结合成像和元条形码方法评价地中海硅质根状菌的丰度和多样性gydF4y2Ba

1.简介gydF4y2Ba

海洋环境是地球上最大的生态系统，居住着各种各样的浮游生物，从病毒和细菌到单细胞和小的多细胞真核生物。这些生物的大小跨度超过六个数量级，形成复杂的生态网络，维持主要的生物地球化学循环(gydF4y2BaEdwards等，2013gydF4y2Ba)．浮游植物是海洋食物网的基础，而浮游动物则占据了许多营养层次，并可通过垂直迁移和产生粪球等机制促进碳输出(gydF4y2BaStukel等，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaToullec等，2019gydF4y2Ba)．迄今为止，对浮游植物组合的研究主要集中在硅藻、甲藻和蓝藻(gydF4y2BaAlves-de-Souza等人，2008年gydF4y2Ba)，而浮游动物在海洋中的作用则是通过对桡足类和柔足类的研究(例如，gydF4y2BaBuitenhuis等，2006gydF4y2Ba)，主要是因为它们丰度高，在福尔马林中保存效果好。不过，这些是非常具体的分区，只代表浮游生物功能多样性的有限方面(gydF4y2BaLe Queré等，2005gydF4y2Ba)，在开发生物地球化学模型时忽略了其他生物的潜在作用。gydF4y2Ba

近年来，自动化采样装置、图像分析技术和机器学习算法已被开发出来，以量化海洋生物的丰度(gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaPicheral等，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaIrisson等人，2022年gydF4y2Ba)及加快分析浮游生物样本的速度(gydF4y2Ba本菲尔德等人，2007gydF4y2Ba)．这些方法在揭示以前被忽视的生物在生物地球化学循环中的发生和潜在影响(gydF4y2BaBiard等，2016gydF4y2Ba)．除了成像系统之外，dna元条形码(DNA-metabarcoding)允许广泛的分类学覆盖，已成为形态学观察的一个强有力的替代方案，被大量用于微生物群落多样性的高通量探索(gydF4y2Bade Vargas等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2Ba福雷等人，2019年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

尽管这两种方法都有好处，但都存在固有的不确定性。成像工具不能覆盖所有浮游生物的大小光谱(gydF4y2Ba隆巴德等人，2019年gydF4y2Ba)，并且需要同时使用多种工具/仪器来研究海洋生态系统的所有组成部分。另一方面，分子方法产生相对丰度和组成数据。特定类群的丰度在本质上受到其他类群丰度的影响，因此得出的结论存在偏差(gydF4y2BaGloor等，2017gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在现代海洋中，根菌是一组大小从几十微米到几百微米不等的单细胞真核生物，已知在食物网和生物地球化学循环中发挥重要作用(gydF4y2BaBiard 2022gydF4y2Ba)．在过去十年中，这一群体一直被认为是碳出口的重要来源(gydF4y2BaLampitt等，2009gydF4y2Ba；gydF4y2BaGuidi等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaGutierrez-Rodriguez等人，2018年gydF4y2Ba)、硅循环(gydF4y2BaBiard等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)和海洋生物量的重要组成部分(gydF4y2BaBiard等，2016gydF4y2Ba)．有些根菌的骨架是碳酸钙(有孔虫科)或硫酸锶(棘藻科)，而许多海洋根菌则形成硅质骨架(鼻藻属、Spumellaria、Collodaria和Phaeodaria) (gydF4y2Ba高桥等人，1983年gydF4y2Ba)．考虑到它们的分类多样性大、大小范围广及垂直生态位范围广(gydF4y2BaBiard和Ohman, 2020年gydF4y2Ba)以及各种营养模式(gydF4y2BaSuzuki and Not, 2015gydF4y2Ba)，对其完整的大小范围和对生物地球化学循环的贡献缺乏定量描述。gydF4y2Ba

从历史上看，活的根状菌是用浮游生物网和尼斯金瓶(gydF4y2BaBoltovskoy等，1993gydF4y2Ba；gydF4y2BaBoltovskoy 2003gydF4y2Ba；gydF4y2Ba石谷和高桥，2007年gydF4y2Ba)．这些传统的采样方法更有效地收集更小的样本，这些样本在数量上也更丰富(例如，gydF4y2BaBoltovskoy等，2010gydF4y2Ba)．到目前为止，体型较大的个体很少被考虑在内，主要是因为它们的骨骼很脆弱，通常在渔网中只发现了碎片。的发展gydF4y2Ba现场gydF4y2Ba成像技术使人们能够首次描述和估计这些浮游生物的特征(gydF4y2BaBiard等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaBiard和Ohman, 2020年gydF4y2Ba)．尽管最近证实它们与当前海洋生物地球化学循环有关(gydF4y2Ba如gydF4y2Ba．，gydF4y2BaBiard等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaGuidi等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)，由于数据的稀缺以及采集方法和样品分析的异质性，对活根孢菌分布和丰度的认识仍然高度碎片化。这些原生生物的采样是不完整的，它们在生物地球化学循环中的分布和作用，特别是在硅循环中，还没有完全了解。gydF4y2Ba

2017年9月，我们参加了地中海环境观测系统gydF4y2Ba格兰德中阶梯光栅gydF4y2Ba(MOOSE-GE)巡航。在这次巡航中，三种成像技术，FlowCAM, ZooScan和水下视觉剖面仪，连同DNA元条形码在相同的位置采样被结合使用。我们用这种综合方法描述了根孢菌的宽尺寸谱、丰富度和多样性。利用成像仪器获得的数据和已有的二氧化硅含量与根瘤菌生物体积之间的异速测定(gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)，我们在区域尺度上评估了根系生物成因二氧化硅存储量对硅循环的贡献和潜在的分类单元特异性贡献。gydF4y2Ba

2.材料与方法gydF4y2Ba

2.1.研究区域gydF4y2Ba

在MOOSE‐GE 2017年远征(2017年8月30日- 2017年9月24日)期间，在地中海西北部盆地的亚特兰大号客轮上的16个地点进行了采样(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)．这一地区的特点是营养贫乏，生产力区呈斑块状(gydF4y2BaMayot等，2017gydF4y2Ba)．狮子湾是深水地层的重要地区(gydF4y2BaDonoso等，2017gydF4y2Ba)，伴有强烈的中尺度活动，沿岸海流和海中涡沿盆地分布(gydF4y2BaRobinson等人，2001年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.2.环境和生物地球化学数据gydF4y2Ba

在每个站点部署了一个花环，上面装有12个Niskin瓶(12升)，并配备了一个CTD(海鸟电子设备)来测量温度和盐度。根据生物地球化学参数的要求采集样品。HPLC法测定瓶装水样中叶绿素a的浓度(gydF4y2BaUitz等人，2009年gydF4y2Ba)．为了测量生物源性二氧化硅浓度，在表层和深层叶绿素最大值(DCM)之间的3个深度采样1 L的海水，根据荧光最大值计算，过滤到0.6 μ m, 47 mm等孔聚碳酸酯过滤器(GE Healthcare Whatman)。过滤后，过滤器保存在培养皿中，室温保存。采用双消化法进行分析gydF4y2Ba布热津斯基与尼尔森(1989)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

2.3.浮游生物集合gydF4y2Ba

三网分别为64、200、500 μ m，以0.8 m s的恒定速度进行垂直牵引gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}在上面500米。每个网口都安装了一个流量计，以量化通过网的水量。一旦网上船，浓缩在每个cod端样品用4 L的0.2- m过滤的海水稀释，并分成几个子样品。gydF4y2Ba

对于64µm的鳕鱼端，1.5 L的次样品集中在50µm目的筛上。用挤压瓶小心地将浓缩样品从筛中取出，用酸性卢戈氏溶液(最终浓度为2%)保存在250毫升的深色塑料瓶中，以避免光照，并在4°C下存储，以便稍后用FlowCAM(流体成像公司)(gydF4y2BaSieracki等人，1998gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对于200 μ m的鳕鱼端，1.5 L的次样品使用180 μ m的筛进行浓缩。将筛液倒入250-mL的塑料瓶中，瓶中加入25 - 30 mL四硼酸缓冲甲醛(4%v/v)，室温下储存，以备随后用Zooscan成像系统(Hydroptic;gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了进行遗传分析，每个cod端(64、200和500 μ m)的1 L通过10 μ m的聚碳酸酯过滤器过滤。从不同大小的组分中提取的滤镜在液氮中快速冷冻，并在-80°C独立存储，直到DNA提取。gydF4y2Ba

2.4.图像采集与处理gydF4y2Ba

2.4.1.FlowCAM分析gydF4y2Ba

FlowCAM是一种用于测量和分类液体介质中的生物和颗粒(大小从3到5000 μ m，取决于所选择的目标)的成像系统。用Lugol 's溶液固定的64µm coend样品，使用villefrach平台上的FlowCAM定量成像(PIQv)分析。分析前，样品通过200 μ m的筛进行过滤，以去除大颗粒，避免FlowCAM腔室堵塞。浮游生物的计数使用FlowCAM的“自动触发模式”。样品在4倍物镜下检查，并通过3mm × 0.3mm的腔室泵送45分钟或直到达到3万张图像(体积从0.6883 ml到8.88707 ml不等)。原始图像被保存下来，用Zooprocess软件(gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.4.2.Zooscan分析gydF4y2Ba

Zooscan是一种浮游生物扫描仪，可以拍摄浮游生物样本的高分辨率图像(gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba)．样品在4%v/v的四硼酸甲醛中以4800 dpi的速度数字化，使用PIQv的Zooscan。首先用1000 μm筛网将收集的每个样品分成两个大小部分:d1为大于1 mm的微生物，d2为小于1 mm的微生物。使用元田分配器对两个大小的分数(d1, d2)进行下采样，以达到包含近500到1000个物体的等分线，并用Zooscan (gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.4.3.gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba成像- UVP分析gydF4y2Ba

水下视觉剖面仪(UVP5;水溶)集成在ctd花环上。UVP5允许采集比>700 μ m大的颗粒和浮游动物图像，并在已知体积的水中对它们进行量化。UVP操作一个4 MPix相机，可成像视野约180 x 180毫米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba镜头前方约200mm。除27站(Leg1)外，垂直剖面超过500 m，但本研究仅使用水柱上部500 m的数据，以便与浮游生物网的结果进行比较。gydF4y2Ba

2.4.4.Metabarcoding测序gydF4y2Ba

按照制造商的说明，使用MasterPure完整DNA和RNA纯化试剂盒(震中)提取DNA。之所以采用这种萃取方法，是因为它已被证明适用于骨骼强健的细胞，例如根菌(gydF4y2BaPernice等，2016gydF4y2Ba)．用通用真核引物对TAReuk454FWD1 (5 ' -CCAGCASCYGCGGTAATTCC-3 ')和TAReukREV3 (5 ' -ACTTTCGTTCTTGATYRA-3 ')对18S rDNA的V4高变量区(gydF4y2Ba斯托克等，2010年gydF4y2Ba)．使用Illumina MiSeq平台(2x250 bp)进行测序，每个样本超过50000次读取。gydF4y2Ba

2.5.数据分析gydF4y2Ba

2.5.1.成像gydF4y2Ba

所有由FlowCAM、Zooscan和UVP生成的原始图像都使用Zooprocess软件(gydF4y2BaGorsky等人，2010gydF4y2Ba)．提取的图像被上传到Ecotaxa，这是一个在线协作软件，专门用于浮游生物图像的视觉探索和分类注释(gydF4y2BaPicheral等，2017gydF4y2Ba)．随机森林算法(gydF4y2BaBreiman 2001gydF4y2Ba)用来将所有物体划分为主要的浮游生物类别。对自动分级进行目视检查，确保分级质量。只选取与硅质Rhizaria相对应的图像进行后续分析。对于每一种仪器，丰度(参见gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)，并利用与每个小块相关的形态学测量，如体长和宽度，获得生物体积(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

2.5.2.元条形码数据管理和分析gydF4y2Ba

从测序中获得的原始读数进行处理并按照DADA2 (gydF4y2BaCallahan等，2016gydF4y2Ba)．用Vsearch实现的全局搜索对得到的扩增子序列变体(ASVs)进行分类分配gydF4y2BaRognes等，2016gydF4y2Ba)使用PR2 v4.14.0数据库(gydF4y2BaGuillou等，2012gydF4y2Ba)更新为Radiolaria序列来自(gydF4y2BaMendez-Sandin 2019gydF4y2Ba)．只要在检查的48个样本中至少有2个存在ASVs，且这些样本的总读数超过10，并将ASVs划分为Phaeodaria和多胱氨酸放射虫(Spumellaria和Nassellaria，不包括Collodaria)，就可以考虑进行进一步的分析。不同大小的分数被聚集在一起。最终的数据集由48个asv组成，按样本的相对丰度归一化。gydF4y2Ba

2.6.根茎生物体积和生物成因二氧化硅含量gydF4y2Ba

计算成像标本的面积gydF4y2BaPicheral等人(2017)gydF4y2Ba．根据面积，我们计算了等效球面直径(ESD;公式1)，以防止高估个体的生物体积，因为在某些情况下，骨骼可能具有复杂的形状，包括长而不规则的刺。gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba防静电gydF4y2Ba(μ m)为等效球径，gydF4y2Ba区域gydF4y2Ba是被成像生物体的像素面积。gydF4y2Ba

然后计算生物体积(µmgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba)，用以下公式:gydF4y2Ba

其中ESD为用式1计算的球形直径。gydF4y2Ba

计算出生物体积(公式2)后，我们利用建立的对数线性关系计算出根孢菌的单个二氧化硅含量gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人(2020年)gydF4y2Ba，它将二氧化硅含量与生物体积(RgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba= 0.86):gydF4y2Ba

在哪里gydF4y2Ba问gydF4y2Ba_bSigydF4y2Ba样品(g-Si细胞)的生物成因二氧化硅含量gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

3.1.环境数据gydF4y2Ba

巡航期间的表面温度在16.0°C到22.2°C之间。集成的叶绿素gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba(排名gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba)在0- 150m层上的值，变化在2到45mg m之间gydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}．深叶绿素最大值(DCM)深度为42 ~ 95 m。生物源二氧化硅浓度，从表面到DCM层的集成范围为1.7到6.8 mml - si mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.2.不同成像技术捕捉到的生物体的大小光谱gydF4y2Ba

使用不同的成像设备对753个根虫标本进行了成像:FlowCAM(195个小片段;64-200 μ m)， zoscan (341, 200-1000 μ m)，或UVP (217;> 1000µm)。所分析的生物的整体尺寸在45 ~ 3663 μ m的当量球直径(ESD;gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．在目前的研究中，FlowCAM记录了最小的个体，其ESD范围为45 ~ 176 μ m(平均±标准偏差;103±26 μ m)。在这三种仪器中，FlowCAM是唯一一种能够捕捉到部分多胱氨酸放射虫(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba， Spumellaria和nasselellia)和属的褐囊虫gydF4y2BaChallengeriagydF4y2Ba．Zooscan捕获的ESD个体在365 ~ 1244µm(799±146µm)之间，均属于Aulacanthidae科(Phaeodaria)。UVP成像最大的个体，从945 μ m到3662 μ m(1279±429 μ m)，最小的个体属于蛇刺科，最大的细胞属于蛇刺科(Phaeodaria)。gydF4y2Ba

我们观察到FlowCAM和Zooscan捕捉到的尺寸类之间的不连续。在176 μ m (FlowCAM成像的最大个体)和365 μ m (gydF4y2Ba即gydF4y2Ba.为200 μ m网状尺寸采集的最小个体，用Zooscan成像)。然而，Zooscan和UVP捕获的约1000 μ m的生物(主要是Aulacanthidae个体)存在尺寸(ESD)重叠。为避免高估根属植物的丰度(gydF4y2Ba即gydF4y2Ba.，计算相同尺寸分数的两倍)，我们从Zooscan数据中排除了ESD大于1000 μ m的样品，从UVP数据中排除了ESD等于或小于1000 μ m的样品。gydF4y2Ba

3.3.根瘤菌的多样性和丰富度gydF4y2Ba

样本的丰度(即细胞mgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)基于定量方法(成像工具)(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．本研究中所调查的最小的大小范围(该属的鼻蝇属，Spumellaria和Phaeodaria)gydF4y2BaChallengeriagydF4y2Ba)， 64-200µm (FlowCAM)各工位丰度值最高，在5.0 ~ 61.1 cells m之间gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba（gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．在所有的站点中，小尺寸的部分主要以鼻塞拉菌为主。属的PhaeodariagydF4y2BaChallengeriagydF4y2Ba被观察到的比例较低(在被研究的16个站点中的12个;gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)．与Zooscan获得的数据相对应的200-1000 μ m的尺寸分数中，该仪器唯一成像的品类——Aulacanthidae的标本丰度最高可达3.4 cells mgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba．UVP成像的最大粒径粒(>1000µm)的根际丰度一般略低于200-1000µm粒径粒(0.3 ~ 1.9 cells m)的根际丰度gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)，但个别电台除外(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)．在这次巡游中所发现的黄貂鱼属黄貂鱼科、黄貂鱼科、黄貂鱼科、黄貂鱼科及黄貂鱼科(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

当我们检查生物体积时，我们遇到了与丰度相反的趋势(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)．用Zooscan或UVP捕获的个体(> 200µm)的生物体积值比用FlowCAM捕获的个体的生物体积值高，其组成比丰度值更接近元条形码。gydF4y2Ba

在元条形码数据中，属于最大科(gydF4y2Ba即gydF4y2Ba)对相对序列丰度的贡献最大(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)．在分析各生物类群在生物体积上的贡献时，我们发现在每个地点，独棘科和腔枝科是最具代表性的分类群，而属于较小分类群的生物则很少有代表性(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

从分子技术上估计，根孢属>64µm级的样本共占真核生物群落reads的4.53%(±3.49)，> 200µm级的样本共占11.3%(±7.80)，其中> 500µm的样本所占比例最高，为15.8%(±13.90)。在比较两种方法(成像和分子)获得的相对丰度时，我们观察到，在相同大小的采样分数上，两种方法确定的分类类群并不相同。因此，两种方法计算的相对丰度不同(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba；gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．在计算相应的发生百分比时，可以观察到不同分类组之间的差异，范围从0.1% (Aulosphaeridae)到0.9% (auacanthidae)。然而，当比较通过分子工具获得的相对丰度和通过成像技术获得的相对生物体积时，大多数被调查站点的结果更接近(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

3.4.根瘤菌对bSi常存植物的贡献gydF4y2Ba

研究了不同粒径范围对根孢二氧化硅总生物量的贡献。当利用异速生长关系(公式3)转化为生物量时，我们发现最大的个体(>1000µm)对水体中总Si存量的贡献最大，在5.2 ~ 70.3µmol-Si m之间gydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}．总体而言，除2-36和2-56近海沉积区以小型个体为主外，其余各沉积区(>64 - 1000 μ m)中小型个体对最大个体的贡献相当。这些站点的底部深度最深(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．小根状菌(<200µm)对生物成因二氧化硅样品的贡献范围为2 ~ 50%，贡献范围为1.1 ~ 39.9µmol-Si mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}（gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

4.1.根瘤菌的丰度和多样性:成像gydF4y2Ba

这项研究是为数不多的使用各种仪器和方法同时分析覆盖广泛尺寸光谱的浮游舱的研究之一。我们使用三种成像方法和遗传分析来研究根孢菌的大小范围。我们发现这些生物存在于每个站点。在地中海西北部盆地，根状菌的丰度达到61.1细胞mgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba0-500 m水深，以小细胞为主(5.0 ~ 61.1 cells m)gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)而不是更大的(最多3.4个细胞mgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)．这些丰度与以往研究中所报告的生物的大小分布一致，在海洋上层水体中，小型的根菌通常比大型的根菌多(gydF4y2BaBoltovskoy等，1993gydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)．然而，在这里观察到的丰度是在全球范围内对部署在热带和亚热带水域(40°N/S) 0-200米水层的净样品的微观观察所估计的较低范围内，这表明小根孢菌的细胞丰度在79到892个细胞m之间gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba对于多胱氨酸放射虫和从5到20个细胞mgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba对于较大的黑斑鱼(gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)．本研究中观察到的低细胞密度可能是由于丰度值集成到500 m而不是200 m。此外，用于获得丰度值的不同技术(显微镜和FlowCAM)以及根菌群落的季节性模式。对地中海北海岸浮游生物时间序列的分析显示，根状菌(包括非硅化菌)的生物量在8月份最高，其余时间则相当低(gydF4y2BaRomagnan等，2015gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细胞密度低也可以用与使用成像仪器相关的注意事项来解释。尽管三种仪器的联合使用覆盖了广泛的尺寸范围，但我们观察到FlowCAM和Zooscan之间的尺寸差距。从176 μ m到365 μ m没有观察到样品(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)，这对应于我们可以找到许多多胱氨酸和黄藻类标本的大小纲(例如属)gydF4y2BaChallengeriagydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)．它们在结果中的缺失可以通过在分析前处理FlowCAM样品来解释，因为这些样品被筛到200 μ m的网格尺寸上，以防止仪器堵塞。为了避免对较大细胞的低估，可以将样品分成不同大小的组分，并使用较小或较大的流式细胞进行分析。此外，许多硅质Rhizaria标本的尺寸小于64µm，这是使用的最小浮游生物网格(如小尺寸物种、幼形态)，导致对硅质Rhizaria总丰度的低估。最后，经典的定语用法(如gydF4y2Ba．gydF4y2Ba如Lugol的碘或甲醛)会影响生物体，导致细胞数量可能被低估(gydF4y2BaChoi和Stoecker, 1989年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba比尔斯和斯图尔特，1970年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

对于zorscan (200-1000 μ m)，其工作尺寸范围从240 μ m开始。这种仪器可以限制枚举体型接近检测极限的小个体。虽然本研究报告的所有观测结果都在可获得可靠定量结果的范围内，但并不是所有的操作尺寸范围都能有效地获得定量结果。Zooscan捕获的是Aulacanthidae家族中最小的个体，因此有必要避免不同仪器之间的间隔更大(例如，在FlowCAM和UVP之间)。gydF4y2Ba

UVP具有测定的优点gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba在不破坏水体的情况下，水体中有机物的丰度以及它们的大小分布。然而，尽管该仪器设计用于研究大颗粒(>100 μ m)，但当样品尺寸低于700 μ m时，不可能可靠地识别根孢菌群。此外，最大的生物是最不丰富的，具有少数代表的类群很可能被忽视。gydF4y2Ba

4.2.影像与元条形码结果的比较gydF4y2Ba

分子方法可以深入了解生物的相对丰度和多样性，但结果不是定量的。分子数据可以尝试与定量成像技术进行比较。在本研究中，无论是在相对丰度还是在分类多样性方面，成像和元条形码比较的结果都不匹配。然而，当我们分析利用成像技术获得的生物体积时，结果具有可比性，更接近元条形码数据。gydF4y2Ba

分子分析结果表明，不同站点和大小组分的样品中均有硅质根状菌的存在，且最大个体的相对丰度高于通过成像方法获得的数据。众所周知，原生生物的基因拷贝不同，rDNA拷贝的大小和数量之间存在相关性(gydF4y2BaZhu等，2005gydF4y2Ba；gydF4y2BaGodhe等人，2008gydF4y2Ba，gydF4y2BaBiard等，2017gydF4y2Ba)，这可能会对它们在生态系统中的代表性产生偏见，导致与形态学细胞计数相比，元条形码数据中大型标本的代表性过高。如果我们检查生物体积的结果，它们支持这样的假设:较大的个体通常具有更高的基因组大小和更多的基因拷贝，与生物量比数量丰度更成正比(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba，细胞数)。在目前的研究中，较大的生物，尽管在水体中数量较少，但由于它们的体积大，可能对总生物量有重要影响。gydF4y2Ba

另一方面，在多样性方面，影像技术丰富的优势类群Nassellaria很少出现在元条形码数据中。纳塞拉龙骨骼强壮(gydF4y2Ba高桥等人，1983年gydF4y2Ba)和细胞破裂可能影响DNA的提取和扩增(gydF4y2Ba不是等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMendez-Sandin 2019gydF4y2Ba)．此外，元条形码分析依赖于参考数据库。由于从环境中获得的序列将与最近的相关序列进行比较，数据库中尚未包含的分类群可能会导致低估元条形码编码数据中发现的相对丰度。gydF4y2Ba

虽然每个细胞的rDNA拷贝数与细胞长度之间的相关性已在真核海洋Collodaria (gydF4y2BaBiard等，2017gydF4y2Ba)、用成像方法和分子工具测量的相对丰度和多样性的比较(gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba)是复杂的，必须谨慎制作。在本研究中，我们排除了Collodaria标本，因为它们可能包括由数万到数千个细胞组成的菌落，数量难以用想象方法确定，因此无法进行生物成因二氧化硅估计。此外，Collodaria可以是裸体的(例如，gydF4y2BaCollozoumgydF4y2Ba或长有硅质刺(例如，gydF4y2BaSphaerozoumgydF4y2BaSp .)，不能总是用成像方法确认的特征。gydF4y2Ba

成像和元条形码方法有很大的潜力，并允许快速分析和处理样本。然而，所有这些浮游生物计数方法在估计群落的实际组成和丰度时都有不确定性，要彻底解释结果，就需要评估每种方法的极限。gydF4y2Ba

为了在成像和分子方法之间提供可靠的比较，采样协议必须是同质的(gydF4y2Ba如gydF4y2Ba，样品大小相同，用两种方法分析相同的水样)。单细胞测序可能有助于避免分类组之间的不匹配，因为它将丰富数据库。gydF4y2Ba

4.3.利用成像数据评估根状菌对地中海西北部bSi种群的相对贡献gydF4y2Ba

根菌是全球海洋中产生生物硅的重要贡献者(gydF4y2Ba高桥等人，1983年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBiard等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)．它们的大小范围很广，占据各种生态系统，因此很难从综合的角度看待它们对生物地球化学循环的具体贡献(gydF4y2BaSuzuki and Not, 2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaBiard和Ohman, 2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

地中海西北部盆地的特点是营养贫乏。在秋季(9月至11月初)，地表水养分枯竭，浮游植物一般以非硅质生物为主(gydF4y2BaLeblanc等人，2003年gydF4y2Ba)．gydF4y2BaLeblanc等人(2003)gydF4y2Ba报告的生物成因二氧化硅集成储量为3.1 ~ 21.5 mml - si mgydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}在位于地中海盆地西北部的一个站点的前150米水柱中，硅藻生物成因二氧化硅的最低值对应于秋天。一年四季在150米以下的硅藻生物硅值接近于0 (gydF4y2BaLeblanc等人，2003年gydF4y2Ba)．在MOOSE-GE 17巡航过程中，0-DCM层上的生物成因二氧化硅值在1.7 - 6.8 mml - si m之间gydF4y2Ba^{－2gydF4y2Ba}，它们与由gydF4y2BaLeblanc等人(2003)gydF4y2Ba在一年的类似时期。gydF4y2Ba

利用从成像工具获得的数据以及先前建立的异速生长关系(gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)，我们首次尝试确定硅质根状菌在一个广泛的大小光谱上对地中海生物源性二氧化硅存量的贡献。假设DCM下浮游植物生物成因二氧化硅为空(gydF4y2BaLeblanc等人，2003年gydF4y2Ba)，将水柱前500 m处的根孢菌生物成因二氧化硅值与水柱生物成因二氧化硅值进行比较。因此，我们发现根状硅质占水体中生物源性二氧化硅总量的6%(2.6±1.6)。gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba

根状菌对生物硅生物量的贡献可以是高度可变的。例如，在世界海洋的生产区域，根菌属较少，硅藻浓度高得多，这些原生生物对地表水生物成因二氧化硅生物量的影响就小得多，例如在南极洲罗斯海，根菌属只占全部生物成因二氧化硅的0.1% (gydF4y2BaLlopis Monferrer等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在本研究中，在前500米用浮游生物网收集最小的浮游生物。这种取样方法对小根菌的垂直分布没有详细的信息，很难知道它们是否主要在浮游植物生长的透光层中繁殖。我们研究了Niskin瓶的元条形码(gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)，以小型浮游植物群落为代表。我们观察到，在大多数站点中，根状菌相对于硅藻更丰富，这很可能是由于较大的生物具有更多的基因拷贝。对于较大的个体，成像gydF4y2Ba现场gydF4y2Ba在UVP中，最高丰度出现在约100米的深度(gydF4y2Ba补充图S3gydF4y2Ba)，低于该地区发现的硅藻生物成因二氧化硅的最大值(gydF4y2BaLeblanc等人，2003年gydF4y2Ba)．有证据表明，某些根孢菌群的垂直分布与水文特征有关，例如DCM (gydF4y2BaKling和Boltovskoy, 1995gydF4y2Ba；gydF4y2Ba丹尼特2002gydF4y2Ba)．需要更广泛的深度覆盖，包括每个分类类群的深度偏好，以详细研究这些特征对根菌群落的影响。gydF4y2Ba

不同的根属植物有不同的深度偏好(gydF4y2BaBoltovskoy等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaBiard和Ohman, 2020年gydF4y2Ba)．根据这些信息，生活在较深层的根孢菌在我们的估计中被忽略了。这种生物的不均匀分布将影响根状菌对全球生物成因二氧化硅储存量的贡献，特别是在透光层以下的水域，那里的根状菌可能非常丰富，有助于向深海的生物成因二氧化硅通量(gydF4y2Ba中村等，2013gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

根据gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人(2020年)gydF4y2Ba在热带和亚热带水域(N/S 0-40°)，根孢菌对0-200米水层硅化物常存存量的贡献与它们对200-1000米水层估计的贡献是相同的数量级。深层生物对二氧化硅循环的影响在这里没有被考虑，因为我们只分析了在0-500 m层发现的根菌，但它可以显著增加它们对总生物量的贡献。gydF4y2Ba

我们的研究结果表明，研究根孢菌的整个尺寸谱和垂直分布对充分了解这些原生物在硅生物地球化学循环中的作用是必要的。尽管由于样品操作(在FLowCAM和Zooscan协议中)可能低估了细胞浓度，但在一些站点，小样本占生物成因二氧化硅存储量的50%，这表明小尺寸类不可忽视。生物成因二氧化硅含量肯定受各站点的分类类群及其细胞大小的影响。以多胱氨酸为代表的小根孢菌(鼻孢菌属和Spumellaria)具有坚实的骨架，一般密度更大(可达530 μ g-Si mm)gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba)比大型黑斑鱼(10µg-Si mmgydF4y2Ba^3gydF4y2Ba) (gydF4y2Ba洛皮斯·蒙费雷尔等人，2020年gydF4y2Ba)，它们的骨架是多孔的(gydF4y2Ba中村等，2018gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

尽管每种方法都存在不确定性，但结果表明，无论大小根状菌都对该寡营养区生物源性二氧化硅生物量具有不可忽视的贡献。为了更好地了解这些生物的全球意义，并能够将它们包括在生物地球化学模型中，必须考虑硅质根生物的全部范围。gydF4y2Ba

4.4.展望更好地表征整个根孢菌群gydF4y2Ba

硅化菌的大小差异很大，同时研究它们是一项具有挑战性的任务。此外，收集足够多的个体以公平地反映其丰富程度和多样性是一项艰巨的任务。gydF4y2BaCortese 2004gydF4y2Ba)．为了同时对大型和小型生物体进行取样，可以使用邦戈网，正如本研究的情况一样。亦可透过滤水(gydF4y2BaBoltovskoy等，1993gydF4y2Ba)．例如，可以通过成像和/或分子工具分析尼斯金瓶的全部内容。通过Niskin瓶取样，收集到的小根孢菌可以与给定的深度和理化参数相关联，为每个标本的生态学提供有价值的信息。较大的浮游生物可以用传统的闭合网(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba，多项)考虑到不同的水层。另外，瓶网也可以用来替代传统的浮游生物网。瓶网是专门为2010年马拉斯皮纳环球航海大赛(gydF4y2BaAgustí等，2020gydF4y2Ba)，以改善浮游生物及微粒的收集情况(gydF4y2Ba勒布朗等人，2021年gydF4y2Ba)．该仪器被设计安装在标准莲座上，由外部PVC和不锈钢框架组成，内部有20 μ m的网目尺寸。该装置的主要优点之一是它可以对划定的水层进行取样，而且它不像浮游生物网那样聚集那么多的生物，从而避免对生物的损害。gydF4y2Ba

在研究大型根孢菌时，UVP是最合适的工具。这gydF4y2Ba现场gydF4y2Ba该设备与CTD连接，无需额外的时间部署，环境参数可以与成像的生物相关联。有了这些信息，它们的生态偏好和垂直生态位就可以被表征(gydF4y2BaBiard和Ohman, 2020年gydF4y2Ba)．它的深度范围是6000米，因此，它可以研究根菌的垂直分布，直到其他工具无法到达的区域。生成的数据集非常庞大，手动对所有图像进行分类是一项复杂而耗时的任务。gydF4y2Ba

分子工具在确定多样性方面是形态学观察之外一个很有前途的选择，但仍有许多概念有待了解，如细胞结构和细胞大小、复制数和基因组内变异(gydF4y2BaSandin等人，2021年gydF4y2Ba)．分子方法的另一个局限性是，即使在细胞死亡的情况下(环境DNA)， DNA也能够保持可用。这使得人们很难知道在某一深度发现的生物是否栖息在同一深度，或者仅仅是从地表水沉积下来的生物，也就不可能知道DNA是来自代谢活跃的细胞、死亡的细胞还是细胞的残体(gydF4y2Ba布里斯宾等人，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

成像和分子工具的结合可以更好地理解根孢菌的生物学和生态学，因为它提供了广泛的大小光谱覆盖。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。有关储存库的名称及登记编号载列如下:gydF4y2Bahttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.19362374.v1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

NL, FL, MP, AE, LG, AL, PT, FN参与了手稿的概念化。NL、TB和FL研究定量数据。MS提供并处理元条码数据。所有作者都对稿件进行了审阅并提供了意见。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了法国国家项目LEFE (Les arompes Fluides et l ' environment)和ANR RadiCal (ANR-18- ce01 -0011)的ROSI项目的支持。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者感谢MOOSE观测国家网络(由CNRS‐INSU和研究基础设施ILICO资助)，该网络支持西北地中海每年的船舶水文剖面(MOOSE‐GE)。我们也感谢亚特兰大号RV的科学团队和船员，以及担任MOOSE GE-2017任务巡航队长的皮埃尔·泰斯特(CNRS, LOCEAN)。我们感谢EMBRC平台PIQv提供的图像分析和CCPv提供的样本访问。这项工作得到了EMBRC-France的支持，其法国国家基金由ANR在参考ANR-10- inbs -02的“未来投资”项目中管理。这项工作得到了法国国家项目LEFE (Les arompes Fluides et l ' environment)和ANR RadiCal (ANR-18- ce01 -0011)的ROSI项目的支持。我们非常感谢C. Dambrine和H. Whitby的意见和帮助。我们也感谢该手稿的审稿人所提出的宝贵意见。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中表达的所有主张仅代表作者的观点，并不代表其附属组织的观点，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmars.2022.895995/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba