热预处理在造礁珊瑚中通过bi -1介导的抗氧化反应缓解氧化损伤gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

健康的珊瑚礁养活了近三分之一的海洋物种，并为整个热带海洋提供庇护、苗圃生境和海岸保护(gydF4y2Ba诺尔顿等人，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2BaFisher等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaVercelloni等人，2018gydF4y2Ba)．这一生态系统的能量和结构基础是珊瑚-藻类共生关系，它被热应力破坏，并受到气候变化的严重威胁。气候导致的大规模白化已经影响了世界上大部分的珊瑚礁，预计其频率和强度将会增加，威胁到这些生态系统的长期持久性(gydF4y2Bavan Hooidonk等，2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba休斯等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaEakin等人，2019年gydF4y2Ba)．深入了解维持珊瑚-藻共生的细胞和分子机制，对现代的保育和管理至关重要(gydF4y2Bavan Oppen等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2Ba增加珊瑚礁复原力干预措施委员会等，2019年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

珊瑚在能量上依赖于它们细胞内的共生藻类gydF4y2BaSymbiodiniaceaegydF4y2Ba）gydF4y2Ba（gydF4y2BaLaJeunesse等人，2018gydF4y2Ba)，它们提供光合作用合成的糖，并从宿主那里接受庇护和无机分子的供应。在热胁迫下，共生体释放的活性氧增加，据信会引发分子级联，导致珊瑚白化，并最终导致珊瑚宿主生物死亡(gydF4y2Ba较小,1996gydF4y2Ba；gydF4y2Ba暗示特等人，2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaSaragosti等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaRoberty等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrueger等，2015agydF4y2Ba；gydF4y2Ba莱文等人，2016年gydF4y2Ba；gydF4y2BaGardner等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba奥克利和戴维，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba尼尔森等人，2018gydF4y2Ba）;然而，支持这一假设的确切证据仍然缺乏(gydF4y2BaSzabó等，2020gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在正常情况下，ROS会被宿主和共生体中的抗氧化系统清除，以减少对细胞膜、脂质、蛋白质和核酸的损伤(gydF4y2BaNesa和Hidaka, 2008年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba哈里维尔和古特里奇，2015年gydF4y2Ba)．在升高的温度下，ROS浓度升高，珊瑚全生物激活了一线酶促抗氧化剂，如过氧化氢酶或超氧化物歧化酶，并维持了一个减少的细胞内环境gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba谷胱甘肽氧化还原循环(gydF4y2BaKrueger等，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrueger等，2015agydF4y2Ba；gydF4y2BaRoberty等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaDiaz等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba莱文等人，2016年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBielmyer-Fraser等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaLopes等人，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba尼尔森等人，2018gydF4y2Ba)．这些系统在gydF4y2BaSymbiodiniaceaegydF4y2Ba，其中耐热性不同的属在抗氧化基因的表达上有所不同(gydF4y2BaKrueger等，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrueger等，2015agydF4y2Ba；gydF4y2Ba莱文等人，2016年gydF4y2Ba)和耐热藻类通常产生更多的抗氧化剂，能够更好地维持细胞内稳态。相反，宿主衍生的抗氧化剂在漂白和热弹性中的作用仍有争议。虽然开创性研究显示，在热应激下，成年珊瑚宿主组织和幼虫的抗氧化活性增强(gydF4y2BaLesser et al.， 1990gydF4y2Ba；gydF4y2BaYakovleva等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYakovleva等，2009gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗斯等人，2013年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrueger等，2015agydF4y2Ba；gydF4y2BaHillyer等，2017gydF4y2Ba)，但最近的实验未能支持这些发现(gydF4y2Ba尼尔森等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaLopes等人，2018年gydF4y2Ba)．然而，在全生物体内维持低ROS水平可能是维持珊瑚-藻共生动态的主要因素(gydF4y2Ba休斯等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSzabó等，2020gydF4y2Ba；gydF4y2BaAlderdice等人，2022年gydF4y2Ba)和激活DNA损伤反应途径是珊瑚受热胁迫的标志(gydF4y2Ba迪克森等，2020年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

代内可塑性对减轻珊瑚的压力至关重要(见gydF4y2Ba特鲁里街,2020gydF4y2Ba))。作为久坐的动物，它们只有有限的能力来避免紧张的环境条件，因此它们对周围动态变化的反应潜力对它们的生存至关重要。越来越多的知识表明了各种机制(基因表达或形态可塑性，即gydF4y2Ba肯克尔和马茨，2017年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba德鲁里等人，2022年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBrambilla等人，2022年gydF4y2Ba)，以增强珊瑚的复原力。它强调了珊瑚礁长期生存的适应对“争取时间”进行适应变化的重要性(gydF4y2Ba特鲁里街,2020gydF4y2Ba)．虽然许多珊瑚在预暴露于亚致死温度后，对热的耐受性有所改善(gydF4y2BaMiddlebrook等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBellantuono等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaPalumbi等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaBay和Palumbi, 2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaAinsworth等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaSchoepf等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2Ba迪尔沃思等人，2021年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)，这一过程的分子触发器和结果仍然知之甚少。gydF4y2Ba

在这项工作中，我们的目标是识别和描述在世界各地的造礁珊瑚中，基于适应的增加热韧性的分子途径gydF4y2BaPocillopora acutagydF4y2Ba．为了对这一特性进行功能分析，我们在活的成年珊瑚中开发、验证并进行了sirna介导的基因敲除实验。我们假设，通过热预适应，珊瑚加强了细胞内稳态gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba以谷胱甘肽为基础的抗氧化系统的改进，反过来防止氧化DNA损伤的积累。该机制可能是由BI-1蛋白介导的gydF4y2Ba通过gydF4y2BaNrf2/ARE信号通路。了解影响珊瑚适应热应激的细胞和分子机制是了解珊瑚和珊瑚礁生态系统的恢复力和权衡的重要一步。gydF4y2Ba

夏威夷土著文化与珊瑚和珊瑚礁有着深刻的联系，包括这项研究的基地——奥胡岛的kwhne 'ohe湾(gydF4y2Ba格雷格等人，2015年gydF4y2Ba)．我们希望尊重这种纽带以及当地社区与夏威夷陆地和海洋之间的独特关系，并感谢有机会进行这项研究。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

热预处理降低漂白敏感性gydF4y2Bap . acutagydF4y2Ba

本研究使用的珊瑚群落样本描述在预处理实验gydF4y2BaMajerova等人(2021年)gydF4y2Ba在急性热应激(32°C;gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．在这种急性应激中，与非预条件珊瑚(NPC)相比，预条件珊瑚(PC)的共生稳定性大大延长(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)．经过3天的热胁迫后，NPC珊瑚明显变白，而PC珊瑚则与对照、未处理的珊瑚相似。这种差异在5天的热应激后更加明显。个体珊瑚的共生体丧失速度明显慢于个体珊瑚(p< 0.001) (gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

预处理可选择性地提高宿主源性谷胱甘肽还原酶的活性gydF4y2Ba

谷胱甘肽还原酶的活性gydF4y2Bap . acutagydF4y2Ba受急性热应激(LMM，活度~调理*时间+(1|菌落)的影响;pgydF4y2Ba_{(时间)gydF4y2Ba}= 0.001)，且在个体珊瑚中的含量高于非个体珊瑚(pgydF4y2Ba_{(空调)gydF4y2Ba}< 0.001,gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)．有趣的是，清除过氧化物的抗氧化剂的活性增加了(pgydF4y2Ba_{(时间)gydF4y2Ba}= 0.009)，但PC和NPC珊瑚之间没有区别。过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶是两种不同过氧化物酶的活性升高，这两种过氧化物酶先前曾在受压力的珊瑚中检测到(gydF4y2BaYakovleva等人，2004年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba罗斯等人，2013年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrueger等，2015agydF4y2Ba；gydF4y2BaBielmyer-Fraser等人，2018gydF4y2Ba)，但这里使用的过氧化氢酶活性试剂盒不是特异性的，可以检测任何具有过氧化物酶活性的酶的活性(生物测定系统，个人通信)。因此，我们用一种特定的试剂盒(Bioassay Systems)分别测试了谷胱甘肽过氧化物酶的活性。在我们的样品中没有检测到谷胱甘肽过氧化物酶活性，因此我们得出结论，过氧化物酶活性主要是过氧化氢酶，尽管我们不能最终排除该试验的技术问题。gydF4y2Ba

为了检验谷胱甘肽还原酶活性的增加是否与基因表达的刺激有关，以及这种反应是双方共同的还是宿主特有的，我们分析了PC和NPC珊瑚在热应激时宿主和共生体基因的表达(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)．宿主谷胱甘肽还原酶的表达随着时间的推移和不同条件处理之间的变化(LMM，表达~条件*时间+(1|珊瑚)，pgydF4y2Ba_{(时间)gydF4y2Ba}< 0.001, pgydF4y2Ba_{(治疗)gydF4y2Ba}= 0.0098)。我们观察到，在热胁迫开始后不久，PC珊瑚的表达增加(pgydF4y2Ba_{(1小时)gydF4y2Ba}= 0.0736)，在3小时达到峰值，表达量比NPC珊瑚高约2倍(pgydF4y2Ba_{(3 h)gydF4y2Ba}= 0.0015)。gydF4y2Ba

共生体谷胱甘肽还原酶表达在不同条件处理间无显著差异(p = 0.8099)，且不随时间变化(p = 0.1485)。这表明谷胱甘肽还原酶的动态是由珊瑚宿主驱动的;然而，在宿主细胞或共生体细胞中，蛋白质活性和基因表达之间没有显著的相关性(gydF4y2Ba图S1gydF4y2Ba)，这是一种在动物界被描述的常见现象(见(gydF4y2BaLiu等，2016gydF4y2Ba))。gydF4y2Ba

增加抗氧化活性保护DNA免受氧化损伤gydF4y2Ba

谷胱甘肽还原酶有助于稳定细胞的还原环境，增强细胞清除ROS的能力，防止细胞应激，如DNA氧化损伤(gydF4y2Ba哈里维尔和古特里奇，2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaCouto等，2016gydF4y2Ba)．为了阐明谷胱甘肽还原酶活性的增加是否改善了热应激珊瑚对ROS的保护，我们分析了氧化鸟嘌呤物种(8-OHdG)的水平，氧化DNA损伤的标记物(gydF4y2Ba哈里维尔和古特里奇，2015年gydF4y2Ba)．PC珊瑚和NPC珊瑚在时间上有明显差异(双向方差分析，8-OHdG~调节*时间与Tukey)gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba测试、pgydF4y2Ba_{(时间:调节)gydF4y2Ba}= 0.0098,gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．与PC珊瑚不同，我们观察到在急性热应激24小时后，NPC珊瑚体内8-OHdG的积累(pgydF4y2Ba_{(人大)gydF4y2Ba}= 0.0991, pgydF4y2Ba_{(PC)gydF4y2Ba}= 0.4082, pgydF4y2Ba_{(NPC-PC 24小时)gydF4y2Ba}= 0.0310, pgydF4y2Ba_{(NPC - PC, 0h)gydF4y2Ba}= 0.7449)。gydF4y2Ba

为了加强抗氧化剂和珊瑚中氧化性DNA损伤之间的联系，我们在急性热应激时用10mM甘露醇处理NPC珊瑚。甘露醇被认为是一种非酶促抗氧化剂，可以保护植物和藻类免受活性氧(gydF4y2Ba帕特尔和威廉姆森，2016年gydF4y2Ba)，防止珊瑚组织聚集物的DNA普遍受损(gydF4y2BaNesa和Hidaka, 2008年gydF4y2Ba)．再次，NPC珊瑚在热应激期间积累了氧化DNA损伤的标记(单因素方差分析，pgydF4y2Ba_{(治疗)gydF4y2Ba}= 0.0044)，但添加10 mM甘露醇降低了这一增加(单因素方差分析，pgydF4y2Ba_{(没有治疗:甘露醇)gydF4y2Ba}= 0.0298, pgydF4y2Ba_{(控制:甘露醇)gydF4y2Ba}= 0.6869,gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)，证明了抗氧化防御系统和DNA损伤之间的直接联系。gydF4y2Ba

Pa-BI-1表达与预处理珊瑚谷胱甘肽还原酶表达相关gydF4y2Ba

BI-1 (BAX抑制剂1)是一种抗凋亡蛋白，它通过激活人类细胞中的Nrf2转录因子来增加抗氧化剂的产生，从而促进细胞存活(gydF4y2BaLee等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba哈维等人，2009年gydF4y2Ba)．我们先前发现PC珊瑚增加了pa-的表达gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba在急性热应激下的表现(gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．由于这些观察结果与我们测量谷胱甘肽还原酶(pa-gydF4y2BaGRgydF4y2Ba)，我们检测了pa-基因表达之间的相关性gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba和pa -gydF4y2BaGRgydF4y2Ba．我们观察到PC正相关(R = 0.76, pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}< 0.001)而非NPC (R = 0.126, pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}= 0.4679)珊瑚(gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba)，但处理之间的关系无显著差异(ANCOVA, pgydF4y2Ba_{(空调)gydF4y2Ba}= 0.2903)。最强烈的相关性发生在热应激的前3小时，我们观察到PC中两种基因的显著过表达在0小时时与对照样本相比(R = 0.910, pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}< 0.001但NPC珊瑚(R = 0.011, p(lm) = 0.9623, ANCOVA, pgydF4y2Ba_{(空调)gydF4y2Ba}= 0.0052 (gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba）;而且gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)，说明珊瑚BI-1可以调节PC珊瑚在应激条件下抗氧化基因的表达。gydF4y2Ba

sirna介导的敲除试验下调珊瑚GFP家族gydF4y2Ba

我们以GFP家族的蛋白质为靶点，在活的成年珊瑚中开发并验证了sirna介导的基因敲除方法，使用在非模式生物中开发类似技术的常用方法(gydF4y2Ba克利夫斯等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaKarabulut等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaYuyama等人，2021年gydF4y2Ba)．我们确定了12个预测gydF4y2BaPocilloporagydF4y2BaNCBI mRNA数据库中的GFP-like荧光色蛋白，并使用BLOCK-iT™RNAi Designer(赛默飞世尔科学公司)设计siRNA分子，以最佳预测成功率抑制单个预测GFP-like基因的表达。我们选择了一个与4个预测GFP-like基因具有100%序列相似性的siRNA双链，一个与7个预测GFP-like基因不匹配的核苷酸，并且与其中1个基因不互补。我们还设计了RT-qPCR引物来扩增gfp样基因的siRNA靶区(gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba)．两个引物要么与预测基因完全互补，要么在序列的中心部分包含一个不匹配的核苷酸。我们优化了siRNA给药和珊瑚取样的时间，并使用了一个没有已知靶点的对照siRNAgydF4y2BaPocilloporagydF4y2Ba转录组(siNTC)，以排除siRNA处理本身对研究基因和通路的影响。我们测试了几种输送方法，包括PEI(聚乙烯亚胺，Sigma Aldrich)， Lipofectamine2000(赛默飞雪科学)，氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba磷酸盐转染和Fuse-It (Ibidi)，并发现干扰素(Polyplus)是唯一的方法产生可靠的敲除目标基因。gydF4y2Ba

siRNA发育实验使用了来自8个不同亲本菌落的16个珊瑚片段(每个菌落1-3个分株)。我们分别分析了每个片段的GFP表达和来自宿主GFP和共生叶绿素a (ChlA)的荧光信号。我们发现9个珊瑚(代表8个亲本菌落中的6个)的GFP表达量较siNTC (gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)．表达下调范围为14% ~ 58%，平均32%±16%(均值±SD)。GFP表达的独立验证gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba共聚焦显微镜证实，对照组GFP与ChlA的比值下降至73%±30%(平均值±SD;(pgydF4y2Ba_{(四)gydF4y2Ba}= 0.0094)，范围为39%至80% (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．有两种珊瑚表现出例外，尽管表达下调，但GFP与ChlA的比值略有增加。gydF4y2Ba

pa-BI-1在预处理珊瑚中控制谷胱甘肽还原酶的表达gydF4y2Ba

为了证实pa- bi -1和pa- gr之间的联系，我们抑制了pa-的表达gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba在受热胁迫的PC珊瑚(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)．我们将热应激的起始时间优化到转染后48小时，以在急性热应激的最初几个小时实现最强的击倒gydF4y2Bapa-BI-1gydF4y2Ba在PC珊瑚中过度表达最为强烈(gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．我们成功地抑制了pa-gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba在17个珊瑚中的7个(类似于siGPF，我们任意设置了80%基因表达的阈值作为成功敲除)中，sintc处理珊瑚中pa-BI-1表达的14% - 80%(47%±24，平均值±SD;gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)．在所有进一步的分析中，我们只使用了被成功击倒的7个珊瑚。gydF4y2Ba

不出所料，我们观察到pa-的过表达gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba和pa -gydF4y2BaGRgydF4y2Ba用siNTC孵育的热胁迫PC珊瑚(gydF4y2Ba图4C, DgydF4y2Ba， siNTC)与对照珊瑚(环境温度下的PC珊瑚)比较。siBI-1击倒后(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba， siBI-1)， pa-的表达gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba和pa -gydF4y2BaGRgydF4y2Ba减少(gydF4y2Ba图4C, DgydF4y2Ba， Wilcoxon检验，pgydF4y2Ba_{(BI-1)gydF4y2Ba}= 0.0078, pgydF4y2Ba_{(GR)gydF4y2Ba}= 0.0156)，但表达量仍高于环境对照珊瑚(Wilcoxon检验，pgydF4y2Ba_{(BI-1)gydF4y2Ba}= 0.0781, pgydF4y2Ba_{(GR)gydF4y2Ba}= 0.0156)。pa-之间有很强的相关性gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba表情和pa-gydF4y2BaGRgydF4y2Ba(lm, GR~BI-1, p = 0.0036, r (gydF4y2BaFisher等，2015gydF4y2Ba) = 0.48)，表明对pa-有抑制作用gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba表达导致pa-的减少gydF4y2BaGRgydF4y2Ba表达式。gydF4y2Ba

为了排除siRNA处理的非特异性影响，我们分析了pa-的相关性gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba表达4个基因(pa-gydF4y2BaHSP70gydF4y2Ba,爸爸,gydF4y2Babcl - 2gydF4y2Ba,爸爸,gydF4y2Ba贝克gydF4y2Ba,爸爸,gydF4y2Ba伯灵顿gydF4y2Ba)曾被发现与珊瑚白化有关(gydF4y2BaPernice等人，2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaTchernov等，2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．选择这些基因是因为它们也遵循与pa-相似的表达模式gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba珊瑚的热应激。我们还包括了pa-gydF4y2BaNFKBIgydF4y2Ba(NFkB抑制剂)基因表达谱与pa-有差异gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba( （gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba图S3AgydF4y2Ba)．gydF4y2Bapa-BAXgydF4y2Ba而且gydF4y2Bapa-Bcl-2gydF4y2Ba显示出很强的相关性gydF4y2Bapa-BI-1gydF4y2Ba珊瑚虫的基因表达(gydF4y2Ba图S3BgydF4y2Ba) (rgydF4y2Ba_{(皮尔森)gydF4y2Ba}= 0.856和0.726;pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}< 0.001)和较弱但仍可观的相关性(rgydF4y2Ba_{(皮尔森)gydF4y2Ba}= 0.642和0.531;pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}< 0.001)。gydF4y2Bapa-BAKgydF4y2Ba而且gydF4y2Bapa-HSP70gydF4y2Ba在PC珊瑚中与pa-BI-1呈中度相关(rgydF4y2Ba_{(皮尔森)gydF4y2Ba}= 0.446和0.438;pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}= 0.013和0.0023)和-正如所预期的-的表达式gydF4y2Bapa-NFKBIgydF4y2Ba是否与表达有关gydF4y2Bapa-BI-1gydF4y2Ba在任何珊瑚(rgydF4y2Ba_{(皮尔森)gydF4y2Ba}= 0.27及0.203(分别适用于本地珊瑚及非本地珊瑚);pgydF4y2Ba_{(lm)gydF4y2Ba}= 0.12和0.18)。gydF4y2Ba

我们假设如果siRNA治疗不是特异性的gydF4y2Bapa-BI-1gydF4y2Ba基因或影响整个白化途径，我们将观察到参与珊瑚白化级联的多个基因的变化。siBI-1处理后，这些基因的表达无明显变化(gydF4y2Ba图S3BgydF4y2Ba)，支持siRNA处理对siBI-1基因表达的特异性。gydF4y2Ba

谷胱甘肽还原酶基因表达的降低会导致酶活性的降低gydF4y2Ba

基因表达的变化并不总是直接反映在蛋白质水平和/或活性上(gydF4y2BaLiu等，2016gydF4y2Ba)，因此我们测定了siBI-1基因敲除后珊瑚宿主组织中谷胱甘肽还原酶的活性。pa-的减少gydF4y2BaGRgydF4y2Ba在热应激后的24小时，酶活性显著下降(配对t检验，pgydF4y2Ba_{(活动)gydF4y2Ba}= 0.0391,gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)．5个珊瑚的谷胱甘肽还原酶活性迅速下降，而2个珊瑚的谷胱甘肽还原酶活性则轻微上升(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba；连接siNTC-siBI-1对的虚线)，表明pa-gydF4y2BaGRgydF4y2Ba表达确实导致pa-GR活性降低，但可能有基因型特异性的影响。gydF4y2Ba

pa-BI-1表达受到抑制的珊瑚更容易受到DNA氧化损伤gydF4y2Ba

为了研究热应激珊瑚中抗氧化系统和氧化DNA损伤之间的联系，我们使用8-OHdG标记分析了氧化DNA损伤水平gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba谷胱甘肽还原酶表达和活性的下调和随后的降低。经siBI-1处理的珊瑚在急性热应激时，DNA中沉积的氧化鸟嘌呤明显增加(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba；在32°C下24小时，配对t检验，p = 0.0181)，与对照siRNA处理的PC珊瑚进行比较。这一观察结果支持了一种假设，即在热应激时，珊瑚使用抗氧化剂来保护重要的细胞结构免受氧化损伤。gydF4y2Ba

珊瑚谷胱甘肽还原酶基因的启动子中存在抗氧化响应元件gydF4y2Ba

在哺乳动物中，BI-1可以激活Nrf2转录因子，调节基因表达gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-作用元素称为抗氧化反应元素(ARE)gydF4y2BaLee等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRaghunath等人，2018年gydF4y2Ba)在Nrf2靶基因的多个启动子中。Nrf2基因还没有在造礁珊瑚中被描述过gydF4y2BaNematostella vectensisgydF4y2Ba推测的Nrf2蛋白序列(GenBank KU746947.1)，返回几个硬化珊瑚中未特征位点的blast hits (tblastn)(例如，gydF4y2BaOrbicella faveolatagydF4y2BaLOC110060612, 93%查询盖，29.89%身份和1e-43 E-value, Acropora millepora LOC114950848, 54%查询盖，33.23%身份和2e-34 E-value，或gydF4y2BaPocillopora damicornisgydF4y2Ba， LOC113687044, 53%查询覆盖，30.94%身份和1e-43 E-value)，表明可能存在一种具有nrf2样功能的蛋白质。gydF4y2Ba

我们搜索了谷胱甘肽还原酶基因(XM_027196629.1)的启动子区域(在NW_020843386.1内)gydF4y2BaPocillopora damicornisgydF4y2Ba（gydF4y2Ba狡猾等人，2018gydF4y2Ba)，并发现了一个与are相似的序列5 ' -TGACTTAGC-3 ' (gydF4y2Ba班宁等，2005gydF4y2Ba；gydF4y2BaRaghunath等人，2018年gydF4y2Ba)在预测的基因ORF起始处上游557 bp处。这种ARE最初是在人肝癌细胞(HepG2)中谷胱甘肽过氧化物酶的启动子中发现并描述的，相对于+1转录起始位点的-76和-387位置(gydF4y2Ba班宁等，2005gydF4y2Ba)．这种惊人的相似性表明，Nrf2/ARE通路在进化上可能比之前认为的更为保守。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

像大多数生物一样，珊瑚有适应环境变化的能力，这可减低在热压力下白化的严重程度和死亡率(gydF4y2BaMiddlebrook等人，2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaBellantuono等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaPalumbi等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaBay和Palumbi, 2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaFoo和Byrne, 2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaSchoepf等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．然而，这种自然现象是基因型特异性的(gydF4y2Ba迪尔沃思等人，2021年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba德鲁里等人，2022年gydF4y2Ba)，并可能在未来气候变化情景下消失(gydF4y2BaAinsworth等，2016gydF4y2Ba)．应用这项保育策略的主要障碍之一(gydF4y2Bavan Oppen等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2Ba增加珊瑚礁复原力干预措施委员会等，2019年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba特鲁里街,2020gydF4y2Ba)是我们对适应和/或适应温度升高背后的分子和细胞机制的有限理解。在这里，我们表明基于预处理的适应是由反生命基因的相互作用介导的gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba以及影响健康的抗氧化反应gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba细胞表型，如DNA损伤。gydF4y2Ba

来自驯化珊瑚的转录组学数据揭示了在漂白过程中起作用的主要基因家族和细胞途径，但对造礁珊瑚的功能研究很大程度上缺失(gydF4y2BaBellantuono等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaPalumbi等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaBay和Palumbi, 2015年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba托马斯等人，2018gydF4y2Ba)．最近，我们展示了预条件作用gydF4y2BaPocillopora acutagydF4y2Ba很可能是由于程序性细胞死亡途径(PCD)的调节，导致了热耐受性的提高gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba自噬/ symbiophagy (gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．然而，在热胁迫下这种长期共生维持的主要信号或分子后果尚不清楚。在高温胁迫下，珊瑚宿主和共生生物会释放更多的活性氧(gydF4y2Ba暗示特等人，2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaArmoza-Zvuloni和《摇晃》，2014年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRoberty等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaDiaz等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2BaGardner等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba尼尔森等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaSzabó等，2020gydF4y2Ba)，它可以激活一系列调节途径，通常取决于ROS积累的水平(gydF4y2BaSchieber和Chandel, 2014年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRedza-Dutordoir和Averill-Bates, 2016gydF4y2Ba)．例如，在模型动物中，低剂量的ROS激活细胞生存信号通路，如未折叠蛋白反应(UPR)或Nrf2，而高剂量的ROS激活PCD (gydF4y2BaRedza-Dutordoir和Averill-Bates, 2016gydF4y2Ba)．因此，我们假设预处理后，热应激珊瑚体内ROS信号分子水平降低，从而导致PCD信号的改变。gydF4y2Ba

我们发现预处理珊瑚对热应力的耐受力较高，白化率较低(gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)在宿主组织中，谷胱甘肽还原酶的活性高于非预处理珊瑚，而过氧化物清除酶的活性则低于非预处理珊瑚。基因表达分析表明，谷胱甘肽还原酶活性的增加是由于珊瑚宿主的特异性反应，但不能简单地完全用表达率来解释。mRNA的水平并不总是与细胞蛋白水平相关，两者之间的关系在动态转变中有很大的差异，如短期适应。gydF4y2BaLiu等，2016gydF4y2Ba))，这是以前在热应激中观察到的一种模式gydF4y2BaSymbiodiniaceaegydF4y2Ba（gydF4y2BaKrueger等，2015bgydF4y2Ba虽然转录后和翻译后修饰可能对环境条件下PC珊瑚中抗氧化剂的活性、翻转率或定位产生积极影响，但我们的结果表明pa-可以快速诱导gydF4y2BaGRgydF4y2BaPC珊瑚的基因表达可能是急性热应激下观察到的活动差异的主要原因。gydF4y2Ba

谷胱甘肽是一种非酶促抗氧化剂，以还原性(GSH)和氧化性(GSSG)形式存在于细胞内(见gydF4y2Ba哈里维尔和古特里奇，2015年gydF4y2Ba))。谷胱甘肽在被氧化为谷胱甘肽二硫化物(GSSG)时中和ROS;这种氧化状态被谷胱甘肽还原酶(GR)转化回还原状态。在正常情况下，90%以上的谷胱甘肽库通过GR活性维持为GSH，因此GR直接负责维持细胞的还原环境和清除ROS。谷胱甘肽水平和/或参与谷胱甘肽氧化还原循环的酶活性与DNA氧化损伤呈负相关(gydF4y2BaLenton等人，1999年gydF4y2Ba；gydF4y2BaDannenmann等，2015gydF4y2Ba)．与ros相关的DNA氧化损伤可源于小鼠、人类、植物和鱼类细胞的热应激(gydF4y2Ba接着,2006年gydF4y2Ba；gydF4y2BaPurschke等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaCvjetko等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaLiu等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaKantidze等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba休斯顿等，2018gydF4y2Ba)，暴露于高温或阳光直射下的珊瑚组织外植体DNA损伤增加(gydF4y2BaNesa和Hidaka, 2008年gydF4y2Ba；gydF4y2BaNesa等，2012gydF4y2Ba)．相反，热适应可防止海军锅炉工在工作时暴露于高温下的血细胞中积聚8-OHdG标记物(gydF4y2Ba黄等人，2012gydF4y2Ba)．，gydF4y2Ba

经过24小时的热应激后，我们检测了PC和NPC珊瑚体内氧化DNA损伤标记8-OHdG的水平，发现NPC珊瑚会积累这些标记，而PC珊瑚则不会。先前的实验显示，加入外源抗氧化剂甘露醇可减少热胁迫珊瑚细胞聚集体的DNA损伤(gydF4y2BaNesa和Hidaka, 2008年gydF4y2Ba)，因此我们在一组新的NPC珊瑚上使用这种抗氧化剂，以巩固抗氧化系统与整个成年珊瑚生物DNA损伤之间的联系，证明抗氧化系统是造成PC珊瑚和NPC珊瑚DNA损伤差异的主要原因。gydF4y2Ba

DNA损伤也会引发不同的细胞死亡途径，包括自噬(gydF4y2BaSurova和Zhivotovsky, 2013gydF4y2Ba)，支持我们先前的研究结果，即预适应改善珊瑚的耐热性gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba自噬途径的调节(gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)．BI-1 (BAX-1抑制剂)是一种参与PCD通路调节的促生存PCD基因，被证明可以减少脊椎动物体内ROS的积累，并激活Nrf2, Nrf2是一种多种抗氧化剂的转录因子，包括谷胱甘肽还原酶(gydF4y2BaLee等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRobinson等人，2011年gydF4y2Ba)．有趣的是，我们看到了pa-的上调gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba在热应激3小时时达到峰值(gydF4y2BaMajerova等，[[NoYear]]gydF4y2Ba)与宿主谷胱甘肽还原酶的表达平行。我们比较了pa-的表达率gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba和pa -gydF4y2BaGRgydF4y2Ba在PC珊瑚和NPC珊瑚中，它们在热应激反应早期(< 6小时)高度相关，但在NPC珊瑚中没有(gydF4y2Ba图S2gydF4y2Ba)．我们假设预处理可能使pa- bi -1有效调节pa-的表达gydF4y2BaGRgydF4y2Ba通过表观遗传修饰的pa-gydF4y2BaGRgydF4y2Ba监管元素。DNA甲基化模式因生活在不同环境中的珊瑚而异，在受环境变化影响的珊瑚中，甲基化模式随时间变化而变化，这可能使基因表达能够根据不同的条件进行微调(gydF4y2Ba普特南等，2016年gydF4y2Ba；gydF4y2BaLiew等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaLiew等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRodríguez-Casariego等，2020gydF4y2Ba)．未来的实验应该研究预适应、表观遗传修饰和珊瑚特定基因表达之间的联系。gydF4y2Ba

为了证明pa-BI-1和pa-GR之间的功能相关性，我们开发了一种sirna介导的成年珊瑚基因敲除方案。基因敲除法在刺胞动物研究中效率有限，仅在少数研究中使用，是这些非模式生物功能研究的主要障碍。由于刺胞动物的骨骼结构，现有的方案在技术上不适用于成虫造礁珊瑚，而依赖于微注射幼虫或海葵电穿孔作为给药技术(gydF4y2BaYasuoka等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba克利夫斯等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaKarabulut等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaYuyama等人，2021年gydF4y2Ba)．其他使用脂质体化合物的研究将长dsRNA转移到海葵或珊瑚幼虫中，在那里动物的RNAi机制被允许加工成siRNA (gydF4y2Ba邓恩等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba邓恩等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYuyama等人，2021年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在本实验中，我们使用经过处理的siRNA专门针对感兴趣的基因，并使用脂质囊泡干扰素(Polyplus)将其传递到珊瑚组织，这被证明是最有效的和唯一可重复的方法。我们首先瞄准了绿色荧光蛋白家族，这是一种验证非模型生物基因敲除的标准策略，因为它很容易实时监测成功(gydF4y2Ba克利夫斯等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaKarabulut等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaYuyama等人，2021年gydF4y2Ba)．我们能够在大多数测试珊瑚中实现GFP蛋白的显著下调，并且我们假设珊瑚粘液可能会干扰某些个体的siRNA转染过程，这意味着在进行siRNA相关实验的个体必须首先进行成功敲除的测试，然后才能进行进一步的功能分析。此外，我们取得的敲除效率允许研究在特定细胞和分子过程中上调的基因的功能(在过表达的基因敲除接近基础水平后)，但可能不适用于完全功能丧失的研究。gydF4y2Ba

我们的siRNA方法允许我们通过抑制pa-在功能上连接BI-1基因表达与珊瑚抗氧化系统gydF4y2BaBI-1gydF4y2Ba预处理珊瑚在急性热应激中的过表达。我们对17个珊瑚中的8个的基因进行了处理，使pa-下降gydF4y2BaGRgydF4y2Ba表达和导致pa-下降gydF4y2BaGRgydF4y2Ba表明pa-BI-1在预处理珊瑚中调节pa-GR的基因表达。pa-表达降低gydF4y2BaGRgydF4y2BasiBI-1珊瑚的谷胱甘肽还原酶抗氧化活性下降，导致比对照组siRNA (siRNA在siBI-1中无已知靶点)处理的珊瑚更多的氧化损伤gydF4y2Bap . acutagydF4y2Ba)，支持抗氧化剂可防止珊瑚细胞氧化损伤的假说。gydF4y2Ba

在脊椎动物模型中，BI-1也被发现通过Nrf-2转录因子(gydF4y2BaLee等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba哈维等人，2009年gydF4y2Ba)．尽管在造礁珊瑚中还没有发现Nrf2基因，但在海葵中发现了Nrf-2基因的同源物并加以注释gydF4y2BaNematostella vectensisgydF4y2Ba(GenBank KU746947.1gydF4y2BaLayden等，2016gydF4y2Ba)，其中Nrf-2介导的氧化应激反应途径在热应激期间以共生形态激活，而非非共生形态激活(gydF4y2Ba魏茨曼和列维，2019年gydF4y2Ba)．Nrf2调节抗氧化基因的表达gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba与所谓的ARE(抗氧化反应元件)结合gydF4y2Ba独联体gydF4y2Ba-位于转录起始位点上游(gydF4y2BaRaghunath等人，2018年gydF4y2Ba)．在珊瑚谷胱甘肽还原酶基因的假定启动子中，我们发现了一个与人类肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶基因启动子中描述的类似的ARE (gydF4y2Ba班宁等，2005gydF4y2Ba)，表明Nrf2/ARE通路在刺胞动物中是保守的，在环境应激反应中，它控制着抗氧化基因的表达。因此，我们认为该通路也可能连接BI-1和谷胱甘肽还原酶gydF4y2BaPocillopora acutagydF4y2Ba，但需要更多的实验来证实这一假设。我们建议下一步应包括:i)珊瑚白化过程中相关基因敲除的功能研究(当通过siRNA处理分析共生体的丢失时)，ii)探索预适应条件下表观遗传调控的变化，iii)分析预适应条件下珊瑚细胞/组织中ROS的释放。gydF4y2Ba

本研究描述了热胁迫下珊瑚共生维持的细胞和分子原理，以及在适应过程中如何进行调节，这是珊瑚礁长期生存的重要生态途径。本研究的数据表明，预暴露在热应激下可以通过bi -1介导的谷胱甘肽还原酶过表达提高珊瑚维持细胞氧化还原稳态的能力。这可以防止氧化应激标记物8-OHdG的积累，避免激活程序性细胞死亡，并导致珊瑚-藻共生的延长。相反，热应激珊瑚可能会经历高ROS、随后的氧化应激、激活细胞死亡途径和白化。gydF4y2Ba

描述和理解石珊瑚的复原轨迹，对于根据(人类)辅助进化(gydF4y2Bavan Oppen等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2Ba增加珊瑚礁复原力干预措施委员会等，2019年gydF4y2Ba)．对成体造礁珊瑚进行功能研究的新方法的发明促进了这一目标，并极大地促进了我们对生物对环境压力的反应及其适应未来气候情景能力的不断增长的认识。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

收集、实验设置和预处理gydF4y2Ba

七个殖民地gydF4y2Bap . acutagydF4y2Ba于2018年春季在夏威夷kwhayne 'ohe湾的3个不同地点和深度1至4米之间收集，以最大限度地提高收集不同基因型的可能性(21.45036 N 157.79563 W;21.44443 n 157.79536 w;21.44007 N 157.79174 W)。除非另有说明，菌落保存在自然光照和温度条件下的流动槽中。实验处理方法如gydF4y2BaMajerova等人(2021年)gydF4y2Ba．简单地说，珊瑚被分成两半，分别分到预处理池和对照池中，PC珊瑚在29°C的环境下暴露72小时，然后回到环境(26°C)，而NPC珊瑚则维持在26°C (gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)．这些温度分别代表了卡瓦内奥赫湾夏季月份的典型温度峰值和夏季前的平均温度(NOAA测量，Mokuoloe站#1612480，和[gydF4y2BaMajerova等人，2021年gydF4y2Ba)]。珊瑚被破碎成约5厘米的小块状，安装在文石插头上，重新分配到处理槽中。在26°C的环境下两周后，珊瑚被暴露在32°C的处理或对照环境中，并在0、1、3、6、12和24小时采样(0h是暴露前的时间点，采样时间为上午8时)。在每个时间点对一个完整的核进行次采样并使用。样品立即保存在-80°C。用延时共聚焦显微镜(蔡司LSM-710)评估漂白率作为共生体与宿主信号比的变化gydF4y2BaMajerova等人(2021年)gydF4y2Ba在每个时间点重复使用一个单独的小块进行共聚焦显微镜分析。gydF4y2Ba

抗氧化活性测定gydF4y2Ba

之前储存在-80°C的样品在Qiagen TissueLyser中在冰冷萃取缓冲液(100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, pH 7.5)中均质(30 sgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}用酸洗玻璃微珠(Sigma)。低速离心(800g, 5min, 4℃)分离共生体和宿主细胞，然后超声3 min。离心(14000g, 10min, 4℃)将细胞碎片压成颗粒，使用Qubit protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)测定全细胞蛋白提取液浓度。蛋白质提取物立即分别用于酶促过氧化氢酶检测试剂盒和酶促谷胱甘肽还原酶检测试剂盒(BioAssay Systems)。实验前对工作蛋白浓度进行优化，以确保所测活性在试剂盒检出限范围内。在过氧化氢酶检测试剂盒和谷胱甘肽还原酶检测试剂盒中分别使用1340 ng和300 ng的全细胞蛋白提取液，将酶活性归一化至总蛋白。每次分析包括每个时间点一个样本和每个菌落(ngydF4y2Ba_{(殖民地)gydF4y2Ba}= 7)。样品分批提取(每次最多12个样品)，以减少提取时间，同一菌落的对照和处理样品总是一起提取，以尽量减少由于样品处理不同而产生的观察差异。gydF4y2Ba

过氧化氢酶检测试剂盒不是专门针对过氧化氢酶，而是测量所有过氧化物清除抗氧化剂的活性，因此我们使用酶铬谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(BioAssay Systems)来区分不同的过氧化物清除抗氧化剂的活性。所有检测结果(总蛋白2 ~ 10 μg)均低于试剂盒的检出限。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

基因表达分析如gydF4y2BaMajerova等人(2021年)gydF4y2Ba．简单地说，就是提取RNAgydF4y2Ba通过gydF4y2Ba核糖核酸提取试剂(VWR生命科学)与DNase I步骤之间的苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀。两步反转录定量PCR (RT-qPCR)分析方法如下:1μg RNA用高容量cDNA反转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific)反转录，qPCR反应用12 μl PowerUp™SYBR™Green Master Mix (Applied Biosystems)按照制造商说明进行40个循环。每个引物对的效率通过稀释曲线和熔化曲线分析进行测试。使用Best Keeper软件(gydF4y2BaPfaffl等，2004gydF4y2Ba)和pa-gydF4y2BaEF-1gydF4y2Ba(延伸系数1a，gydF4y2Bap . acutagydF4y2Ba),gydF4y2Ba山姆gydF4y2Ba(S-adenosyl-l-methionine合成酶,gydF4y2BaSymbiodiniumgydF4y2Basp。gydF4y2Ba）gydF4y2Ba对热胁迫表现出最高的表达稳定性，经软件算法筛选为内参基因。所有引物序列列于gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba．用ΔΔCt方法计算在时间0时相对于非预处理珊瑚的靶基因表达量。gydF4y2Ba

每次分析包括每个时间点一个样品和每个菌落(ngydF4y2Ba_{(殖民地)gydF4y2Ba}= 7)。本研究中所有引物的序列列于gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

氧化DNA损伤测定gydF4y2Ba

为了评估氧化应激对DNA的影响，我们分析了PC和NPC珊瑚中8-羟基-2 ' -脱氧鸟苷(8-OHdG)的水平，作为DNA累积氧化损伤的代理。在24小时的热应力(如上所述)之前和之后，每组6个珊瑚的2个碎片被取样，冷冻并保存在-80°C。gydF4y2Ba

我们使用自定义的提取协议，从宿主细胞中提取DNA后，共生体和宿主细胞如上所述分离。低速离心后，在含有宿主细胞和细胞核的上清中加入终浓度为0.5%的SDS, 58℃孵育15 min。然后加入蛋白酶K(终浓度为0.5 mg/ml)， 58℃孵育2 h。孵育后冷却至室温，加入乙酸钾至终浓度0.5 m。离心(14000g, 10 min, 4℃)，用异丙醇(1:0.7比)沉淀上清。沉淀后，DNA球粒重悬于水中，RNAse A处理样品15分钟。DNA经苯酚-氯仿萃取纯化，然后乙醇沉淀(-20℃过夜)，重悬于水中。取20 μl的500 ng总基因组DNA，在95℃下变性5 min，在冰上快速冷却，在37℃下用20 U的核酸酶P1 (NEB)消化成单核苷酸，在37℃下用1u的虾碱性磷酸酶(NEB)去磷酸化30 min。所有酶在75°C灭活10分钟。然后将DNA在1x测定缓冲液中稀释1:5，根据试剂盒说明书(DNA Damage Competitive ELISA kit, Invitrogen)处理。对测定中使用的初始DNA浓度进行了优化，以确保结果值在试剂盒检测限的最佳范围内(介于Std3 (2000 pg/ml)和Std6 (250 pg/ml)之间)。我们使用MyCurveFit.com软件对标准曲线建模并预测结果值。每个时间点使用2个样品进行分析，每个菌落总共使用6个菌落进行处理和调理。对生物重复结果取平均值后进行统计分析。gydF4y2Ba

谷胱甘肽还原酶活性增加的珊瑚不易发生氧化性DNA损伤积累，因此我们决定测试外源性抗氧化剂对热应激非前置条件珊瑚的影响。为了进行这项分析，我们于2020年春天从kwhone 'ohe湾收集了一组新的珊瑚，并按照上述方法进行了制备。这组新的珊瑚被用于接下来的甘露醇实验和siRNA验证和测试实验(见下文)。gydF4y2Ba

为了分析外源性抗氧化剂对氧化性DNA损伤的影响，我们用10mm甘露醇(gydF4y2BaNesa和Hidaka, 2008年gydF4y2Ba)或在自然光线下的封闭系统水箱中进行热应激实验期间的海水对照(6个NPC和6个PC珊瑚，每次处理每个珊瑚群2个突起)。所有珊瑚碎片在急性热应激(32°C) 24小时后取样，冷冻并保存在-80°C。DNA损伤试验如上所述。gydF4y2Ba

核设计gydF4y2Ba

BLOCK-iT™RNAi Designer(赛默飞世尔科学公司)用于设计siRNAgydF4y2Bap . damicornisgydF4y2BaBI-1 mRNA序列(XM_027189407.1，gydF4y2Ba狡猾等人，2018gydF4y2Ba)和预测的gfp样mRNA (XM_027188377.1)。为了使大多数GFP-like基因可能沉默，我们将所有提出的siRNA序列与我们发现的12个预测GFP-like蛋白的集合对齐gydF4y2BaPocilloporagydF4y2Ba在NCBI转录组数据库中(XM_027191428.1, XM_027191431.1, XM_027188381.1, XM_027195143.1, XM_027188383.1, XM_027188379.1, XM_027188378.1, XM_027188377.1, XM_027188376.1, XM_027195136.1, XM_027188380.1, XM_027188372.1)，并选择与最多蛋白质匹配度最高的序列。对于BI-1沉默，我们选择了包含BCD Tuschl 's模式的排名最高的siRNA序列(gydF4y2BaElbashir 2001gydF4y2Ba)和1437 bp长的mRNA序列中的194- 212靶区。对照siRNA (siNTC)被设计成包含与siBI-1相同的核苷酸组成，但在siBI-1中没有已知的靶点gydF4y2Bap . damicornisgydF4y2BamRNA序列数据库。所有siRNA分子均由Sigma-Aldrich合成。所有siRNA分子的序列列于gydF4y2Ba表S1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

siRNA-mediated击倒gydF4y2Ba

PC珊瑚碎片(约3厘米长)放入20毫升的培养小瓶中，完全浸入常温海水的流动槽中，留置过夜。第二天，小瓶被移到精确的温控水浴中，在不干扰珊瑚的情况下小心地取出海水，根据制造商的说明进行siRNA转染(干扰素gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba转染试剂Polyplus)。siRNA转染混合物(20µl的10nM siRNA和16µl的干扰素gydF4y2Ba^®gydF4y2Ba将250 μl 0.2 nm过滤海水中的试剂直接移到裸露的珊瑚上，约2分钟后，加入5 ml 0.2 nm过滤海水，使珊瑚完全覆盖结节，在室温下孵育6小时。在此之后，珊瑚被完全淹没在一个带有常温海水的流动槽中两天。siBI-1实验中，siRNA转染开始48小时后，珊瑚暴露于急性热应激(32°C，上升速度为每10分钟~1°C)。胁迫后3小时，每只珊瑚采样用于基因表达分析，胁迫后24小时用于谷胱甘肽还原酶活性和DNA损伤分析，两个时间点使用相同的片段。采样消耗了片段。gydF4y2Ba

共焦显微镜gydF4y2Ba

用于siGFP实验的珊瑚的图像描述在gydF4y2BaMajerova等人(2021年)gydF4y2Ba，并作出以下调整。每个珊瑚结节用EC Plan-Neofluar 2.5x/0.075物镜扫描三次，使用Z-Stack模式，固定12层，组织厚度约为0.1 mm。然后用斐济软件(ImageJ)对图像进行处理(gydF4y2BaSchindelin等人，2012gydF4y2Ba)使用z投影设置为Sum Slices来显示通过所有组织层的共生体和gfp衍生信号的总和。然后，我们测量了扩散到整个碎片(除了珊瑚虫的嘴、触须和明显受伤的组织(如切除瘤后))的10个圆形感兴趣区域(roi)的信号强度，并比较了siGFP和siNTC处理珊瑚之间的GFP信号与共生衍生信号(叶绿素a)的比值。珊瑚鱼的嘴和触须被避免，主要有两个原因，i)珊瑚在显微镜下往往会主动伸展和收回触须，这使得在z-stack模式下扫描非常困难，导致模糊的z投影，ii)在这些区域的GFP信号要高得多，所以不可能使用相同的显微镜设置同时获得适当的信号强度范围。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有统计分析均在R (gydF4y2BaR核心团队，2020年gydF4y2Ba)使用下列库(按英文字母顺序排列):gydF4y2BabestNormalize, car, cowplot, dplyr, egg, emmeans, ggfortify, ggplot2, ggpmisc, ggpubr, ggsignif, lme4, longpower, mgcv, plotrix, readxl, tidyr, tidyverse, viridisgydF4y2Ba．测试数据集的正态性(直方图图)和异方差(Levene检验)，并根据需要使用对数变换或gydF4y2BaBestNormalizegydF4y2Ba函数在R中。gydF4y2Ba

将数据归一化到每个菌落的初始对照活性(NPC，时间0)后，我们分析了抗氧化活性。我们使用了一个以条件和时间为主要效应，以群体为随机效应的广义混合模型(lmer函数，包lme4)gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba测试每个时间点。gydF4y2Ba

我们将数据归一化到每个菌落的初始对照表达后，分析基因表达。我们使用广义混合模型分别检验每个基因的归一化表达，以条件作用、处理和时间为主要效应，以菌落为随机效应。我们估计最小二乘均值，并使用bonferroni调整的p值在每个时间点的处理之间进行比较。gydF4y2Ba

为了分析DNA损伤，我们用双向方差分析比较了以时间和条件作用为主要效应，以Tukey HSD为主要效应的PC和NPC珊瑚的8-OHdG (pg / μl DNA)水平gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba分析。以甘露醇处理(对照、热应激、甘露醇热应激)为变量，然后用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验甘露醇处理对DNA损伤的影响gydF4y2Ba因果gydF4y2Ba测试。gydF4y2Ba

我们计算Pearson相关系数和方差，用线性回归解释a)基因表达与酶活性和b) BI-1和谷胱甘肽还原酶表达之间的关系。我们用ANCOVA比较预处理处理间BI-1和GR表达的相关性。gydF4y2Ba

sirna介导敲除对siGFP实验中GFP表达的单尾t检验、siGFP显微镜下的双尾t检验以及siBI-1实验中归一化对照(环境温度，未处理)珊瑚样本的双尾配对样本Wilcoxon检验。siBI-1实验的抗氧化活性数据也先归一化以对照珊瑚样本，然后进行配对双尾t检验。用原始数据对sirna处理珊瑚的DNA损伤分析进行配对双尾t检验。gydF4y2Ba

统计分析总结在gydF4y2Ba表S2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提出的原始贡献已列入文章/gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba．进一步查询可向通讯作者联系。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

EM构思实验，进行研究，分析数据，并撰写手稿。CD分析数据并撰写手稿。所有作者都对文章做出了贡献，并批准了提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由保罗·g·艾伦家族基金会、安嫩伯格基金会和国家科学基金会(IOS-2041401)资助。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

我们要感谢Shayle Matsuda, Fiona C. Carey, Filip Blaštík和vojtvlch prokolopek在珊瑚收集和siRNA敲除优化测试方面的帮助，以及Tomáš buryikka在酶检测执行方面的建议。我们感谢托博实验室(HIMB)提供的仪器。我们把这份手稿献给露丝·盖茨，是她启发我们用分子工具来理解珊瑚白化危机。这项工作由保罗·g·艾伦家族基金会、安嫩伯格基金会和国家科学基金会(IOS-2041401)资助。根据SAP-2020-25收集到HIMB的珊瑚。这是HIMB贡献1904和SOEST贡献11570。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中表达的所有主张仅代表作者的观点，并不代表其附属组织的观点，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充材料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmars.2022.971332/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

补充表1 |gydF4y2Ba本研究中使用的引物和sirna列表。gydF4y2Ba

补充表2 |gydF4y2Ba手稿中使用的统计方法和代码列表。gydF4y2Ba

补充图1 |gydF4y2Ba所有时间点谷胱甘肽还原酶活性与基因表达的相关性。在宿主细胞或共生细胞中基因表达与酶活性之间没有明显的相关性。原始表达式计算为2gydF4y2Ba^{——ΔCtgydF4y2Ba}ΔCt = CtgydF4y2Ba_{(目标)gydF4y2Ba}- - - - - - CtgydF4y2Ba_{(参考),gydF4y2Ba}原料活度以U/L为单位。N = 6。gydF4y2Ba

补充图2 |gydF4y2Ba在环境温度预适应后和急性热应激早期，珊瑚中BI-1和谷胱甘肽还原酶的表达相互关联。非预处理(NPC)珊瑚用红色表示，预处理(PC)珊瑚用青色表示。所有表达水平归一化到对照珊瑚(环境温度下的NPC)使用2gydF4y2Ba^{——ΔΔCtgydF4y2Ba}公式。rgydF4y2Ba_PgydF4y2Ba为Pearson相关系数，p为p值。gydF4y2Ba

补充图3 |gydF4y2Ba(一)gydF4y2Bapa-BI-1基因表达与其他参与漂白途径基因的相关性。gydF4y2Ba(B)gydF4y2Bapa-BI-1敲除后这些基因的表达。非预处理(NPC)珊瑚用红色表示，预处理(PC)珊瑚用青色表示。所有表达水平归一化到对照珊瑚(环境温度下的NPC)使用2gydF4y2Ba^{——ΔΔCtgydF4y2Ba}公式。rgydF4y2Ba_PgydF4y2Ba为Pearson相关系数，p为p值。箱线图显示了数据的中位数，第一和第三四分位数以及各自的数据点。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba