原创研究文章

前面。3月科学。，07 November 2022
第二节海洋生物地球化学
https://doi.org/10.3389/fmars.2022.994515

水中粒子数的窘境

Alexander B. Bochdansky ^{1 *}，

Huanqing黄 ¹而且

莫林·h·孔蒂 ²

¹美国弗吉尼亚州诺福克市老道明大学海洋与地球科学系
²百慕大海洋科学研究所，圣乔治，百慕大

对水生粒子及其粒径谱的光学测量已成为研究光在水中传播、水团分类以及影响粒子聚集和通量的营养相互作用动力学的重要工具。在这里，我们证明了在图像分析中使用的典型设置由于粒子-凝胶连续体大大低估了粒子数。应用大范围的阈值来改变我们的检测系统的灵敏度，我们表明，大凝胶不能从更致密的粒子中分离，每体积的真实粒子数不能确定;只能报告与定义的阈值相关的相对值。因此，选择一个足够低的检测阈值以准确记录更多粒子的数量级，还是选择一个更高的阈值以产生更好的浮游生物图像质量，这是一个两难的选择。通过观察水系统中丰富的阳离子桥凝胶特有的凝固和溶解步骤的动力学，我们发现自然存在的凝胶，以及附着在它们上的微观粒子，导致了不确定的粒子数。相比之下，粒子数谱的斜率在很大程度上不受图像分析灵敏度设置的影响。影像系统通常捕捉不到的较弱颗粒的加入，为我们提供了一扇窗口，让我们了解与小型浮游生物和依赖于颗粒密度的过程相关的真正微尺度空间异质性，如表面相关的化学反应以及颗粒凝固和聚集动力学。

简介

通过成像系统进行光学粒子表征已成为水生研究不可缺少的内容(Jackson等人，1997；Sosik和Olson, 2007；斯坦曼等人，2008年；Guidi等，2009；Iversen等人，2010；Picheral等，2010；Forest等人，2012；Boss等人，2015年；Omand等人，2015年；隆巴德等人，2019年；哈顿等人，2021年；Picheral等人，2022年)．然而，如何定义水生系统中的粒子并不像看起来那么简单。可以从胶体的分类中借用一个定义(Gustafsson和Gschwend, 1997)，即粒子在物理和化学上与外界不同，或换句话说，粒子之间存在一个界面。然而，与胶体相比，粒子没有大小上限(哈顿等人，2021年)．

粒子与周围介质之间物理化学特性的差异有助于通过光吸收和散射(乔纳斯和富尼耶，2007年)．因此，将图像信息转换为粒子信息的图像分析算法与将被认为是粒子的背景与非粒子背景(吉林等人，2020年)．这就需要在光学特性方面对粒子的构成做出重要的决定，然而到目前为止，对于任何现有的成像系统，文献中都没有报道过绝对的截止或阈值。相机-图像分析配对的阈值水平通常是主观调整的，通常是依靠浮游生物在信号强度范围(Samson等人，2001年；戴维斯等人，2005年；Sosik和Olson, 2007；Cowen和Guigand, 2008；Picheral等，2010；奥曼等人，2019年；吉拉德等人，2022年)．然而，如果把相机只对准光学密度高的粒子，数量多得多的微弱粒子的信息就会丢失。

在这项研究中，我们使用了一种足够敏感的光学排列来捕获部分水凝胶原位并探索了它们相对于密度更大的粒子池的丰度。当我们在一个光学构型中演示这个问题时，粒子定义的考虑普遍适用于所有光学和非光学系统。

材料与方法

原位成像

我们系统的基本配置与以前的影图相机相同(阿诺德和纳托尔-史密斯，1974年；Cowen和Guigand, 2008；奥曼等人，2019年)，除了没有镜像的直接内联配置和我们系统较小的空间尺度(图像场:15.36 mm x 11.52 mm, 1280 x 960像素，图像体积:5.3 ml)。光源是一个红色LED (625 nm, Cree XLamp)，由一个150毫米的平凸透镜准直。然后，光线依次通过25.4毫米蓝宝石窗、30毫米海水和另一个25.4毫米厚蓝宝石窗、100毫米平凸透镜，然后被1/3英寸单色CMOS芯片收集，该芯片带有全局快门(Imaging Source, LLC)，并配有25毫米板相机镜头(f/2.5, V-4325，马歇尔电子公司)。在这种远心设置中，图像路径远边缘的模糊是对称的，质心被保留，因此粒子的边缘被相对准确地渲染，即使它有点失焦(渡边和纳亚尔，1997年；兰格,2022)．图像由一台微型电脑记录在1tb的micro-SD卡上。对于马尾藻海的导电性、温度和深度(CTD)玫瑰结铸件，光学装置和电子设备被封闭在一个额定海拔6000米的不锈钢外壳中。在里雅斯特湾的浅层部署中，光学和电子设备被封闭在较轻的聚氯乙烯(PVC)外壳中，仍然配备25.4毫米蓝宝石窗，以保持与深海版本相同的光学配置。该分析的实际粒径下限为43 μm，相当于约4像素的线性维数。

对于马尾藻海的图像，相机被安装在海洋通量计划部署的CTD花环的下环上(Conte等人，2001年)．从2021年4月14日至4月21日，在北纬63.0 - 64.3和西经31.0 - 32.5处，每隔1秒拍摄了11次(包括向下和向上)表层(0-100米)的图像(n = 45512)。里雅斯特湾的图像(n = 2,125;(北纬45°31.56 ' N，东经13°35.41)，由一名水肺潜水员于2021年7月18日在第一个温跃层下4 - 7米的深度记录了36分钟，帧率为每秒1幅图像。在纯水中记录一个级千分尺(共1毫米，增量0.01毫米)和显微镜载玻片上的阶梯式中性密度过滤器(OD = 0.04到1.0，设计波长400到700 nm, Edmund Optics)，用于校准。

实验室实验

为了测试影图成像系统对部分水凝胶是否敏感，我们设计了一个实验，在超纯水中提供最纯净的凝胶。这避免了任何可能影响结果的固体或共沉淀物的污染。藻酸盐是透明外聚物粒子(TEP)的代表性前体(孟和刘，2016)，并且由于它们含有阿利新蓝附着的糖酸(例如糖醛酸)，因此它们被用作定义环境中产生的TEP (Alldredge等人，1993年；Passow 2002)．TEP是水凝胶的一个重要子集，从微凝胶到巨凝胶的尺寸范围很广(Verdugo等人，2004年)．用相同的光学结构记录了凝胶粒子的实验室实验现场图像(30毫米光程)除了使用一个小的(40毫升)玻璃罐。磁性搅拌器使溶液充分混合，并减少了由于物理密度变化而产生纹影效应的时间(Davidhazy 2006)．在超纯水(18.2 MΩ。用超纯水(0.2 g L .)海藻酸钠溶液代替^－1)，同样的溶液中加入0.4 ml的0.1 M的氯化钙₂解决方案(孟和刘，2016)，然后加入0.4 ml的0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)。实验在25°c下进行，级测微计和中性密度过滤器记录如上。在每个序列中，取5ml子样品用于透明外聚物颗粒的染色(Alldredge等人，1993年)．它们被过滤到0.4 μm孔径的聚碳酸酯过滤器(Isopore, Millipore Sigma)上，用Alcian blue染色，用超纯水冲洗，安装在Cyto-clear载玻片上(洛根等人，1994年)，并在明亮视野下的复合显微镜下观察(Alldredge等人，1993年)．

图像处理

原始图像已使用平场法(威尔金森,1994)．在实验室，用超纯水拍摄的空白图像减去实验图像。用于分析原位图像，并考虑到整体光场的任何变化，或LED或相机芯片的性能的变化，连续图像的图像对彼此减去(Bochdansky等，2013)．因此，通过去除透镜或光口表面上的任何杂质来确定粒子，因此代表了粒子数量的保守估计。因此，用于分析的每个图像对的体积是10.6 mL (2 x 5.3 mL)。然后使用全局阈值(5到70)对灰度图像进行二值化。采用Canny边缘检测(奥曼等人，2019年；吉林等人，2020年)，并使用Matlab成像工具箱分析尺寸和其他特征。粒子数谱计算采用对数仓尺寸(Jackson等人，1997；Ghasemi等人，2018年)．颗粒大小的计算方法为与原始颗粒的阴影图(像素)相同面积的球体的等效球径(Bochdansky等，2017)．

