允许的。
*通信:迈克尔•Oellerichmichael.oellerich@med.uni-goettingen.de