一项联合转录调节网络和蛋白质活性推断分析确定了胆源性闭锁临床相关的主要调节因子
Panpan太阳
Manhuan肖1、2，
旭扬风
振华罗- 1中山大学附属第一医院儿科外科，中国广州
- 2中山大学第一附属医院精准医学研究所，中国广州
胆道闭锁(BA)是一种严重的新生儿胆管疾病。转录因子(Transcription factors, TFs)是BA发病机制中的一类主要调控因子。然而，tf的整体观点及其与临床表现的联系仍有待探索。在这里，我们进行了联合转录调节网络和蛋白活性推断分析，以研究BA中的转录因子活性。通过整合三个独立的人类BA肝脏转录组数据集，我们确定了22个常见的主调控因子，其中14个是激活的，8个是抑制的。激活的tf的基因靶点在SMAD、NF-kappaB和TGF-beta的生物过程中富集，而抑制的tf的基因靶点与脂质代谢有关。通过挖掘tf的临床相关性，我们确定了与炎症、纤维化和生存相关的tf。特别是，ZNF14可预测生存不良和晚期活纤维化。支持这一观察结果的是，ZNF14与T辅助细胞、胆管细胞和肝星状细胞呈正相关。总之，我们的分析揭示了BA的关键临床相关主调控因子。
简介
胆道闭锁(BA)是一种新生儿发病的梗阻性胆管疾病。虽然巴氏综合症的发病率相对较低(每5000至14000活产婴儿中有1例)(1- - - - - -3.)，它仍然是世界范围内儿童肝移植的主要适应证。BA的主要治疗方法是被称为Kasai portal - enterostomy (KPE)的手术干预。然而，KPE的疗效有限，超过一半的BA患者在KPE后需要肝移植。因此，开发BA的治疗方法对于阻断疾病进展和提高患者生存率至关重要。
BA的病因是多因素的。如遗传易感性等产前损害。ADD3基因变异(4- - - - - -6)]，病毒感染[例如，巨细胞病毒(7，8)、轮状病毒(9- - - - - -11)]或毒素[例如，胆素酮(12，13)]使免疫系统参与，从而诱导一种不可控的和放大的先天和适应性免疫反应，表现为免疫细胞浸润、肌成纤维细胞活化、胆管闭锁和肝纤维化(14，15)．
在促成BA的基因中，包括FOXA2 (16)， hnf1b (17)， sox17 (18)及ARF6 (19)，表明转录因子是BA的关键调控因子。例如，SOX17的异常表达与小鼠肝外胆管发育缺陷和人类BA患者胆管周围腺异常有关(18)．转录因子是疾病的主要调节因子，可调节疾病的进展通过下游的几个转录靶点，形成一个转录网络。因此，有必要全面揭示疾病特异性tf及其靶标网络，以了解BA的全球格局，并制定有针对性的治疗策略(20.，21)．最近对人类BA的肝脏转录组分析为深入探索这一问题提供了机会。
从转录组数据中重建转录网络的方法已被开发出来(22- - - - - -25)．其中，精确蜂窝网络重建算法(ARACNe)因其较高的精度(26)．ARACNe通过估计转录因子与其靶标之间的相互信息来逆向工程转录网络。尽管ARACNe准确率很高，但由于它没有考虑疾病与正常对照之间的差异表达基因，因此可能无法识别疾病特异性tf和转录网络。通过富集调控分析(VIPER)对蛋白质活性的虚拟推断解决了这一挑战，通过分析疾病和正常对照之间TF的整个靶标(统称为TF调控)的表达，考虑到TF的作用模式，从而推断TF的蛋白质活性(27)．ARACNe和VIPER的出现使我们能够识别BA特异性tf及其下游信号。
在这项研究中，通过对人类BA肝脏转录组(RNA测序或微阵列)的三个数据集进行ARACNe和VIPER联合分析，我们确定了14个激活和8个抑制BA的转录因子(或主调控因子)。激活的tf靶基因在SMAD、NF-kB和TGF-中富集β途径，而抑制的tf调节基因与脂质代谢有关。为了探索tf的临床相关性，我们确定了与炎症、纤维化和生存相关的tf，其中ZNF14可预测晚期肝纤维化和生存不良。最后，我们寻找ZNF14与细胞浸润之间的关系，发现ZNF14与T辅助细胞、胆管细胞和HSC呈正相关。
材料与方法
样品描述
我们策划了三个肝脏转录组数据集(登录号:GSE122340, GSE46960和GSE15235)从基因表达综合(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．数据集I (GSE122340)包含121个BA病例和7个对照，其中单端RNA-seq数据是在Illumina HiSeq 2500上生成的。数据集II (GSE46960)包含64个BA病例和7个对照，其中微阵列数据是在GeneChip®Human Gene 1.0 ST Array上生成的。数据集III (GSE15235)包含47个BA病例，其中微阵列数据是在Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array上生成的。数据集III包含BA患者的临床信息，用于转录因子的临床分析。
转录网络重建
ARACNe (26)，一种用于推断转录相互作用的信息论算法，用于识别数据集I、数据集II和数据集III中注释到基因的转录本的候选转录调控因子。首先，利用高斯核估计器，通过成对MI, MI (x, y)计算候选TF (x)与其潜在目标(y)之间的相互作用。基于统计独立性的零假设，MI应用了一个阈值(P< 0.05, bonferroni校正测试对数)。其次，通过使用数据处理不等式(DPI) (MI的一个属性)去除间接交互来修整所构造的网络。因此，对于每个(x, y)对，考虑通过另一个TF (z)的路径，并且删除与以下约束相关的每个路径:MI (x, y) < min [MI (x, z)， MI (z, y)]。一个P值阈值为1 × 10−8，使用DPI = 0.1[如推荐的(28)]在运行ARACNe时使用。
虚蛋白活性分析
利用VIPER (27)(丰富规则分析的蛋白质活性虚拟推断)算法在数据集I和数据集II。[值得注意的是，数据集III不能用于估计蛋白质活性，因为它不提供正常对照(NC)]。首先，通过比较两组具有不同表型的样本，如本研究中的BA和NC样本，获得基因表达特征。在接下来的步骤中，可以使用基于分析秩的富集分析计算基因表达签名上的规则富集(29)．最后，显著值(P值和归一化富集分数)通过将每个规则富集分数与通过随机均匀排列样本1000次生成的空模型进行比较来计算。VIPER的输出是一个高度活跃的MRs列表，以及他们的活动分数和他们的浓缩P值。有关VIPER的进一步资料，可浏览以下网页(27)．富集MRsP虚蛋白活性分析< 0.05为BA的代表性MRs。来自数据集I和数据集II的常见MRsP< 0.05者选择MRs (图2一个)．
功能富集分析
所选MRs的生物过程(BP)通路富集分析和所选MRs的基因靶点使用ToppFun (https://toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp；转录组、本体论、表型、蛋白质组和基于药物组注释的基因列表功能富集分析，ToppFun)。每个类别的最大基因数设置为2000个，最小基因数设置为5个。采用Bonferroni-Hochberg多重试验调整富集产量。FDR显著性阈值设置为0.05。
肝病理、生存率与tf表达的相关性
数据集III中匹配的肝脏分级和患者生存期来自之前的一项研究(30.)．简而言之，通过苏木精/伊红染色评估炎症等级。根据苏木精/伊红染色，无炎症被认为是0级，而>50%的门静脉扩张和炎症被认为是3级。用格摩拉三色染色评价纤维化分级，无纤维化为0期，>50%门静脉束或再生结节扩张桥接的门脉纤维化为3期。相关分析包括炎症/纤维化分级。我们在数据集III中使用Pearson相关来评估tf基因表达与炎症/纤维化分级之间的相关性P值小于0.05被认为是显著的。
生存时间采用对数正态分布模型。Cox回归模型被提出来描述所选MRs对肝脏原生生存时间的影响。cox回归使用R包，生存率(31)．
免疫细胞、胆管细胞、门脉成纤维细胞、肝星状细胞浸润与MRs蛋白活性的关系
基于细胞类型特异性标记，采用GSVA R包单样本基因集富集分析(ssGSEA)估计免疫细胞、胆管细胞、门脉成纤维细胞、肝星状细胞的丰度。通过Pearson相关分析估计浸润免疫细胞评分与所选MRs蛋白活性之间的相关性。
结果
肝脏转录组的转录调节网络和蛋白活性推断分析确定了14个激活的BA主调控因子和8个抑制的BA主调控因子
为了全面了解BA的特异性主调控因子及其转录调控网络，我们首先从分析人类BA的肝脏转录组开始，建立了一个分析管道(图1)．我们从GEO数据库中纳入了3个人类BA的肝脏转录组数据集，其中数据集I (GSE122340)包含121名BA患者和7名正常对照的肝脏RNA测序，数据集II (GSE46960)包含64名BA患者和7名正常对照的肝脏微阵列，数据集III (GSE15235)提供47名BA患者的肝脏微阵列及其临床信息(肝脏病理和KPE后的生存)。为了获得高置信度的主调控因子及其下游网络，我们使用数据集I和II对转录调控因子网络进行反褶积，并估计主调控因子的蛋白活性，使用数据集III对主调控因子进行临床关联分析(图1)．
图1．本研究中使用的系统生物学分析管道的概述。
ARACNe对数据集I和II的转录调节网络进行反褶积，分别识别出1404和1580个tf (图1)．ARACNe首先通过测量相互信息来识别基因-基因共同调节模式，然后通过去除间接关系来进行网络修剪。我们在数据集I中鉴定了1404个tf，其中对应的网络包含16,646个靶点和249,801个转录相互作用(补充表S1)．对于数据集II，我们在构建的网络中观察到1,580个tf及其调控靶点，包括21,189个靶点和227,305个预测相互作用(补充表S2)．利用重建的转录网络，我们接下来通过一种名为VIPER的专用概率算法，通过考虑BA和正常对照之间的下游调控规则的表达模式，对tf进行了虚拟蛋白活性分析。VIPER利用了TFs的作用模式，TFs-靶基因相互作用的可信度，以及靶调控的多效性特征。我们将转录网络输入到VIPER中，以检测tf是否在下游靶基因的调控中具有重要作用。VIPER输出一个按调整后的活动排序的tf的简短列表P价值及其潜在的调节一大批目标(补充表S3)．结果，在具有高度显著性VIPER的tf中P值，我们只取调整过的值P这一过程导致数据集I中的潜在MRs值为107 (补充表S4)和213个潜在的MRs (补充表S5)．由于缺少NC，我们没有在数据集III中进行虚拟蛋白活性分析。因此，数据集I和数据集II之间共有22个tf (图2一个)．这22个tf在两个数据集中均显著(P< 0.05)。在这22个tf中，BA组有14个tf上调，而与NC组相比有8个tf下调(图2 b, C)．我们将上调的tf定义为激活的tf，而下调的tf定义为抑制的tf。接下来，我们着手研究与这些tf相关的下游信号转导和临床。
图2．22个常见的tf调节数据集I和数据集II中的活动。（一个)维恩图显示了数据集I和数据集II之间的22个常见tf。（B)胆道闭锁之间的RNA表达谱(BA，数据集I，n= 121;数据集二世,n= 64)和正常肝脏(NC，数据集I，n= 7;数据集二世,n= 7)通过调控分析评估其转录网络活性。最具差异活性的14个tfs调控因子被标记为红框，差异抑制的8个tfs调控因子被标记为蓝框。（C)小提琴图展示了BA之间14种激活的tf蛋白活性的差异(数据集I，n= 121;数据集二世,n= 64)和NC(数据集I，n= 7;数据集二世,n= 7)。（D)小提琴图显示BA之间8种被抑制的tf蛋白活性的差异(数据集I，n= 121;数据集二世,n= 64)和NC(数据集I，n= 7;数据集二世,n= 7)。
生物过程分析表明，SMAD、NF-kappaB和tgf - β信号通路对激活MRs的靶点和对抑制MRs的靶点的代谢富集
为了获得这22个tf的下游机制，我们开始使用ToppGene进行生物过程分析。22种tf的富集生物过程的完整列表在补充表S6．正如预期的那样，这22个tf的前10个富集生物过程与转录和RNA代谢有关(图3一)．此外，我们观察了其他生物过程，如大分子生物合成(细胞生物合成过程的负调控)，免疫相关途径(CD4−阳性的负调控，α - β T细胞分化，α - β T细胞分化的负调控)，发育/纤维化(途径受限的SMAD蛋白磷酸化的负调控，参与乳腺导管形态发生的分支)(图3一)．这一初步结果提示BA富集的tf可能与代谢、免疫应答、发育和纤维化有关。
图3．22种常见tf及其靶标富集分析。（一个) 22种常见tf的生物过程通路。途径项根据其−log10 (p值)值。点的大小与基因数量成正比。（B) 14个激活tf(数据集I，数据集II，数据集III)的目标的前10个生物过程通路。所有的目标和通路在三个数据集中都是相同的。途径项根据其−log10 (p值)值。点的大小与基因数量成正比。（C) 8个被抑制的tf(数据集I，数据集II，数据集III)靶点的前10个生物过程通路。所有靶点和通路在三个数据集中都是相同的。途径项根据其−log10 (p值)值。点的大小与基因数量成正比。
为了进一步探测下游信号，我们输入了14个激活tf的整个靶标列表进行生物过程分析。我们揭示了一些免疫和纤维化过程，包括SMAD蛋白复合物组装，NIK/NF−kappaB信号的调节，对转化生长因子β的反应，都被富集(图3 b)．这与BA激活免疫反应和肝纤维化相一致，证实激活的tf是主调控因子。相比之下，8个被抑制的tf靶的富集过程主要与代谢有关(图3 c)．结果表明，BA中免疫和纤维化调节tf被激活，而代谢调节tf被抑制。这也与之前的一些观察结果相一致，与正常相比，BA表现出丰富的免疫浸润，晚期肝纤维化和肝脏代谢降低(14，32- - - - - -35)．
ZNF14与晚期纤维化和生存率差有关
在确定了tf和生物过程之间的联系后，我们接下来试图研究它们如何与临床表现联系起来。我们使用数据集III，因为它提供了47例BA患者的全面临床数据(肝脏炎症和纤维化评分和生存时间)。22种tf的表达与临床资料的Pearson相关分析显示，只有ZHX3与炎症呈正相关(图4一)．活化的TFs ZNF14和ZNF512与晚期肝纤维化呈正相关(图4 b)．生存分析(cox回归)结果显示，只有ZNF14可预测生存不良。综上所述，我们得出结论，ZNF14，一种与较差临床结果相关的激活tf，是BA的关键MR。
图4．BA中TFs表达与肝脏病理/患者生存的相关性分析。（一个) BA肝TFs表达与肝脏炎症程度的关系。根据相关强度(−1 < r < 1)对tf进行排序。点的大小和线的长度代表了相关性的强度。颜色代表p价值。（B) BA肝TFs表达与肝纤维化分级的关系。根据相关强度(−1 < r < 1)对tf进行排序。点的大小和线的长度代表了相关性的强度。颜色代表p价值。（C患者生存的Cox回归。tf按log2(HR)进行排序。点大小和线长与log2 (HR)相关。颜色代表p价值。
ZNF14预测T辅助细胞、胆管细胞和肝星状细胞的肝脏浸润
最近的研究表明，晚期肝纤维化和生存不良与免疫细胞、胆管细胞和肝星状细胞的浸润有关(36)．应用ssGSEA访问数据集I和数据集II中的免疫细胞/ hsc /PF/胆管细胞浸润。该分析揭示了几个与细胞浸润相关的tf。T辅助细胞与ZIK1、ZNF880、ZNF14、ZNF512、ETV1、XBP1蛋白活性分别呈正相关(P< 0.05,补充图S1A,C)．胆管细胞与ZNF660、ETV4、ZNF711、SMAD7、ZFP28、ZNF14、ZNF512、ETV1、ZHX3蛋白活性分别呈正相关，与MBD4呈负相关(P< 0.05,补充图S1B,D)．HSC与GPBP1、ZNF526、ETV4、ZNF880、ZNF14、ETV1、XBP1蛋白活性分别呈正相关，与ATF5 (P< 0.05,补充图S1B,D)．在检测的细胞类型中，相关分析结果显示，在数据集I和II中，ZNF14蛋白活性与T辅助细胞、胆管细胞和HSC细胞呈正相关(图5 a, B)．
图5．tf调控活性与单样本基因集富集分析(ssGSEA)得分的相关性分析。（一个) ZNF14调控活性与T辅助细胞/胆总管细胞/HSC ssGSEA评分之间的线性回归分析(数据集I)。B) ZNF14调控活性与T辅助细胞/胆总管细胞/HSC ssGSEA评分之间的线性回归分析(数据集II)。
讨论
像其他复杂疾病一样，BA由多种因素引起(14)．理解主调控因子生物学意义的一个主要挑战是确认ba相关肝胆组织中的核心基因网络。在本研究中，为了揭示可能对BA发病机制有贡献的主要调控因子，我们使用了一种方法在两个数据集(I和II)上组装BA肝脏特异性转录调控网络P< 0.05。在数据集III中，已识别的MRs在转录谱中的存在进一步加强了它们的可信度，并通过肝脏病理和患者生存的临床验证。
22种tf的生物学过程与22种tf的基因靶点的生物学过程基本相似。TFs的前20个BP通路富集于发育、基因转录、免疫相关通路、脂质代谢。活化tf基因靶点的生物学过程与发育、基因转录、免疫相关途径有关。特别是，对于免疫和纤维化相关过程，它们包括NF-KB信号通路的调控、SMAD蛋白复合物组装、细胞对转化生长因子β刺激的反应、对转化生长因子β的反应。这些免疫相关过程可能是BA的关键因素。许多研究表明，这些活动参与了BA的发展。例如，SMAD激活被认为是TGF-的一个特征性特征β信号传导途径(37- - - - - -40)．NF -κB是抗病毒先天免疫反应中各种炎症基因表达的关键分子，被认为与BA的发病机制有关(41- - - - - -43)．而被抑制的tf的基因靶点在BP通路中富集(前10位)，大多与脂类代谢有关，包括中性脂类生物合成过程、甘油三酯生物合成过程、酰甘油生物合成过程。在BA中，被抑制的tf及其靶蛋白均被下调，提示被抑制的tf可促进脂质代谢。由于BA患儿营养不良的风险较高，这一数据表明，抑制tf的减少可能会导致BA的恶化。
寻找22个tf的临床相关性，我们发现ZNF14与晚期纤维化和生存差相关。其蛋白活性与T辅助细胞、HSC和胆管细胞浸润呈正相关。支持这一观察结果的是，人类蛋白质图谱数据库中肝脏单细胞RNAseq数据中，ZNF14主要表达于T细胞、肝星状细胞、内皮细胞和红系细胞。ZNF14的相关通路包括基因表达(转录)和验证的核雌激素受体β网络。ZNF14的基因靶点主要富集在与基因转录/翻译(mRNA splicin - major Pathway)、细胞周期(细胞周期调控、细胞周期过程)、免疫相关通路(先天免疫系统、宏自噬、补体级联调控、应激反应调控)、亚态代谢(过氧化物体脂质代谢、维生素及辅助因子代谢、花生四烯酸代谢)相关的BP通路(补充表S7)．细胞周期通路可能与胆管细胞丰度相关，而免疫调节活动可能参与招募T辅助细胞并促进HSC的产生。因此，我们研究中的多条证据表明，ZNF14可能调节胆道增殖和胆管发育。尽管如上所述，ZNF14的调控可能对BA产生影响，但未来还需要进一步的实验验证来阐明ZNF14在BA中的作用。
除ZNF14外，其他tf表明有其他基因网络有助于BA。在这些已确定的tf中，SMAD7和HMGB1是两个有趣的因子。SMAD7在细胞核内与E3泛素连接酶SMURF2结合，结合复合物移位至细胞质，其中TGF-β1型受体与SMAD7相互作用，然后它们都降解。其相关BP通路有:RNA聚合酶II调控转录、转化生长因子受体信号通路、上皮细胞向间充质细胞转变的负向调控、BMP信号通路、细胞-细胞粘附的正向调控(补充表S8)．SMAD7的基因靶点富集在细胞对生长因子刺激的反应、超分子纤维组织的调节、底物黏附依赖的细胞扩散、肌动蛋白丝为基础的过程(补充表S9)．这些通路与BA密切相关。HMGB1已被报道与BA的发病有关(44- - - - - -46)．激活HMGB1基因的BP通路与RNA聚合酶II转录负调控、抗原刺激的炎症反应和免疫系统过程相关(补充表S10)．在我们的HMGB1反卷积基因网络中，其预测的靶点绝大多数富集于与表皮生长因子刺激的细胞反应、转化生长因子beta1的正向调控、免疫系统发育(补充表S11)．上述信号通路已被证明在BA (44- - - - - -46)．
一些tf，如FOXA2、SOX17已被报道为BA的危险因素。然而，这些tf在本研究中未达到显著性(补充表S12)．一种可能是这些tf表达的动态变化。这些tf可能在BA的早期阶段起作用，其表达随着疾病的进展发生显著变化。用于基因表达研究的肝脏样本不太可能在早期阶段使用。因此，本研究可能无法捕获先前报道的tf。
结论
总之，利用基于生物信息学和临床数据的三个数据集，我们确定了与BA相关的22个重要的主调控因子。其中，ZNF14可能是BA发病的关键因素。
数据可用性声明
该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中补充材料，如有任何查询，可向通讯作者查询。
作者的贡献
ZL和XF构思并设计了这项研究。PS进行数据分析并撰写稿件。ZL、XF、HJ、HC、ZZ对稿件进行了审阅和修改。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
资金
本研究得到国家自然科学基金项目(82001589、92168108)和广东省基础与应用基础研究基金项目(2019A1515110832)的资助，XF获得国家自然科学基金项目(31900521、81971305)的资助。
致谢
我们衷心感谢在研究中记录婴儿临床数据的护理人员。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
补充材料
本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fped.2022.1050326/full#supplementary-material．
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关键词:小儿，胆管病，反褶积，转录因子，网络
引用:孙鹏，肖敏，陈宏，钟泽，姜辉，冯霞，罗震(2022)通过联合转录调控网络和蛋白活性推断分析，确定了胆道闭锁临床相关的主调控因子。前面。Pediatr。10:1050326。doi: 10.3389 / fped.2022.1050326
收到:2022年9月21日;接受:2022年10月26日;
发表:2022年11月11日。
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＊通讯作者:罗振华luozhh35@mail.sysu.edu.cn香港江jiangh38@mail.sysu.edu.cn旭扬风fengxy58@mail.sysu.edu.cn
专业:这篇文章已提交给儿科前沿杂志的儿科胃肠病学、肝病学和营养学