病例报告:一个非综合征性听神经病变家族的临床和遗传分析

简介

听神经病变(AN)，由斯塔尔教授于1996年首次提出(1)，又称听觉神经病变谱系障碍，是一种由外部毛细胞功能正常、内部毛细胞、听觉神经突触和/或听觉神经本身功能障碍(2，3.)．AN的诊断标准为毛细胞功能正常、耳声发射和/或耳蜗微音电位诱发、听神经功能异常、听性脑干反应异常或缺失(2，4)．它也是导致婴儿和青少年听力和语言交流障碍的最常见疾病之一(4)，但其确切流行程度尚不清楚。Wang在2015年的一项研究显示，约0.16%的新生儿存在听觉神经功能异常，占儿童永久性听力损失的10% (5)．

确定AN的病因对指导患者选择治疗方法非常重要。2008年，在意大利科莫举行的国际新生儿听力筛查会议上，斯塔尔教授建议将AN细分为两种类型:AN和听觉突触病理学。前者仅累及听觉神经，内层毛细胞和突触正常;在后者中，内层毛细胞和/或突触受到影响，听觉神经是正常的(6)．然而，对耳咽炎和听觉突触病变的分类和诊断仍然很困难。此外，根据除听力损失外是否合并其他全身性疾病，可将患者细分为非综合征型和综合征型听神经病变。

随着高通量测序技术的发展，AN的遗传因素逐渐被揭示，基因检测已成为鉴别不同类型AN的日益重要的工具。约有20个基因已被确定与AN相关，包括与非综合征性AN相关的基因(OTOF、PJVK、DIAPH3、12S rRNA、GJB2、SLC19A2和SLC17A8)，以及与综合征性AN相关的基因(PMP22、MPZ、NF-L、NDRG1、GJB1、GJB3、OPA1、TMEM126A、FXN、TIMM8A、WFS1和AIFM1) (7)．

的OTOF基因(OMIM: 603681)位于人类2号染色体上，该染色体长约100 kb，包含48个外显子，是第一个与非综合征性AN相关的克隆基因(8)．研究表明，耳铁蛋白是由耳铁蛋白编码的OTOF基因在小鼠耳蜗内毛细胞中表达，该细胞是内毛细胞突触前结构的重要组成部分(8)．耳铁蛋白是一种钙传感器，以钙依赖的方式触发内层毛细胞带状突触神经递质的胞质作用(9)．因此，突触型和突触前型是最常见的患者OTOF基因突变，人工耳蜗植入术效果更好(10)．截至2019年10月，大约有200个版本OTOF基因已被纳入人类基因突变数据库(HGMD)。此外，尽管大多数OTOF变异为单一科所特有，部分群体存在变异热点;例如，c.2485C > T在西班牙人群中更常见(11)．

AN患者的比例明显由OTOF不同国家和地区的变体不同。王教授等人2016年的一项研究发现OTOF中国婴幼儿听力神经病患病率为41.2%(14/34)，远高于成人的5.5% (4/73)OTOF中国婴幼儿AN的主要致病基因(12)．

本研究调查了来自一个家庭的三名听力障碍患者，初步诊断为AN。对先证者进行基因测试，并在家庭成员中验证候选变体。我们发现了致病性/可能致病性变异OTOF基因负责家族中的AN，丰富了家族中的ANOTOF基因的突变谱。

例描述

主题

在这项研究中，我们描述了一个中国家庭的非综合征性耳聋，三个孩子受到影响。先证者(II-1)是一名9岁的女孩，是这个家庭的第一个孩子，分娩正常。她生长发育正常，但有先天性耳聋。她的妹妹和弟弟也是先天性失聪。父母健康，听力正常，非近亲婚姻。调查了该家族系的详细家族史和病史，系谱见图1．3例患者(II-1、II-2和II-3)进行了听力学检查，包括耳镜检查、中耳声透射率测量、耳畸变产物声发射(DPOAE)、ABR和多频听觉稳态反应(ASSR)。其他检查包括颞骨和颅骨的计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)，以排除颅内病变等。

本研究的实验方案经河南省儿童医院伦理委员会批准(批准号:;日期:2019-H-K16)，并符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。受试者自愿参与这项研究。在患者父母签署知情同意书后，抽取3名患者及其父母的外周血进行基因检测。

方法

外显子组测序

根据全血基因组DNA提取试剂盒(Thermo Scientific, usa)的手册，从5个家庭成员的外周血样本中提取基因组DNA。DNA浓度和纯度使用NanoDrop One (Thermo Scientific，美国)进行测量。使用超声波中断器(Bioruptor®Pico超声系统，Diagenode，美国)将DNA样本破碎至250 bp;使用Agilent 4200 TapeStation系统(Agilent Technologies Inc.，美国)对DNA片段进行质量控制。然后遵循Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies Inc.，美国)用于文库构建和基因外显子捕获的程序。结果文库使用Illumina HiSeq 4000平台(Illumina，美国)测序，对端150 bp。

生物信息学分析和变异解释

利用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)软件包(13)．单核苷酸多态性(SNPs)和Indels(插入和删除)的分析使用GATK(基因组分析工具包)HaplotypeCaller v. 4.1.2 (14)．使用变异效应预测软件(15)和多个注释数据库，包括ClinVar (16)、HGMD (17)、千人基因组计划(18)、外显子组聚合联盟数据库(ExAC) (19)、基因组聚合数据库(20.)，以及预测错义变量功能的数据库(21)．根据美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG) (22)和遗传听力损失的ACMG/AMP变异解释指南的专家规范(23)．

桑格测序

使用聚合酶链式反应(PCR)和Sanger测序在所有参与成员中验证了新一代测序测定所识别的变异。引物是使用NCBI引物- blast软件为三种变体中的每一种设计的表1)，由上海尚雅生物科技有限公司(中国)合成。PCR反应采用Taq 2× Master Mix试剂盒(上海诺孚蛋白科技有限公司)进行，扩增产物用2.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，然后用DNA产品纯化试剂盒(上海利丰生物科技有限公司)进行纯化。纯化的PCR产物然后使用Applied Biosystems测序仪(Applied Biosystems，美国)进行Sanger测序。

微基因实验

我们对c.4024-4G > T变体进行了功能分析在体外Minigene试验验证其对剪接的影响。将33外显子和部分侧翼内含子插入pcMINI载体构建微基因，该载体包含通用的ExonA-IntronA-MSC-IntronB-ExonB。转染细胞，观察ExonA-Exon33-ExonB的剪接模式是否异常。引物设计用于三轮PCR。在第一个PCR实验中，使用特异性引物OTOF-F1和OTOF-R1扩增基因组DNA。第二次PCR使用引物OTOF-F2和OTOF-R2扩增第一轮PCR产物。以第二次PCR的产物为模板，以MINI-OTOF-BamH1-F和MINI-OTOF-EcoR1-R为引物，进行第三轮PCR，获得该基因的野生型和突变型片段OTOF基因片段包含内含子32、外显子33和内含子33部分OTOF基因，引物序列见表1)．纯化最后一轮PCR产物，将野生型和突变型片段与pcMINI载体连接，得到pcMINI-wt和pcMINI-mut两个重组载体。根据脂质体说明书将重组载体瞬时转染293 T和HeLa细胞。36小时后，从每个细胞板中提取总RNA，进行RT-PCR。在琼脂糖电泳检测条带大小后，进行测序，并确定剪接模式异常。

结果

临床听力特征

3例患者(II-1、II-2、II-3)电耳镜检查双侧鼓膜均未见明显异常，颞骨CT平扫检查双侧外耳道壁、鼓膜、鼓室、听骨、内耳道均未见明显异常;MRI检查也未发现明显异常。先证者(II-1)通过双耳DPOAE测试，ABR测试显示双耳响应阈值>100 dB。因此，她被诊断为双耳极其严重的耳聋。多频ASSR测试还显示双耳极度严重的感音神经性听力损失(SNHL) (500-1K-2K-4KHz，左耳:90-110-100-90dBnHL;右耳:90- 110-无反应)，这与AN相关的听力学特征一致。3例患者除听力损失外无全身性疾病，结合临床表现及各项检查结果，均诊断为非综合征性AN。

whole-exome测序

对先证者进行全外显子组测序，获得13g原始数据。基础质量值≥30的比例(Q30)均大于90%。目标区域覆盖率大于99.5%。靶区平均测序深度为130 ~ 160×，超过98%的靶区测序深度高达20×。

生物信息学分析鉴定了三种变异(NM_194248.2) c.898-2A > G, c.3277G > A和c.4024-4G > TOTOF基因。变异c.3277G > A和c.4024-4G > T遗传自父亲，c.898-2A > G遗传自母亲表2)．Sanger测序显示先证者的姐妹和兄弟(II-2和II-3)都携带了三种变体，从而证实了三者的共分离OTOF家族中的表型变异(见图2)．

微基因实验

实时荧光定量PCR (RT-PCR)实验显示，HeLa和293 T细胞中的野生型(OTOF-wt)只有一条正常大小的条带(称为A条带)图3)，突变型(OTOF-mut)有两条条带，较小的条带与A条带大小相似，较大的条带被命名为B条带图3)．对两条条带进行测序，结果显示A条带为正常剪接，剪接模式为ExonA-Exon33 (67 bp)-ExonB, B条带为异常剪接，在插入载体中保留了所有完整的内含子;其剪接模式为ExonA-IntronA-Intron32 (709 bp)-Exon33 (67 bp)-Intron33 (345 bp)-IntronB-ExonB。突变型中内含子保留更明显，尽管存在与野生型剪接模式一致的a带;在野生型小基因中，完全没有保留内含子的B带，因此小基因实验的结果表明c.4024-4G > T变体引起了50%的异常剪接。

变异的解释

变异c.4024-4G > T遗传自患者的父亲，在1000基因组计划和gnomAD的正常人群数据库中没有发现，允许使用pm2_作为支持证据。的在体外minigene实验表明c.4024-4G > T变体影响剪接，允许使用PS3_Moderate证据。在家族中该变体的反转录中检测到一个致病性突变，允许使用PM3证据。Sanger测序证实该变异与家族中的表型共分离，允许使用PP1_Moderate证据。根据ACMG遗传变异解释指南，c.4024-4G > T变异可能被归类为致病性(22)．

错义变体c.3277G > A也遗传自患者的父亲，在1000基因组计划和gnomAD的正常人群数据库中频率非常低，允许使用pm2_作为支持证据。在经父母验证的家庭中，这种错义变体的反转录中检测到一个致病性突变，允许使用PM3证据。家族中所有三名AN患者都携带该变异，因此该变异与家族中的表型共分离，允许使用PP1_Moderate证据。多行计算证据支持对基因或基因产物的有害影响，允许使用PP3证据。根据ACMG指南，c.3277G > A变异可能被归类为致病性(22)．

变异c.898-2A > T遗传自患者的母亲。1000基因组计划和gnomAD的变异频率为0，允许使用pm2_作为支持证据。该变异在ClinGen中具有明确的基因疾病有效性，在ClinGen中为零变异(典型-2剪接位点)OTOF基因，其中LOF是一种已知的疾病机制，允许使用PVS1证据。该变异与家族中的表型共分离，允许使用PP1_Moderate证据。根据ACMG指南，c.898-2A > G变体可被归类为致病性(22)．

讨论

在本研究中，三种杂合变异的OTOF三名患者均检测到c.3277G > A (p. glu1093lys)和c.4024-4G > T来自父型，c.898-2A > G来自母型。父母均为无听力障碍的杂合携带者。来自母株的变异c.898-2A > G是一个规范-2剪接变异。在本研究和之前的一项研究(24)，这表明它们可能构成了一种致病单倍型。在Thorpe等人的研究中，作者认为这两种变异都是因果关系。为了确定c.4024-4G > T对剪接的影响，我们构建了小基因载体，并在细胞水平上进行了RT-PCR。结果表明，变异c.4024-4G > T导致了50%的异常剪接。这三种变异与家族成员的听力损失表型共分离，并根据ACMG标准和遗传变异分类指南进行解释，其中c.898-2A > G为致病性，c.3277G > A和c.4024-4G > T为可能致病性。这表明这三种变异可能参与了该家族疾病的发病机制。

AN是一种由遗传异常引起的听觉障碍，除影响听力外，还影响语言理解，是遗传性耳聋的重要类型。有很多基因可以导致这种疾病OTOF是最重要的(25)．已经进行了大量的研究来探索OTOF在UniProt和ClinVar中共报道了455个该基因的分类变异，其中64个被归类为致病/可能致病，212个被归类为临床意义未知。在64个致病/可能致病变异中，约42%为错义突变，约20%为无义突变，约19%为移码突变。AN是一种由多发性硬化症引起的异质性疾病OTOF基因、it、人工耳蜗植入术的效果因患者而异(26)．一些研究报道，对于具有特定基因突变的患者，人工耳蜗植入术的结果是可预测的(27)，因此遗传诊断对临床管理具有重要意义。

一项研究对大量导致耳聋的遗传变异进行了基因测序分析，以确定相关听力损失的频率以及精确的遗传和临床背景。Iwasa等对来自日本53个耳鼻喉科的2265例常染色体隐性遗传SNHL患者进行了基因检测。在这些患者中，39例携带纯合或复合杂合变异体OTOF基因，约占病例的1.72%。其中32例为永久性听力损失，7例为重度听力损失，1例为轻度听力损失。双等位位点的患者OTOF基因变异导致严重或永久性听力损失(28)．该研究还表明，患有OTOF致病变异将是人工耳蜗植入的良好候选者;因此,检测OTOF致病性对ANSD患者非常有益。

结论

总之，我们鉴定了3个杂合变异OTOF基因c.898-2A > G, c.3277G > A和c.4024-4G > T是3例AN患者的遗传原因，使用下一代测序和Sanger测序。最后两个变体在本研究和以前的研究中均为顺式，它们可能构成一种致病单倍型。有足够的证据将c.3277G > A归类为符合ACMG指南的可能致病性变异。Minigene实验技术表明内含子变体c.4024-4G > T影响了约50%的剪接并导致内含子保留，这可能进一步促进了致病性。新变异的发现丰富了基因突变谱OTOF为AN的遗传诊断提供了新的参考。

数据可用性声明

本研究中提出的原始贡献已包含在文章/补充材料中，进一步查询可向通讯作者咨询。

道德声明

受试者为受试者的研究由河南省儿童医院伦理委员会(2019-H-K16)审查并批准。参与本研究的书面知情同意书由参与者的法定监护人/近亲提供。

作者的贡献

研究构想与设计:YX;数据采集:LJ;数据分析与解释:DL;统计分析:SZ;稿件撰写:LJ;对知识分子内容的手稿的批判性修订:YX。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

致谢

我们要感谢所有工作人员在研究中的辛勤和奉献。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

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参考文献