开发和验证一种新的与细胞衰老相关的预后特征，用于预测肝细胞癌的生存和免疫景观
鲁伊太阳
1
__，
王许
1
__，
佳洁陈2
__，达腾3.，时新陈1，Xucan涂1，Zhenglin王1，小民左1，湘魏4，李林4，清张4，小民张4，Kechao唐4，
Huabing张
4、5*和
魏陈
1＊- 1安徽医科大学附属第一医院普外科，中国合肥
- 2安徽医科大学附属第一医院皮肤科，中国合肥
- 3.安徽医科大学附属滁州医院肝胆胰外科，滁州第一人民医院，滁州
- 4安徽医科大学基础医学院代谢疾病研究中心生物化学与分子生物学教研室，合肥
- 5安徽医科大学附属滁州医院，滁州第一人民医院，滁州，中国
背景:细胞衰老是一种典型的不可逆生命停滞形式，近期研究表明长链非编码核糖核酸(long non-coding ribonnucleic acids, lncRNA)调控着各种肿瘤的发生发展。在本研究中，我们试图构建一种基于衰老相关(sr) lncRNAs的新的特征，用于预测肝细胞癌(HCC)患者的生存和相关的免疫景观。
方法:从癌症基因组图谱数据库中检索了424例HCC患者的srlncrna表达谱。进行Lasso和Cox回归分析，以确定与衰老相关的差异表达的lncrna。使用受试者工作特征(ROC)曲线、Kaplan-Meier分析、Cox回归分析、nomogram和校准来检查特征的预测效率。分析了基因集富集分析、免疫分析和半最大抑制浓度(IC50)预测的危险组。采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3在正常的肝细胞和HCC细胞系中
结果:我们鉴定出3个srlncrna (AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3)，构建了一个新的风险模型。ROC曲线和Kaplan-Meier分析结果均与预测相符。建立nomogram模型，准确预测患者预后。风险评分还与免疫细胞浸润状态、免疫检查点表达和化学敏感性相关。qPCR结果显示AC026412.3和AL451069.3在肝癌细胞株中表达显著上调。
结论:新型srlncRNA (AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3)的特征可能为肝癌患者的新疗法和预后预测提供见解。
1介绍
癌症是全球主要的死亡原因之一(Bray等人，2021年)．2020年报告了1900多万例新发癌症病例和近1000万例癌症相关死亡，其中包括90多万例肝癌新发病例和80万例相关死亡(Sung等人，2021年)．肝癌在所有癌症类型中发病率排名第七，死亡率排名第三。肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌类型。东亚和非洲的HCC发病率最高，其发病率和死亡率在欧洲和世界其他地区仍在上升(Llovet等人，2021年；Sung等人，2021年)．由于手术和化疗的进展，HCC患者的预后有了很大的改善，肿瘤免疫治疗的进展和免疫检查点抑制剂的使用也改善了HCC治疗的治疗策略(Bagchi等人，2021年)．然而，更有效的早期诊断HCC的分子生物标志物对于改善HCC患者的临床预后至关重要。
细胞衰老是一种典型的不可逆的生命停滞形式，有助于灭活和消除患病的、功能失调的和其他不必要的细胞。它通常是由各种条件引起的，如微环境压力、细胞器和细胞基础设施的损伤以及细胞信号网络的不平衡。然而，所有这些情况都与衰老过程中观察到的各种器官中衰老细胞丰度的增加有关。它被认为是癌症的基本特征之一(Hanahan 2022)．
长链非编码核糖核酸(lncrna)由>200个核苷酸组成，不能翻译成功能蛋白(Iyer等人，2015)．在人类基因组中，有超过100,000个已识别的lncrna，其中许多已被表征(Heery et al.， 2017)．lncrna通常是基因表达和功能的主要调节因子，通过转录后、转录和表观遗传调控(卡斯特罗-奥罗佩萨等人，2018年)．之前的研究表明lncRNAs可以影响免疫微环境;因此，它们可能在恶性肿瘤的发生和发展中发挥作用(Atianand等，2017)．HOX转录反义RNA在结肠肿瘤组织中表达上调，并与肿瘤分期、侵袭转移及患者生存时间相关(Luo等，2016；Tatangelo等人，2018；Wei等，2020）;它也与癌症的生长和转移有关(Wei等，2020)．赵等(2019)报道lncRNA心肌梗死相关转录本下调显著促进细胞衰老，抑制HCC进展。Montes等人(2021)将MIR31HG确定为衰老相关病理治疗的潜在治疗靶点。衰老相关(sr) lncrna在恶性肿瘤中的作用尚未得到很好的研究;因此，获得更多关于srlncrna的知识将有助于我们更好地理解它们在癌症治疗中的作用。