在线性回归分析中，根据Kolmogorov-Smirnov检验统计量，残差不符合参数检验的正态性假设。因此，使用基于10,000个随机数据对的随机化检验计算p值(男子气概的,2007)．

结果

粒子数在数量级上变化，而光谱斜率变化不大

我们分析了两种截然不同的海洋环境:马尾藻海(0 - 100米深)和里雅斯特湾(北亚得里亚海，4 - 7米深)的表层水中粒子的阴影图像。马尾藻海是一个少营养的开放海洋环流系统，而里雅斯特湾是一个富营养的海岸环境，具有高丰度的藻类聚集体和废弃的附录藻屋，它们形成了海洋雪的初始支持矩阵。在这两种环境中，图像分析使用了各种不同的阈值水平。由此得到的数字谱显示，随着粒径的增大，粒子数典型地减少(图1)．然而，粒子数也随着两种环境中应用的阈值水平发生了很大的变化(图1模拟)．马尾藻海(图1一个)比在里雅斯特湾(图1 c)，表明在马尾藻海中检测到的微弱粒子比例更高。

图1

图1马尾藻海粒径43 μm ~ 1.7 mm颗粒的粒子数谱(一)和里雅斯特湾(D)．暖色(红到黄)表示在成像系统中通常使用的阈值处的粒子数。蓝色表示较低的阈值，此时凝胶与相关的微生物群落和微弱的碎屑变得可见。采用较低的检测阈值，产生了截然不同的粒子数。粒子数持续增加，无肩带或截止，阈值下降，除了在阈值= 5时由于图像“变白”而突然下降(粒径bin仅为170 μm，(B, E)．这一分析表明，微弱的粒子(蓝色阴影)比通常探测到的粒子(暖色)多出数量级。使用中性密度滤波器，阈值可以转换为绝对衰减值，无论使用的仪器是什么(C、F)．C和F中的黑线分别对应阈值7和15。

低于一个定义的阈值(在我们的分析设置中为7)，由于二维投影中的粒子重叠，粒子数量似乎减少了。在更低的阈值5及以下时，粒子开始相互融合，呈现出更少、更大的粒子，本质上造成了“白化”。

为了根据吸光度校正灰度值，我们使用印在显微镜载玻片上的中性密度滤光片将灰度值转换为光密度(图1C、F)．例如，阈值7的灰色值转换为衰减值0.066 (图1 c)或0.045 (图1 f)，视相机而定。这意味着，要将像素作为粒子的一部分检测出来，至少需要分别阻挡(衰减)13%或10%的光。阈值15转化为衰减0.13(衰减26%，图1 c)或0.091(19%衰减，图1 f),分别。

尽管在不同的阈值水平上，数量与大小关系的回归的高度有所变化，但在阈值> 5处，一旦关系从“白化”中出现，坡度就相对保持不变。图1A、D)．光谱斜率与阈值水平的相对独立性表明，模糊粒子并不局限于最小的尺寸类别，而是在从43 μm到1.7 mm长度的整个尺寸范围内与密度更大的粒子成比例出现。这也许可以解释为什么许多不同的粒子分析方法的粒子谱斜率是相似的，尽管使用的技术非常不同。

在较低的阈值下，影图图像显示部分凝胶组分

在实验室实验中，我们创造了一系列化学添加物，选择性地改变了阳离子桥凝胶粒子的丰度。利用在超纯水中预水化的藻酸盐，按1)Ca^２＋2) EDTA螯合钙离子并重新溶解凝胶(图2)．颗粒丰度对钙离子和EDTA的混凝和溶解响应分别针对凝胶颗粒(Passow 2002；孟和刘，2016)，而不会发生在其他更固体的粒子上。使用与现场相同的图像分析技术，我们观察到在较低的阈值(Th = 7)下粒子数量的明显变化，而在较高的阈值(Th = 15)下大多数粒子仍然无法检测到(图2A、B)．阿利新蓝染色(Alldredge等人，1993年)证实了实验过程中凝胶的混凝和溶解顺序(图2 c)．钙的添加使过滤器上有一层厚厚的凝胶(图2 c)，而添加钙前和添加EDTA后，凝胶颗粒数均明显降低。在二值化的相机图像中检测到的凝胶总质量存在差异(图2 b)和阿利新蓝染色(图2 c)．然而，这种差异只是由于聚碳酸酯过滤器上的凝胶颗粒(孔径为0.4 μm)的保留率高于我们光学装置中颗粒的尺寸检测极限(像素分辨率为12.4 μm)。

图2

图2以褐藻酸盐作为水凝胶模型的实验室实验。UPW =超纯水(18.2 MΩ.cm)， + Alg = UPW中藻酸钠溶液。图像在时间序列中垂直堆放。(一)钙离子(+)的加入对凝胶的混凝和溶解动力学的影响^{+ 2}Ca)和EDTA (+ EDTA)分别只在较低阈值(Th = 7，蓝色)时可见，而在较高阈值(Th = 15，黑色)时不可见。在加入化学物质后，粒子数量立即出现短暂的下降，这是由于液体的不同渗透压引起的纹影效应使粒子暂时混淆(Davidhazy 2006）(B)实验过程中二值化的示例图像(Th仅为7)。(C)在这个序列中，实验中对水的子样品进行阿利新蓝染色，结果显示由于阳离子桥(由于钙的添加)，过滤器上形成了一层厚厚的凝胶层，并且在加入EDTA后溶解。

较低的阈值揭示了自然界中一些但不是所有的结构凝胶

为了证实在相同的原位设置下可以检测到像凝胶一样微弱的粒子，我们对已知含有凝胶状基质的三种天然粒子进行了分析:水螅质、阑尾状体和基于藻类渗出物的海洋雪。在所有三种粒子类型中，降低阈值增加了凝胶结构的细节，直到达到相机动态范围的极限(图3)．食物收集管和部分尾室出现在阑尾室(Flood等人，1990) (图3一)．部分非细胞的中胶膜(Tiemann等，2002)出现在水螅水母的柄状体和伞状体之间(图3 b)．在海洋雪中，连接大块粒子的基质开始出现在较低的阈值(图3 c)．然而，即使是在最低的阈值下，我们所知道的存在的结构仍然是看不见的(例如，触角缺失的部分，阑尾腔的大缓冲腔(Flood等人，1990)，或在这个例子的上半部分将海洋雪颗粒连接在一起的细黏液线)。

图3

图3使用阴影技术拍摄的里雅斯特湾的浮游生物和颗粒图像(注意，为了更好地对比较小的物体，图像是倒置的)。(一)海鞘(Oikopleura)在它的室内积极过滤，(B)水螅水母,(C)海洋雪颗粒。原始灰度图像(a1, b1, c1)在不同的阈值水平上进行二值化(Th)(a2, 3, 4, b2, 3, 4, c2, 3)．较高的阈值水平(Th = 70)使浮游生物和密度较大的颗粒从背景中分离出来，而较低的阈值则使模糊的颗粒和凝胶结构出现。即使在这里显示的最低实际阈值水平(a4, b4, c3)在美国，粒子没有被完全检测到。红色箭头:阑尾窝的食物管。绿色箭头:二值化中缺失的触手。蓝色箭头:黏液链连接海洋雪粒子的上下部分。通过优化图像算法，完美渲染浮游动物的形状，用于分类鉴定，大量的模糊粒子(a4, b4, c3)仍然失踪。

由于不可见的凝胶基质造成的物体不完整渲染是精确测量海洋雪粒子大小和形状的主要问题。在二值化之后，即使在Th=15这个相对较低的阈值，这个示例中的聚合也会注册为许多较小的(图4)．在这种情况或类似的情况下，一个潜在的——尽管计算成本很高——解决方案是应用算法，如基于密度的聚类(例如dbscan函数)，然后在这些聚类周围添加边界区域(例如边界函数，图4 b)．

图4

图4(一)非晶态海洋骨料阴影图的二值化(图3)在阈值= 15。部分粘膜基质在这一阈值未被检测到。(B)基于密度的空间聚类(Ester et al.， 1996)将相同的指标值赋给粒子(黑色)的组成部分，以便边界函数(红线)可以包围整个海洋雪粒子。通过这种方式，可以对碎片结构进行更精确的尺寸和形状确定。除黑色外的其他颜色表示定义更宽泛的粒子关联。

显而易见的是图3，在较低的阈值下，主要物体周围的大量粒子也变得可见(图3A4, B4, C3)．为了区分这些特征是代表真实的粒子还是噪声产生的模式，我们从马尾藻海和里雅斯特湾随机选择了10张阈值为7的二值化图像，并在5个窗口大小(3x3, 9x9, 15x15, 30x30, 300x300像素)下从每张图像中重新采样900 x 900像素区域，以计算森西塔分散指数(I_米) (Morisita 1962；Hurlbert 1990)．我的_米在生态学中广泛用于确定物种空间分布的聚类程度(克雷布斯,1999)．对象的随机分布结果是I_米为1。如果I_米小于1，则总体是不充分分散的(即，比随机分布更均匀)，如果I_米显著大于1，则种群过度分散(即聚集或斑块状)。我们利用这个原理来确定二值化后的图像像素是否聚类(即聚类的一部分)。我们在五个不同的尺度上重新采样，因为I_米可敏感计数方阵的大小和数量(阿马拉尔等人，2015；海耶斯和卡斯蒂略，2017年)．我的_米马尾藻海的3 × x3像素窗口的平均值为3.77 (SD = 0.677)， 300 × 300像素窗口的平均值为1.29 (SD = 0.551)，里雅斯特湾的3 × x3窗口的平均值为2.24 (SD = 0.277)， 300 × 300像素窗口的平均值为1.10 (SD = 0.018)。在所有情况下，分散指数显著不同于随机分布(即I_米= 1)使用卡方检验统计量(p<0.0001) (Hurlbert 1990)．在较低阈值处产生信号的电子噪声通常产生随机像素信号。I明显更高_米比预期的随机信号分布表明粒子聚集是通过噪声观察到的。这些聚合或集群在主要对象周围的图像部分中也清晰可见图3．

讨论

降低检测的阈值会导致更高的粒子丰度，但即使达到了光学设置的动态范围的极限，真实的粒子数也会被低估。粒子检测的阈值设置问题是众所周知的，在绘制仪器检测到的最小尺寸范围的精确尺寸分布和计算非球形粒子的等效球形直径(Costello等人，1994年)．鉴于不同仪器在粒子检测及图像分析算法上的操作差异(吉林等人，2020年；Markussen等人，2020年)，因此，即使在相同的环境中，文献中报告的粒子数差异很大也就不足为奇了。平台之间的标准化将使结果更具可比性(Picheral等，2010；隆巴德等人，2019年；吉林等人，2020年；尼利等人，2021年)，但问题不仅仅是各种光学系统的标准化和相互校准。正是由于在水体系中大量相互连接的三维外聚物纤维，使得它们在本质上难以准确列举(如果不是——正如我们的分析所暗示的那样——不可能的话)。Leppard等人，1996年；Verdugo等人，2004年；Wurl等，2011；Zamanillo等人，2019年)．透明的外聚物颗粒、外聚物物质、凝胶、较大的有机团聚体和絮凝体不仅限于海洋环境，在淡水系统中也大量存在(Grossart等人，1997年；Bar-Zeev等，2015；Shi等人，2021年；Walch等人，2022年)．因此，我们期望成像系统中粒子检测阈值的难题也能完全应用于淡水。相比之下，当计算气溶胶(气体介质中的悬浮粒子)时，粒子数可能就没有那么含糊不清了。Li等，2016)．

因为粒子数是阈值水平的函数，没有定义的截止，粒子数只能相对确定，而不能绝对确定。海洋颗粒——即使是在寡营养马尾藻海中——在颗粒的绝对数量达到之前，在图像中重叠(图1B、C)．这甚至发生在相对适中的3厘米的光程，这与其他相比是小的现场仪器(Cowen和Guigand, 2008；奥曼等人，2019年)．减少光学切片的厚度并不能消除这个问题;它只是把粒子丰度峰值移到较低的阈值。在本研究中，马尾藻海颗粒数随阈值水平降低的相对变化大于里雅斯特湾。这种向马尾藻海中较弱粒子倾斜的分布是由于背景浑浊度降低导致较弱粒子能够更突出，还是由于较弱粒子的比例更大，无法从我们的数据中确定。

用我们的仪器观察到的微弱的凝胶状颗粒只是冰山一角，还有更大的未被探测到的颗粒池形成了从颗粒到溶解相的连续体(Verdugo等人，2004年)．我们的相机只能捕捉到一小部分凝胶，这反映在实验室实验的结果中，藻酸盐在0.4 μm孔径过滤器上形成了一层厚厚的层，但只增加了少量较大颗粒的图像(图2)．使用孔径为0.2 μm和0.4 μm的聚碳酸酯过滤器，甚至使用有效孔径为0.2 μm至0.7 μm的GF/F玻璃纤维过滤器收集宏观凝胶和部分微凝胶(纳亚尔和周，2003年；Verdugo等人，2004年；Chaves等人，2021年)．由于在定义颗粒有机碳和氮时使用的是燃烧玻璃纤维过滤器，所以光学分析中不应排除凝胶，否则过多的碳将被错误地与光学密度更大的颗粒联系在一起。如我们这里所建议的，在光学分析中包含较弱的粒子(即使用较低的阈值)将减少将粒子图像转换为碳值的任何尝试中一个重要的源误差。

虽然影像术以外的成像系统可能没有相同的动态范围或灵敏度(例如，Markussen等人，2020年)，设定任意阈值的问题依然存在。在所有情况下，最终设定阈值的是相机的灵敏度，而不是图像分析算法。在反向或侧向散射配置中(戴维斯等人，2005年；Picheral等，2010)粒子检测的相关度量是散射，而且凝胶的后向散射特性也比色素颗粒或含有方解石的颗粒差(Collister等人，2020年)．小角前向散射特性对粒子的反射率和透明度以及粒子的几何形状(Boss等人，2009年)．因此，基于激光散射(如激光散射)的粒子分析现场散射和透射(list)，Boss等人，2018年)也会遇到类似的问题，即对高含量外聚物和折射率接近水的粒子的探测能力较差。因此，基于高散射参考材料(如乳胶或PVC球)的仪器校准可能不能准确反映光学密度较低和非球形的浮游生物和凝胶的数量。非光学系统如阻抗测量也受阈值设置的影响。例如，Coulter计数器不能检测凝胶，而最适合计算浮游植物细胞，特别是那些具有坚硬的球果的细胞，如硅藻或球石藻，这使得listst和Coulter计数器的数据非常一致(雷诺兹等人，2010)．

在较低的检测阈值下，阴影成像对由于密度变化引起的折射率不均匀所引起的纹影效应非常敏感(Davidhazy 2006)．这个问题之前在透射偏振和list数据中被发现，由于光散射增加，导致与斜斜相关的“粒子峰”(Bogucki等人，1998；Mikkelsen和Pejrup, 2001；风格,2006；Karageorgis等，2015)．在我们的现场数据分析中，我们避免了纹影模式的深度，这只在强碧斜中可以检测到。在实验室中，在加入凝胶或离子后，纹影的形成发生了短暂的时间(在这种情况下，效果是大量的小粒子被较大的纹影效应所混淆，图2)，但由于持续使用磁力搅拌器而迅速分散。如果使用较低的阈值来检测较弱的凝胶颗粒进行分析，则必须注意从图像分析中排除含有纹影的图像，或开发识别和排除单个图像中的纹影伪影的深度学习算法。

相机-影像分析配对的大部分设定都经过调整，以恢复浮游生物的足够细节，以便进行分类鉴定(戴维斯等人，2005年；Cowen和Guigand, 2008；Picheral等，2010；隆巴德等人，2019年；奥曼等人，2019年；吉拉德等人，2022年；Picheral等人，2022年)，然而，这些生物在光密度和散射值范围内处于较高的水平。通过调整阈值水平来优化浮游生物的可视化，光学系统对数量多得多的微弱粒子视而不见。一个困境的存在，因为当极低的阈值检测到更多的微弱粒子时，图像细节的丢失包含了分类识别的重要信息(图3)．为了解决这个二分法，每张图像至少需要两次扫描:一次是捕捉浮游生物，以更高的阈值产生高质量的片段;另一次是在最低的实际阈值，以更准确地枚举微弱的粒子。

如果能清楚地将两者区分开来，那么凝胶与更多固体颗粒的同时出现将不会妨碍精确的颗粒计数。然而，正如我们的研究显示的那样，在粒子数量和阈值之间的关系中没有明确的分界线或肩膀，也没有任何其他可靠的指标来明确区分凝胶和密度更大的粒子。重要的是，纯凝胶在水生环境中根本不存在;凝胶被微生物大量定植(例如，Busch等，2017)，以及比凝胶光学密度更高的颗粒(从粘土、浮游植物到粪便球)粘附在凝胶聚合物上。这总是会改变连续体中的整体光学特性，使得客观截止的定义难以处理。向较高阈值范围可能存在渐近线(图1B、E)，但我们强烈反对使用这种非包容性的度量，因为它的应用只列举了具有最高光衰减的稀有粒子。

海洋雪(>500 μm的大型无定形团聚体)是许多海洋省份的主要颗粒质量，如上升流系统和区域海(Alldredge和Silver, 1988年；Rinaldi等，1995；Jackson等人，1997；Trudnowska等人，2021年)，数量可能比同样大小的浮游生物要多(帕森斯和斯特里克兰德，1962年；Bochdansky等，2016)．泵、过滤器、浮游生物网和大孔径筛会破坏脆弱的海洋雪集料，这意味着大多数物理收集方法对海洋雪的采样严重不足(Trent等人，1978；Alldredge和Silver, 1988年；Bochdansky和Herndl, 1992；González-Quirós和Checkley, 2006)．正如我们在这里所展示的，海洋雪也是“光学脆弱的”，因为在图像分析的分割过程中发生了碎片化(Thuy等人，2017)．这个问题在高阈值设置时更加严重。因此，在物理和光学方法中，大的海洋雪粒子被错误地分类为许多更小的粒子(图4一)．边缘检测后填充对象的图像分析算法(吉林等人，2020年)通常无法描绘出这些无定形的聚集物，因为它们不像浮游生物，没有明确的轮廓。如果破碎在粒径谱中均匀地发生，较大颗粒的碎片被隔离到数量多得多的较小颗粒的垃圾箱中，则颗粒数量谱的整体斜率几乎不会受到影响。然而，在光谱中有许多特定的“凸起”的例子，由于特定的浮游生物大量繁殖，特别是由于在海面和深海中出现海洋雪的聚集，在某些大小的分量中数量偏高(罗德里格斯等人，2002；Iversen等人，2010；Bochdansky等，2016；Runyan等，2020)．如果光学碎片允许发生，这些粒子峰值可能在自动图像分析中变得不那么明显。重新捕捉这些较大颗粒的形状和大小的解决方案可能在于使用聚类算法来检测和更好地描述海洋雪颗粒的统计方法。基于密度的空间聚类(Ester et al.， 1996)，演示了海洋雪的例子图4 b，表明一旦聚类，边界多边形可以更好地勾画出本质上属于分形的粒子的空间范围(Kilps等人，1994年)．

分形维数的概念有两个方面的意义:首先，分形几何形状随粒子的孔隙率和密度的变化而变化(洛根和威尔金森，1990年；Azetsu-Scott和Johnson, 1992年；Khelifa和Hill, 2006年)，并随絮凝体大小的增加而改变，导致絮凝体的有效密度较低(Khelifa和Hill, 2006年)．其次，分形在类比上也与尺度问题有关。正如众所周知的海岸线悖论，当海岸线没有一个明确的长度(即，海岸线的长度与“测量棒”的长度直接相关)时，曼德布洛特,1967)，我们发现自己在这里面临一个类似的问题:每体积的粒子数是相机阈值设置的直接函数(即在本例中，刻度)，粒子数和阈值水平之间的依赖性跨越数量级(图1)．

不明确的粒子数对凝固理论的各种预测都有影响(杰克逊和伯德，1998年；少女,2013)．凝固过程高度依赖于每体积粒子的数量，通过最近邻距离对整体粒子质量和碰撞率有很大影响。透明外聚物颗粒(细胞外聚合物质的一个亚群)是聚集现象的关键(Mari等，2017)，但通常不会被传统的光学系统考虑，除非它们被特定的染料染色[例如阿利新蓝(Alldredge等人，1993年)、考马斯亮蓝(Long和Azam, 1996年)]。然而，正是这些粒子形成了粘合剂，将较大的粒子粘合在一起。这对垂直碳通量有重要的影响，因为聚集是产生大颗粒的重要因素，根据斯托克斯定律，在其他条件相同的情况下，大颗粒比小颗粒下沉得更快。

尽管一体积水中的绝对粒子数仍然难以捉摸，但在许多不同的阈值上，数量谱的斜率是相对保守的。随着阈值水平(从7到29)的增加，马尾藻海的负坡度有非常轻微但显著的变浅(线性回归，n= 12, F = 8.10, p=0.0157)，但在里雅斯特湾没有(线性回归，n= 12, F = 1.26, p=0.344)。粒子数量的坡度一般在-2至-5之间，大多数富营养化和沿海地区的坡度集中在-3至-3.5之间，而寡营养开放海洋系统的坡度则接近-4.5 (Guidi等，2009)．与这一概念一致，我们的马尾藻海数据的平均斜率为-4.12 (SD = 0.206, n =12)，这是这些开放海洋系统的特征。相比之下，里雅斯特湾数据的平均斜率较低，为-3.87 (SD = 0.258 n = 12)。粒子数斜率对分析灵敏度水平的独立性是令人放心的，并验证了使用这些斜率作为固有的水质量特征(斯坦曼等人，2008年；Guidi等，2009；Runyan等，2020；Chaikalis等，2021年)．

我们的研究表明，所有关于水系统中单位体积粒子数的文献报告都需要以极大的怀疑态度对待，因为无论采用何种方法，它们都不能代表“真实的”粒子数。为了使每体积粒子数的数据有用，它们必须附有一个精确的阈值信息，该阈值由特定的光学性质定义，如代表性校准对象的光密度、散射或反射率。虽然大多数实验室优化了对浮游生物的检测和分类的分析(暖色)图1)，较低阈值处的分析(蓝色阴影在图1)更适合于理解海洋粒子景观及其空间尺度上的异质性，这与航行的生物最相关(Azam和Long, 2001年；斯托克2012；Seymour等，2017)．

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。储库/储库的名称和登录号可以在下面找到:生物和化学海洋学数据管理办公室# occe -2128438。

作者的贡献

AB设计、建造和部署了摄像系统，分析数据，制作数据并撰写手稿。HH进行图像分析，分析数据，并进行实验室实验。MC领导了马尾藻海研究考察队，促进了相机的部署，提供了海洋学背景数据，并参与撰写了手稿。所有作者都对文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

本研究由美国国家科学基金会化学海洋学项目奖OCE 1829885支持海洋通量计划时间序列(MC)和美国国家科学基金会生物和化学海洋学项目奖OCE 1851368 (AB)和OCE 2128438 (AB)资助。

致谢

我们感谢大西洋探险者号的船员在部署摄像系统时提供的帮助，感谢老道明大学物理系的Charles Sukenik使用他们的光学台和设备，感谢caroline Bochdansky在潜水作业时提供的帮助。

利益冲突

作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

出版商的注意

本文中表达的所有主张仅代表作者的观点，并不代表其附属组织的观点，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

参考文献

王晓明，王晓明，王晓明(1993)。海洋中一类大的、透明的有机粒子的丰度和意义。深海研究部分海洋学家。人民行动党>,40岁,1131 - 1140。0967 - 0637 . doi: 10.1016 / (93) 90129 - q