简介
红树林是热带和亚热带海岸的特殊护岸者,在防风林、促进淤积和净化环境方面发挥着重要作用(
阿特伍德和哈姆米尔,2018年 ).红树林生态系统也以其高生产力和碳密度而闻名,尽管红树林的碳储量在不同区域和群落之间可能存在显著差异(
Komiyama et al., 2008 ;
Alongi, 2014 b ;
王2019年 ;
Wang和Gu, 2021 ).先前的一项研究报告,红树林生态系统中约75%的有机碳被封存在沉积物中(
Alongi, 2014 ).进一步探索可能在红树林沉积物碳储存中起关键作用的潜在因素将是有趣的。
胞外聚合物质(EPS)是一种微生物的分泌物,广泛存在于水生环境中(
Zhang等,2015b ).蛋白质和多糖是EPS的两个主要成分(
Frolund等人,1995年 ).EPS作为微生物周围的缓冲界面,为微生物提供额外的碳和营养池(
Urrea等人,2017 ;
田等,2020 ).eps诱导的生物膜进一步促进微生物聚集物的形成(
Wingender等人,1999年 ).大量研究表明,EPS可以保护细胞和微生物免受外来逆境,如重金属(
Hou等人,2013 ;
Kang等,2014 )和持久性有机污染物(
Kang和Park, 2010 ;
杨等,2020年 ).此外,EPS因其黏性,可促进大分子有机物与细胞外基质的吸附(
Li和Ganczarczyk, 1990 ).一项活性污泥处理污水的研究证实,EPS也会聚集水中的悬浮固体,从而促进絮凝沉降(
Wilén等,2000 ).
朱与燕(2022) 进一步表明,EPS对碳储量的贡献可能远远超过微生物生物量碳(MBC)本身。
潮间带红树林的分布与地貌条件密切相关(
Fromard等人,1998年 ;
Ellison等人,2000年 ;
乔杜里和麦提,2016年 ).在中国南方,红树林群落通常随着潮间带环境因子的变化而呈现出有趣的有序分区。一般来说,先锋红树林物种(例如,
矮小 )通常生长在潮汐梯度较低的临海地带,那里的沉积物孔隙水含盐量较高,但营养成分较低,而根蕨科红树林则常生长在中部及/或向陆地的地区,水浸压力较低(
Cheng等人,2020 ).此外,在红树林分带过程中,沿连续潮汐梯度的不同红树林群落,沉积物的碳储量和固碳潜力可能存在显著差异(
冯等,2019 ;
Chen等,2021a ).此外,EPS的含量和生产者(例如,细菌、真菌和底栖硅藻)也可能随着地上红树林的变化而显著变化(
肖和郑,2016 ;
王等,2019b ;
Mai等,2022 ).不幸的是,微生物EPS的动态及其对红树林生态系统碳储量和固碳的潜在功能仍然知之甚少。
因此,选择一个三区分阶段的红树林自然保护区(1)研究不同红树林分区梯度下EPS的微生物群落和分布情况;(2)探讨EPS对红树林生态系统碳储量的潜在影响;(3)研究红树林分区、微生物结构、EPS和碳储量之间的关系。据我们所知,这是第一个从微生物EPS角度探讨红树林碳储量的研究,为了解不同红树林群落中红树林碳储量的变化提供了新的视角。
材料与方法
沉积物取样
位于中国广东省湛江市高桥的红树林自然保护区是中国最大的红树林自然保护区之一,因此入选。该地区属亚热带季风气候,年平均气温23.4℃,年平均降水量1816毫米(主要在4 - 9月)。红树林物种的定殖部分受地形和潮汐的控制。
2021年8月,在高桥红树林保护区采集了地表沉积物样本(0 ~ 5 cm)。由向海至向陆共有四个采样点(
图1
),代表裸露泥滩的位置,
矮小 (AM,向海先锋红树林),
Aegiceras corniculatum (AC,中等过渡性红树),和根霍科混交林(MF,向陆地生长的根霍科混交林,主要由
大片stylosa 而且
工业gymnorrhiza ).在每个采样点采集5个地表沉积物样本,间隔不小于50 m。因此,获得了20包新鲜沉积物样品。在现场采样后的两天后,样品被转移(用干冰储存)到实验室。
图1
采样地点,中国广东高桥红树林自然保护区。
沉积物理化参数分析
在测量总有机碳(TOC)时,将约0.05克风干沉淀物置于0.5 mL 2 M HCl中以去除碳酸盐(
Cheng等人,2020 ),然后在分析器反应器中以500 mL/min的气流进行干燥。然后使用配备固体样品模块(SSM-5000A,岛津,日本)的元素分析仪(TOC- v, CPH,岛津,日本)测定TOC含量。
对于其他物理化学参数,使用pH计(S210-KCN,梅特勒托莱多,德国)测定1:2.5土水比混浊液体的pH值,使用盐度分析仪(PNT3000, STEPS,纽伦堡,德国)(
王等,2019a ).总氮(TN)和总磷(TP)分别按照标准方法(HJ 717-2014和HJ 632-2011)采用改良凯氏定氮法和钼酸还原法进行分析。
EPS分析与测定
EPS是使用阳离子交换树脂提取的,正如之前的研究人员所描述的那样,进行了微小的修改(
高桥等人,2009年 ;
Mai等,2022 ).简单地说,在含有30g新鲜沉积物的试管中加入人工海水(盐度为30‰),在4°C的黑暗条件下在搅拌器中混合1小时。收集上清液,3500rpm, 4°C离心10min,得到胶体EPS。然后,将20 mL人工海水和2 g活化阳离子交换Dowex 50 WX8树脂(氢形态,200-400目,Sigma-Aldrich, MO, USA)加入剩余沉淀物中,在4°C下在暗环境下混合1小时,然后在4°C下以3500转/分离心10分钟,得到结合EPS。用透析袋(3.5 kD, 4℃孵育24小时)纯化两种EPS亚组分的上清液。将纯化后的EPS样品冷冻干燥。
将冻干后的EPS粉末置于衰减全反射仪(ATR, Miracle, Pike, America)中进行细致的研磨。采用傅立叶红外光谱(FTIR, IR Affinity-1, Shimadzu, Japan)在25℃下进行分析,记录两种EPS亚组分的官能团组成。共扫描25次,分辨率为4厘米-1 且扫描范围为500-4000厘米-1 进行了(
杨等,2018 ).以大气为空白,对每个测试样品减去空气的透过率。因此,倒峰出现在2400 cm附近-1 由于CO2 在空中。
为了测量细胞外蛋白(EPS- pt)和多糖(EPS- psc),分别将冷冻干燥的胶体和结合的EPS粉末重新溶解在10 mL去离子水中。以牛血清白蛋白为标准,使用改良双辛酸蛋白检测试剂盒(Sangon Biotech, Shanghai, China)测定蛋白浓度(
史密斯等人,1985年 ).根据报道的数据,EPS-PT的碳比估计平均为40%
Bura等人(1998) .以葡萄糖为标准,苯酚-硫酸法测定多糖含量(
杜布瓦等人,1956年 ).假设多糖全部转化为糠醛(C5 H4 O2 ),因此EPS-PSC的碳比估计为62.5% (
杜布瓦等人,1956年 ).采用元素分析仪(TOC-V, CPH, Shimadzu, Japan),配置自动进样器,测量EPS溶液中溶解的有机碳(
蒋等,2006 ).
16S illumina测序
用土壤DNA提取试剂盒(Omega,美国)提取1克沉积物中的总DNA。用338F (5 ' - actcctacgggaggcagcagg -3 ')和806R (5 ' -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 ')引物扩增16S rRNA基因。聚合酶链式反应(PCR)在50 μL反应体系中进行。PCR程序为:98℃预变性2 min;95°C变性1.5 min, 55°C退火30 s, 72°C拉伸45 s,循环30次;72℃终伸10min, 4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化并回收
通过 DNA凝胶提取试剂盒(Omega, D2500-01,美国)。根据标准方案,使用Illumina HiSeq平台(Illumina, San Diego, CA,美国)进行配对端测序。所有序列都提交到国家生物技术信息中心(NCBI)数据库。
原始序列用Trimmomatic (
Bolger等人,2014 ),并使用FLASH(版本1.2.11)合并(
Magoč and Salzberg, 2011 ).通过Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (version 1.9.1) (
Caporaso et al., 2010 ),并与参考数据库(Gold数据库,
http://drive5.com/uchime/uchime_download.html ) (
哈斯等人,2011 )使用UCHIME算法来获取有效标签(
埃德加等,2011年 ).使用usparse软件(usparse v7.0.1001)进行序列分析,97%的相似性被认为是相同的OTUs。对于每个具有代表性的序列,使用Silva参考数据库(
Quast等人,2013年 ).
数据分析
对数据进行正态性检验(Kolmogorov-Smirnov检验,SPSS 22.0版)和单因素方差分析(差异不显著)
事后 进行LSD检验,以评价显著性差异。采用Kaiser-Meyer-Olkin (KMO)检验分析各变量间的相关系数,再进行主成分分析(PCA)。利用Origin软件进行PCA和Pearson相关矩阵分析,评价EPS-PT与EPS-PSC、EPS-C与沉积物理化性质(TOC、TN、TP、pH、盐度)的关系。
细菌原始读数上传到NCBI (PRJNA839550)。数据分析基于Majorbio云平台(
www.majorbio.com ).采用相似度分析(ANOSIM)确定各样本间OTUs差异的统计学意义。采用主坐标分析(PCoA)方法研究各站点微生物群落的相关性。采用Kruskal Wallis H检验分析了四组沉积物样品的物种显著性差异,并对各组进行了比较(
Wei等,2014 ).利用双矩阵相关热图对沉积物理化性质与细菌群落结构进行了相关性分析(使用微生物类群的相对丰度)。
结果
土壤TOC等理化参数
根据
表1
, TOC浓度范围为3.22 ~ 39.57 g/kg, MF的TOC浓度最高,其次为AC、AM和BM。TN和TP也有相似的分布规律,MF最高,BM最低。相比之下,BM盐度最高,MF盐度最低。pH值在6.40 ~ 7.20之间,BM的pH值最高,其次是AC、MF和AM。
表1
不同采样点沉积物物理化学性质的变化。Mean±SE,小写字母表示差异显著(
p 四个站点间差异均< 0.05)。
采样地点
pH值
盐度(g / L)
TN(克/公斤)
TP(克/公斤)
TOC(克/公斤)
BM
7.20±0.05一个
0.91±0.08一个
0.50±0.15d
0.19±0.07c
3.22±0.30c
我
6.40±0.06c
0.91±0.06一个
1.64±0.9b
0.61±0.04b
21.16±2.29b
交流
7.10±0.04一个
0.68±0.02b
1.30±0.13c
0.63±0.07b
19.96±1.99b
曼氏金融
6.80±0.04b
0.63±0.03b
2.34±0.03一个
1.00±0.04一个
39.57±1.32一个
EPS亚组分和组分
EPS-PSC总浓度为18.04 ~ 158.64 mg/kg。如
表2
, MF的EPS-PSC值最大,AC、AM、BM次之。与EPS-PSC一致,在胶体和结合EPS-PSC中也观察到类似的分布模式。
表2
不同采样点EPS的变化。Mean±SE,小写字母表示差异显著(
p 四个站点间差异均< 0.05)。
采样地点
胶体(毫克/公斤)
绑定(毫克/公斤)
蛋白质
多糖
蛋白质
多糖
BM
20.20±6.59b
7.51±0.52c
46.77±1.9c
10.53±0.72c
我
61.12±5.81一个
23.17±4.98公元前
91.96±19.06b
23.56±2.96公元前
交流
21.21±6.72b
41.91±10.26b
144.53±44.19一个
28.26±6.15b
曼氏金融
27.11±5.21b
105.57±17.19一个
144.20±14.15一个
53.07±10.42一个
总EPS-PT浓度为66.97 ~ 171.31 mg/kg (
表2
).同样,红树林沉积物中的结合EPS-PT浓度也高于裸露的泥滩。但除AM外,红树林和泥滩沉积物中EPS-PT的含量基本相当。
EPS-C
总体来看,红树林沉积物的EPS-C值为0.33 ~ 0.73 g/kg,其中红树林沉积物的EPS-C值远高于泥滩,MF沉积物的EPS-C值最高。裸泥滩的EPS-C/TOC比值(10.69%)高于红树林沉积物(1.84 ~ 2.98%)(
图2
).
图2
4个样地沉积物中EPS-C含量及EPS-C/TOC比值的变化柱状图(与左y轴相关)和折线图(与右y轴相关)分别表示EPS-C和EPS-C/TOC比值的值。均值±SE,不同字母表示差异显著(
p < 0.05)。
胶体和结合EPS-C的详细信息见
图S1
.胶态和结合态EPS-C含量均显著增加(
p < 0.05),红树林呈向海向陆带状分布。MF的EPS-C比值最高,其次为AC、AM和BM。EPS- c组分中,蛋白质和多糖分别占EPS- c的8.10~11.77%和3.41~13.78%,约等于二者在EPS总量中的比例(
表S1
).
EPS的FTIR光谱
观察到类似的EPS红外波段,无论胶体或结合子部分。结果来自
图3
显示5个主导峰段:3520-3200厘米-1 I区(与氧羟基相关的O-H拉伸),1800-1600厘米-1 II区(C=C, C=O拉伸,C=N, N- h蛋白质振动),1600-1400厘米-1 III区(o -烷基、甲基和亚甲基的延伸,可归因于蛋白质)1200-1000厘米-1 IV区(P=O, P-O, C-O-C, C-O-P环振动部分归因于多糖)和650-400 cm-1 V区(无官能团区,C-H的拉伸)。从四个采样点EPS的FTIR透射强度的差异来看,MF在所有红外波段的透射强度均最高,其次是AC、AM和BM。
图3
束缚EPS的FTIR光谱
(一) 和胶体EPS
(B) 从四个采样点分离出来。
微生物群落组成
ANOSIM结果显示,BM、AM、AC和MF之间的微生物组存在显著差异(ANOSIM R = 0.7527,
p = 0.001)。的结果
图4一
说明四个采样点在类水平上微生物组成的差异。与BM相比,红树林沉积物中Alphaproteobacteria、Actinobacteria和Thermoleophilia的丰度较高,尤其是与MF相关的沉积物。
图4
多数细菌类群在类水平上存在显著差异分析
(一) 以及订单级别
(B) 从四个采样点。星号、*的含义
p < 0.05;**
p < 0.01;***
p < 0.001。
图4 b
列出微生物组成在顺序水平上的差异。其中,MF沉积物中根瘤菌(Rhizobiales)和Solirubrobacterales含量最高。同样,在MF沉积物中,Corynebacteriales和Gaiellales的丰度最高,而在BM沉积物中丰度最低。每对细菌之间更详细的比较在
S2的数据
,
S3
.
微生物组成、EPS、EPS- c、TOC与其他土壤理化性质的关系
根据PCoA结果(
图S4
), AM和AC的微生物群落相似,而BM和MF的微生物群落差异较大。如
图5
, TOC与EPS-C呈显著正相关,相关系数为0.92。TOC、EPS-C与EPS-PT、EPS-PSC均呈正相关。TN、TP与TOC、EPS-C呈显著正相关。
图5
沉积物理化性质的主成分分析和Pearson相关分析(KMO值= 0.690;N = 20)。
(一) :不同颜色的三角形散点代表四个采样点。
(B) :红色表示正相关,蓝色表示负相关。
如
图6
在类水平上,Alphaproteobacteria、Actinobacteria、Vicinamibacteria和Thermoleophilia不仅与TOC、TN和TP呈正相关,而且与EPS(如EPS- psc和EPS- pt)和EPS结合碳(EPS- c)呈正相关。中给出了更详细的顺序级相关分析
图6 b
.其中,根瘤菌、微毛菌、棒状菌和盖氏菌与EPS组分和EPS- c呈正相关。这些菌序与沉积物养分参数(TN、TP、TOC)呈显著正相关。EPS亚组分与细菌群落在类和/或目水平上的相关性分析的更多信息显示在
图S5
.
图6
沉积物参数与细菌群落关系的双基质热图分析。
(一) :细菌群落在类水平上的相关性分析;
(B) :细菌群落在阶级上的相关性分析。红色表示正相关,蓝色表示负相关。星号、*的含义
p < 0.05;**
p < 0.01;***
p < 0.001。
讨论
红树林带沿连续潮汐梯度沉积物中碳储量的变化
本研究中,高桥红树林保护区TOC含量为19.96 ~ 39.57 g/kg,高于粤东北阔叶林(16.75 ~ 22.14 g/kg) (
林和高,2009 ).TOC、TN、TP含量也显著增加(
p < 0.05)随红树林分区期间潮汐梯度升高(
表1
).与先前的研究结果一致(
王等,2013 ),目前的数据还发现,向陆地生长的红树林沉积物具有较高的土壤有机碳浓度。
由于潮汐梯度、植物多样性和沉积速率的差异,不同红树林群落沉积物中的有机碳浓度可能存在显著差异(
格里森和尤尔,2002年 ;
Ceron等人,2011年 ).在这项研究中,向海的先驱
矮小 和过渡红树林(
Aegiceras corniculatum )的植物多样性非常低(几乎是纯森林)。以往的研究显示,红树林的多样性与沉积物碳储量(
麦肯齐等人,2016 ;
拉蒙特等人,2019年 ).根horhoraceae植物分布在中国南部沿海中部和/或内陆地区,通常是最具生产力和多样性的红树林群落(
Bai等人,2021 ).在本研究中,向陆性MF土壤有机碳的增加也可能部分归因于其较高的植物多样性。因此,在红树林恢复中应用多物种种植策略可以同时提高生物多样性和蓝碳储量(
Alongi 2011 ).
微生物群落结构和EPS含量随红树林分区的变化
数据载于
表2
结果表明,随着红树林向海向陆的分区,EPS含量显著增加。这种增加可能部分归因于沉积物养分浓度(如TOC、TN和TP)的改善(
表1
)和一些特定的微生物类群(
图4
,
S2
,
S3
)在潮间带红树林分区期间(
图5
).在本研究中,Alphaproteobacteria和Actinobacteria的丰度最高见于MF (
图4一
).
这两类细菌与EPS (
图6
).据报道,Alphaproteobacteria和Actinobacteria可以分泌EPS来改善根鞘微环境,提高保水能力(
Marasco等人,2022年 ).先前的研究也认为Alphaproteobacteria是膜生物反应器中主要产生eps的细菌(
Neoh等人,2017 ).此外,这两个细菌类群还参与了凋落物、根际代谢物和顽固有机碳的降解(
Zhang等,2020 ).随着潮汐梯度的升高,TOC的增加也可能促进这两种细菌类群的生长。
序级相关分析(
图6 b
)提示从向海向陆增加根瘤菌、棒状菌和盖ellales丰度可能促进EPS分泌。根瘤菌在相互作用中是有益的伙伴(
Liu等,2022 ).在富碳底物中的根瘤菌,由于其丰富的胞外羧化酶和氧化酶,可加速氨基酸和酚的分解(
Mai等人,2021年 ;
Yu等人,2022 ).此外,根瘤菌是膜生物反应器中胞外聚合物的重要生产者之一。根瘤菌分泌的EPS对其稳定和繁殖至关重要(
Santaella等人,2008年 ;
Cydzik-Kwiatkowska 2015 ).先前的研究人员还声称Solirubrobacterales促进土壤团聚体的形成,与根瘤菌协同作用(
马科斯等人,2019年 ).
Guo et al. (2020) 声称棒状杆菌在碳代谢和纤维素生物降解中的重要性。
Chen et al. (2021b) 另有报道称,Gaiellales可以通过EPS的分泌加速土壤团聚体的形成过程。结果表明,其他一些细菌(如Steroidobacterales, flavobacterales, Syntrophobacterales等)的丰度与沉积物参数(如盐水和pH值)和EPS (
图6
).在红树林沉积物中,这些细菌类群的生长可能受到非生物因素的限制(例如,高盐度、厌氧和酸性条件)(
吴等,2016 ),导致对EPS含量的贡献较低。此外,根据硅藻为主的潮间带泥滩(Marennes-Oléron, France) EPS的差异分析,冬季EPS含量高于夏季(
Pierre et al., 2014 ).
总之,EPS的动态是由细菌群落共同调节的。然而,富集的微生物类群既可以是产生EPS的类群,也可以受益于其他生物释放的其他有机底物。微生物,特别是从红树林沉积物中分离出来的细菌,分泌EPS的机制仍然知之甚少。筛选产生eps的细菌类群有待进一步研究。此外,还应对EPS与其他微生物(如藻类和真菌)之间的关系进行类似研究。
红树林生态系统EPS与碳储存和运输的联系
本数据显示,EPS和EPS- c均与TOC呈正相关(
图5
),与球囊蛋白相关的土壤蛋白质与土壤有机碳也有相似的正相关关系(
Zhang et al., 2015a ;
王等,2018 ).在本研究中,大多数EPS- c可能来自EPS本身,因为在EPS提取和纯化过程中,除了一些可溶性有机胶体外,大多数附着在EPS上的有机颗粒都被去除了(
杨等,2020年 ).目前的数据进一步表明红树林分区与EPS-C增加之间存在联系。如
图2
, EPS-C对TOC的贡献为1.84~10.69%,远高于热带(亚热带)森林的MBC(1.5%)和红树林的MBC (0.45%) (
徐等,2013 ;
王等,2018 ).
在本研究中,胶态EPS-C和结合态EPS-C均随红树林由向海向陆地的分区而显著增加(
图S1
).可溶性胶体EPS很容易被细菌和藻类降解和利用(
McKew等人,2013 ),而结合EPS一般被认为是顽固性碳,可能会在沉积物中长期滞留和成岩作用(
Evrard et al., 2008 ;
罗等人,2020 ).EPS增加(特别是结合EPS- c比值增加,
图印地
),从而有助于稳定的有机碳埋藏在向陆地的MF沉积物中。对于EPS- c组分,目前数据显示蛋白质和多糖仅占EPS- c的一部分,约等于这两种组分在EPS总量中的比例(
表S1
).其他EPS组分(如核酸、脂质和腐殖质)对EPS- c的贡献、不同EPS亚组分和组分的周转率以及它们对沉积物碳库长期储存的潜在贡献值得进一步研究(
Flemming和Wingender, 2001 ).
如
图3
,从红树林沉积物中分离出的EPS含有多个官能团(如O-H、N-H、- coo -和P-O)。从单一细菌和/或活性污泥中分离的EPS也观察到类似的光谱特征和功能特征(
Guibaud等人,2005年 ;
Badireddy等人,2008 ).虽然EPS的光谱特征和功能特征相似,但这些官能团的光谱吸收峰均随红树林分带潮汐梯度的增加而增加,与EPS含量的增加相一致。增加的EPS和官能团可能通过粒子间桥接和生物吸附促进生物絮凝和沉淀,导致潮汐淹水过程中更多有机颗粒沉淀(
Gerbersdorf and Wieprecht, 2015 ;
徐等,2017 ).此外,EPS的增加也可能促进土壤团聚体的形成过程,从而在一定程度上保护土壤有机碳的矿化(
德根,1997 ;
Deka等人,2019年 ).此外,带电EPS官能团与矿物颗粒之间的相互吸引可能促进矿物相关有机碳的形成(
林等人,2016 ;
Liu等,2022 ).此外,我们之前的研究表明,红树林恢复有利于增加EPS,可以促进沉积物抗冲刷性(
Mai等,2022 ).因此,向陆MF沉积物中较高的EPS不仅有利于沉积物中TOC的保存,而且可以减少土壤TOC的侵蚀。更详细的EPS对红树林土壤固碳的作用机制值得进一步研究。
然而,有趣的是,裸泥滩沉积物的EPS-C/TOC比率较红树林沉积物高,而裸泥滩沉积物的EPS-C含量则较红树林沉积物低得多(
图2
).沉积物有机碳的来源主要是受红树林凋落物所青睐的原生碳(
熊等,2018 ).红树林沉积物中EPS-C/TOC比值较低,部分原因可能是由于地上红树林的凋落物导致植被碳输入增加(
冯等,2017 ).在裸露泥滩中,EPS-C贡献了近11%的沉积物有机碳。先前的研究推断,红树林溶解有机碳的大部分将输出到河口(高达65%)(
Romigh et al., 2006 ).频繁的潮汐洪水可进一步促进红树林沉积物与邻近泥滩之间的碳交换(
Bouillon等人(2007) .滩涂的碳储存和固存功能往往被忽视。
Phang et al. (2015) 据估计,新加坡赤爪哇潮间带泥滩的碳储量相当于当地红树林碳储量的29%。此外,泥滩中营养物质的积累可能有利于先锋红树林物种的入侵。未来还需要对红树林碳出口/进口进行进一步研究,如同位素示踪和生物标志物分析的应用。