近年来，许多研究开发了基于编码基因或非编码rna预测癌症预后的特征。Kandimalla等人(2020)确定了预测胰腺导管腺癌生存的特征。Chen et al. (2021)利用免疫相关基因构建头颈部肿瘤预后指标。Zhou et al. (2021)发现了一种与免疫相关的lncRNA标记，以预测HCC患者的生存和免疫状况。然而，只有少数研究关注srlncrna的特征发育。
本研究旨在确定srlncrna在预测HCC预后和免疫状况方面的价值，从而为这一不断发展的研究领域做出贡献。我们的发现可能有助于提高我们对细胞衰老在HCC中的作用的理解，并导致治疗策略的进展。
2材料与方法
2.1数据收集
来自HCC患者的RNA-seq表达数据，包括374个肿瘤和50个非癌样本，来自使用TCGA- assembler的癌症基因组图谱(TCGA)数据库。根据患者的id，将患者的临床数据与他们的转录组数据进行比较，这些转录组数据使用以下纳入标准进行筛选:[1]HCC组织学诊断，[2]可用表达谱，[3]总生存期至少为30天(Song等，2021年)．从TCGA数据集(344例患者)中提取符合纳入标准的数据进行后续分析，279个衰老相关基因(解释在补充表S1)是从文献检索和CellAge公共数据库中检索到的。
2.2衰老相关长链非编码核糖核酸的鉴定
使用Pearson相关性来鉴定srlncrna，以评估lncrna与衰老相关基因(srg)之间的相关性。使用R软件(版本4.1.3)中的Bioconductor limma包，比较HCC和非肿瘤样本，以以下标准定义差异表达lncRNAs (DElncRNAs): |log2 (fold change, FC) | >1，假发现率< 0.05 (里奇等人，2015年)．通过相关分析，共鉴定出279个衰老相关基因和DElncRNAs相关基因。因此，根据Pearson相关系数> 0.5和p< 0.001。
2.3衰老相关lncRNA预后模型的构建
首先，我们从整个样本中随机划分患者(n= 342)以1:1的比例进入训练集或测试集。其次，使用单变量Cox (uni-Cox)回归筛选训练集中的srlncrna(与生存相关)(p< 0.05)。第三，采用最小绝对收缩选择算子(LASSO)和多元Cox (multi-Cox)回归分析进行进一步筛选。最后，建立了srlncRNAs在HCC中的预后模型。我们计算HCC的风险评分为:风险评分=∑n k=1expression (lncRNAk) × coefficient (lncRNAk) (Hong等，2020)．使用中位数，我们将病例分为两组:高组和低组。此外，使用测试集进行签名验证。使用卡方检验将特征与临床变量相关联。进行Wilcoxon符号秩检验以确定两组间临床特征风险评分的差异。采用R包“rms”构建连接特征风险评分与临床因素的nomogram模型，并采用校准曲线对模型进行评估(Iasonos等人，2008年)．
2.4基因集富集分析
使用策划基因集(kegg.v7.4.symbol .gmt)，广义GSEA v.4.2.3用于检测高风险和低风险群体相关途径，标准为NOMp< 0.05和| NES |> 1 (Subramanian et al.， 2005)．
2.5浸润免疫细胞分析
在TIMER2.0中下载的数据集(XCELL、TIMER、QUANTISEQ、MCPcounter、EPIC、CIBERSORT和CIBERSORT)中计算的免疫浸润状态和浸润估计(http://timer.cistrome.org/)，用Wilcoxon符号秩检验分析免疫浸润细胞含量的差异。利用该网站上关于HCC浸润估计的概要，使用Wilcoxon符号秩检验和以下R包-“limma”，“scales”，“ggplot2”和“ggtext”，创建了一个显示免疫浸润细胞含量差异的气泡图(Bagchi等人，2021年)．
2.6免疫检查点及免疫相关基因预后指标的调查
采用“ggpubr”R包比较两组免疫检查点相关基因的表达。采用多考克斯回归分析构建IRGPI模型，验证预后模型对免疫治疗的影响。
2.7不同亚组对化疗药物的敏感性
我们使用半最大抑制浓度(IC50)评估常见化疗药物(紫杉醇、阿霉素、贝沙罗汀、比卡鲁胺、伊马替尼和替法尼)的治疗效果，使用R包“prophetic”，数据来自癌症药物敏感性基因组学。
2.8 RNA分离和实时定量PCR
使用TRIzol试剂(美国Life公司)从肝癌细胞系(Huh7、HepG2和Hep3B)和正常肝细胞系(LO2)中提取总RNA。NanoDrop 2000(美国Thermo Scientific公司)用于测定RNA纯度和含量。使用RevertAid RT试剂盒(Thermo，美国)合成互补dna，并使用qPCR Master mix(万能，中国)在Bio-Rad CFX系统上进行qPCR。qPCR所用引物序列如下:AC026412.3，正向:5 ' - tgtgaggtgagggagcgt -3 '，反向:5 ' -TGAGCCAAAGGGATCTACGC-3 ';AL451069.3，正向:5 ' -GGGACACGGACCTAGACACT-3 '，反向:5 ' -CCTGCAAGACCGTAGCCTC-3 ';ALO31985.3，正向:5 ' - tctcactatgttgctggactg -3 '，反向:5 ' -CCACAGATCACTAACACGCC-3 '。我们以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GAPDH)作为内参，用2——ΔΔCt的方法。使用非配对t检验比较三种lncrna的表达水平。
3的结果
3.1衰老相关lncrna的定义
我们的研究流程图如图所示图1．我们从TCGA数据库下载了50个正常样本和374个肿瘤样本来鉴定srlnrna。接下来，422 srlncrna (图2一个)，通过对279个衰老相关基因和delncrna在正常和肿瘤样本间的共表达分析得到。其中402项上调(图2B、C)．
图1．研究流程图(LIHC:肝细胞癌;N:数量;OS:总体生存)。
图2．(一)该网络显示了DEsrlncRNAs和mRNAs之间的相关性(B, C)TCGA数据集中的desrlncrna的热图和火山图。
3.2模型的建立与验证
采用单变量cox回归分析(图3一)， 33个与总生存率显著相关的srlncrna被确定并显示在热图中(图3 b)．利用LASSO和multi-Cox回归分析进一步筛选这些lncRNAs，在HCC中提取了3个与衰老相关的lncRNAs (图3C、D)．此外，所有lncrna在桑基图中均上调(图3 e)．
图3．(一)采用uni-Cox回归分析提取33个lncrna，(B)33个预后lncrna的热图，(C, D)Lasso回归分析筛选出与衰老相关的lncrna(E)33个衰老基因及相关lncrna的桑基图。
风险评分采用以下公式计算:风险评分=AC026412.3× (1.6474) +AL451069.3× (0.6620) +AL031985.3×(1.0340)。
然后，我们比较了这些lncrna在低危组和高危组的风险评分、生存状态、生存时间和相关表达标准在训练、测试和整组中的分布情况。这些结果提示高危组预后较差(图4 l)．
图4．热点图(两者)，风险评分(D-L)，生存状态(胃肠道),和Kaplan-Meier曲线(J-L)分别在训练，测试，和整组中。
根据卡方检验(图5一个)和Wilcoxon符号秩检验，风险评分与临床分级显著相关(图5 b)、美国癌症联合委员会阶段(图5 c)和T阶段(图5 d)．此外，年龄、性别、分期等常规临床病理特征也显示高危组预后较差(图5 e-j)．这些结果表明，该风险模型与美国联合委员会癌症分期系统高度一致，具有较好的预测预后的能力。
图5．条形图(一)散点图(罪犯)肿瘤分级、美国癌症联合委员会分期、T分期与风险评分显著相关。＊p< 0.05和**p< 0.01。(E-J)Kaplan-Meier分析显示低危组患者生存时间较长。
在单cox和多cox回归分析中检测预后因素(图6 a, B)，并利用风险评分和其他临床特征构建nomogram，以更好地预测HCC患者的生存(图6 c)．更重要的是，nomogram与实际观测值相关，如校准曲线(图6 d)．整组患者的1、3、5年ROC曲线下面积分别为0.754、0.675、0.670 (图6 e)．与其他临床病理特征相比，风险评分的ROC曲线下面积最大(图6 f)．
图6．(A, B)HCC中单cox和多cox回归分析的森林图，(C)用nomogram联合风险评分、年龄和肿瘤分期来预测HCC的1-、3-和5年OS(D)通过将nomogram与校准曲线相关联来评估nomogram。(E)模型预后的ROC曲线(F)风险评分与临床病理特征的ROC曲线。
3.2.1基因集富集分析
为了探索两个危险组的不同生物学功能，采用GSEA软件以假发现率< 0.25，|NES| >1.5，和为标准，识别出两个危险组中排名前五的通路p< 0.05。事实上，大多数通路与肿瘤发生或免疫相关，如“脂肪酸代谢”、“过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路”、“补体和凝血级联”(图7)．因此，我们对模型进行了免疫分析。
图7．(一)根据GSEA分析，在高风险和低风险人群中富集的前五种途径，(B)气泡图显示了危险人群和免疫细胞，还有(C)显示风险评分和免疫细胞的折线图。
3.3免疫治疗风险模型的探索
使用Spearman相关和Wilcoxon符号秩检验，发现风险评分与几种被广泛研究的免疫细胞(如B细胞、CD8+T细胞和癌症相关成纤维细胞)在不同平台(图7 b, C)．免疫检查点相关基因在高危组的表达高于低危组(图8)．这意味着高危组患者可以选择更适合免疫治疗的检查点抑制剂(科诺等人，2020年)．此外，高危组免疫格局中免疫亚型(IS) 1和2的比例较大，3 (IS)亚型的比例较小。图8 b)，这意味着它的预后更差(癌症的免疫景观)。与以往报道一致，高危组中IC50值较低的化疗药物较多(图8 c)，例如紫杉醇(刘等，2020） (图8 c)．
图8．(一)风险组中38个检查点表达的差异，(B)高危和低危人群的免疫亚型，以及(C)高危人群的免疫治疗预测。
3.4 .的表达水平验证AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3
的表达水平AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3， qPCR检测正常肝细胞株和肝癌细胞株。的表达水平AL451069.3而且AC026412.3在肝癌细胞系中比正常肝细胞系(图9)．此外，这些srlncRNAs在不同肝癌细胞系中的表达水平也不同(补充图S1)．
图9．AL031985.3的相对RNA水平(一), AC026412.3(B)、AL451069.3(C)在正常的肝和肝癌细胞系中。数据表示为Mean with SD， *p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001。
4讨论
4.1资源识别主动性
细胞衰老已被发现在包括HCC在内的各种类型恶性肿瘤的发展和进展中发挥作用，并被认为是从慢性肝病发展为HCC的障碍。Xiang et al. (2021)报道lncRNA PINT87aa在衰老的HCC细胞中上调，并可通过阻断foxm1介导的PHB2诱导细胞周期停滞。Mittermeier等人(2020)描述了细胞衰老在肝癌治疗新靶点药物开发中的特征和作用。Karakousis等人(2020)表明乙肝是细胞衰老和HCC发展之间的一个联系。更好地理解细胞衰老在HCC中的作用，可能为HCC的治疗提供新的视角，并有助于开发新的治疗方法。
从TCGA数据库中下载了377例HCC患者的表达模式和临床信息，从CellAge公共数据库中鉴定了衰老相关基因，并进行了共表达分析以确定可能参与HCC的基因。使用LASSO和uni-Cox回归分析筛选了三种与预后相关的desrlncrna来构建特征:AC026412.3，AL451069.3,AL031985.3．在这三种srlncRNAs中，AL031985.3在先前的研究中已被确定为HCC的潜在治疗靶点(贾等，2020)．此外，桑基图显示，这三种srlncrna与少数编码基因相关，包括PPT1，PTGDS,ELOVL1．高PPT1PPT1表达与HCC患者预后不良相关，抑制PPT1可增强HCC患者对索拉非尼治疗的敏感性(徐等，2022)．PTGDs乳腺癌的预后生物标志物(Adekeye等人，2022年)．Hama et al. (2021)证明了的表达ELOVL1在CRC组织中显著高于正常组织。这些结果表明，这三种被鉴定的srlncrna可能作为癌症诊断和治疗的潜在生物标志物。
根据三种srlncrna的表达水平计算风险评分，根据计算出的风险评分将每个队列的患者分为高危组和低危组。Kaplan-Meier曲线显示低风险评分患者预后较好。基于单cox和多cox回归分析的结果，风险评分可能是HCC患者的独立预后因素。此外，nomogram在肿瘤学中被广泛应用，特别是用于生存预测(Iasonos等人，2008年；Balachandran等人，2015)．nomogram模型和校正图对HCC预后预测效果较好。此外，还分析了风险评分与HCC临床特征的相关性;风险评分与肿瘤分级、AJCC分期、T分期显著相关，提示风险评分可用于预测HCC的发生发展。然而，Wilcoxon符号秩检验结果显示，进展期(G4期、IV期和T4期)与计算的风险评分无显著相关。因为TCGA数据库的样本内容太少，我们需要收集更多的样本重新验证。
基于GSEA的结果，我们将注意力集中在免疫因子上。先前的研究表明，肿瘤浸润CD4+T细胞可上调免疫检查点基因(Toor等人，2019年)．我们使用TIMER2.0评估风险评分与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系(Van Veldhoven等人，2011；纽曼等人，2015；Becht等人，2016；阿兰等人，2017年；李等，2017；Finotello等人，2019年；塔明加等人，2020年)．结果显示，风险评分与B细胞、CD8呈正相关+T细胞和癌症相关的成纤维细胞。为了进一步探索检查点阻断治疗和化疗的潜力，我们比较了两组免疫检查点基因的表达水平，在本研究中发现了38个检查点基因在两组之间的差异表达。与检查点基因的改变一致，6种常见化疗药物的IC50值在低风险组较高。这些发现表明，高危评分的患者可能更适合免疫治疗和化疗。
索尔松等人(2018)确定了ISs，包括伤口愈合(IS1)、IFN-γ主导(IS2)、炎症(IS3)、淋巴细胞耗尽(IS4)、免疫平静(IS5)和TGF-β主导(IS6)类型的癌症。观察到IS1和IS2预后较差，IS3预后较好，且IS3 PBRM1突变富集。此外，PBRM1突变患者对免疫治疗更敏感(苗等，2018)．我们的研究表明，低风险评分患者的IS3比例较大，符合Kaplan-Meier曲线。
然而，我们的研究有一些局限性。首先，我们的分析是基于公共数据集和回顾性收集的样本，这可能导致了固有的病例选择偏差。其次，还需要进一步的实验来证实我们的发现。最后，我们的研究没有纳入手术、新辅助化疗、肿瘤标志物相关的临床特征，需要临床病例来进一步验证我们的结论。
总之，本研究构建的基于细胞衰老的预后特征可能有助于预测HCC的生存期和指导临床治疗。我们的发现可能会提高对HCC细胞衰老的认识，并提供更有效的治疗策略。然而，还需要更多的实验和临床病例来验证这些发现。
数据可用性声明
本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和登录号可以在article/中找到补充材料．
作者的贡献
RS、徐w、JC负责稿件的撰写和提交。DT、SC、ZW和XZ对数据分析和可视化做出了贡献。XiW, LL, QZ, XZ, KT对稿件进行审阅编辑。HZ和WC设计了这项研究。所有作者已阅读并认可最终稿。
资金
国家自然科学基金(no .81670517和81870402)和安徽省转化医学研究所科研基金(2021zhyx-C30)资助。
致谢
我们感谢TCGA数据库提供商提供他们的平台和贡献者上传他们有意义的数据集。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
补充材料
本文的补充材料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fgene.2022.949110/full#supplementary-material
补充表S1| 279个衰老相关基因。
补充表S2| 422个衰老相关lncRNAs。
补充表S3| 33个lncrna经单因素Cox回归分析提取。
补充表S4| 3个lncrna用于构建预后模型。
补充表S5| qRT-PCR原始数据。
补充表S6|本研究使用的数据和脚本上传到建国云，并附上链接。
缩写
DElncRNAs，差异表达的lncRNAs;GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;基因集富集分析;肝细胞癌;IRGPI，免疫相关基因预后指数;IS，免疫亚型;公里,kaplan meier;最小绝对收缩和选择算子LASSO;lncRNA，长链非编码核糖核酸;multi-Cox，多元Cox; IC50, Half-maximal inhibitory concentration; qPCR, quantitative real-time PCR; ROC, receiver operating characteristic; SRGs, senescence-related genes; srlncRNAs, senescence-related lncRNAs; TCGA, The Cancer Genome Atlas; uni-Cox, univariate Cox.
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关键词:肝细胞癌，lncRNA，衰老，预后，免疫景观
引用:孙锐，王霞，陈娟，滕冬，陈松，涂霞，王铮，左霞，魏霞，林玲，张强，张霞，唐凯，张宏和陈伟(2022)预测肝细胞癌生存和免疫景观的一种新的细胞衰老相关预后特征的开发和验证。前面。麝猫。13:949110。doi: 10.3389 / fgene.2022.949110
收到:2022年5月20日;接受:2022年8月9日;
发表:2022年9月6日。
编辑:
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