原创研究文章

前面。精神病学，2022年11月15日
第二节情绪障碍
https://doi.org/10.3389/fpsyt.2022.1002828

血清中乙酰左旋肉碱在代谢组学方法诊断重度抑郁症及缓解状态的发现和验证

Seungyeon李¹，

苍井空妈妈²，

You-Rim李¹，

Hyebin崔^3.，

Eun-Jeong Joo^4、5，

Hee-Gyoo康 ^{1、2 *}而且

Jiyeong李 ^{2 *}

¹韩国京畿道乙支大学研究生院老年保健系
²乙支大学健康科学学院生物医学实验室科学系，京畿道，韩国
^3.韩国首尔，高丽大学安岩医院检验医学科
⁴乙支大学医学院神经精神科，韩国大田
⁵韩国京畿道乙支大学议政府乙支医疗中心精神科

重度抑郁症(MDD)是伴随心理生理和情绪变化的最常见的精神疾病之一。然而，MDD基于病理生理学的疾病机制尚未完全了解，诊断也是通过与临床医生和患者的访谈进行的。MDD的诊断和治疗由于缺乏潜在的病理生理机制的生物标志物而受到限制。尽管人们已经做出了各种尝试，以发现MDD诊断和治疗反应的代谢物生物标志物，但样本量和结果一致性的问题限制了临床应用。此外，据报道，未来的生物标志物研究必须考虑抗抑郁药的暴露，这是抑郁症亚组异质性的主要原因。因此，本研究的目的是发现和验证用于抑郁症诊断的生物标志物，考虑到药物治疗的暴露，包括抗抑郁药物，这有助于MDD亚组的异质性。在生物标志物发现和验证集中，疾病组由暴露于药物治疗和未暴露于药物治疗的患者组成，包括用于治疗MDD的抗抑郁药物。使用质谱分析MDD患者和对照组之间的血清代谢物差异。包括缓解组在内的验证集用于验证其作为抑郁症诊断和缓解状态确定的生物标志物的有效性。通过MDD患者组和对照组之间的血清代谢物分析，两组之间存在不同的代谢物。 Finally, Acetylcarnitine was selected as a biomarker. In validation, acetylcarnitine was significantly decreased in MDD and was distinguished from remission status. This study confirmed that the discovered acetylcarnitine has potential as a biomarker for diagnosing depression and determining remission status, regardless of exposure to drug treatment including antidepressants.

简介

重度抑郁症(MDD)是最常见的精神疾病之一，其特征是明显的情绪波动，表现为悲伤或易怒，以及持续至少两周的心理生理变化，如睡眠、食欲和性欲障碍(1)．重度抑郁症在世界范围内的患病率为17%，并被证实与代谢变化有关，如心血管疾病和代谢综合征(2)．MDD的病理生理学诊断和治疗尚不完全清楚，与缺乏明显的MDD生物标志物有关(3.)．迄今为止，还没有一种测试可以可靠地诊断重度抑郁症，而基于临床医生和患者的主观访谈的汉密尔顿抑郁评分量表(HAMD)和贝克抑郁量表(BDI)等测试已被用于参考(4)．MDD缺乏以病理生理学为基础的生物标志物，限制了其准确的诊断和治疗(5)．基于生物分子机制的生物标志物可用于重度抑郁症的诊断、预后和治疗，有助于提供一种客观的诊断方法，而不是基于主观评价的诊断方法。

代谢组学是研究称为代谢物的小分子(高达1.5 kDa)。由于代谢物是转录和翻译的最终下游产物，它们最接近表型(6)，在很大程度上反映了环境影响、营养需求、异种生物制剂和药物的作用、压力以及生化途径的各种病理或内部变化(7，8)．由于这些代谢物在生物系统中的重要性，代谢物分析越来越多地应用于各个研究领域，因为它可以通过改变代谢途径来提高对许多病理过程的理解(9，10)．非靶向代谢组学技术能够在不事先了解代谢产物的情况下，对组织或体液样本中直接参与生化活动的所有代谢物进行无偏分析和差异比较，并比靶向代谢组学提供更多信息(10)．靶向代谢组学技术瞄准并测量感兴趣的代谢物，并考虑高度的特异性和准确性(10)．基于这些技术的代谢物分析可以用于寻找潜在的生物标志物，因为它可以识别个体中的不同生物系统，并探索异质性临床表现的证据。高效液相色谱和质谱是代谢组学中使用的主要分析技术，能够以高通量、准确性和精密度对样品中的代谢物进行分析或定量。

到目前为止，为了识别MDD诊断和治疗反应的生物标志物，脂质(11- - - - - -14)、氨基酸(15- - - - - -18)、胺类(19)和神经递质(20.，21)的样本，如血浆、血清、尿液和脑脊液，以及其他生物代谢产物，已经进行了研究。最近一项MDD与外周血代谢物功能的meta分析(22)报道称，由于样本量和结果一致性的问题，大多数调查MDD的非靶向或靶向代谢物研究的临床应用受到限制。此外，一项荟萃分析表明，在未来的MDD生物标志物研究中，考虑抗抑郁药物暴露的存在与否是很重要的，这是抑郁症亚组代谢变化异质性的主要原因。因此，在这项研究中，被诊断为重度抑郁症的患者暴露于药物治疗，包括抗抑郁药物，被纳入疾病组。

通过分析MDD患者和对照组的血清代谢物，两组之间显示差异的代谢物被确定为潜在的生物标志物;然后进行验证，以验证潜在血清代谢物标志物诊断抑郁症和确定缓解状态的有效性。通过这一过程发现的代谢物生物标记物可作为MDD诊断和缓解状态的生物标记物，与药物治疗(包括抗抑郁药物)无关。

实验方法

化学品和试剂

高效液相色谱级甲醇、水和乙腈购自J.T. Baker (NJ, USA)。甲酸(质谱级)购自Fluka Analytical (Buchs, Switzerland)。四种小分子[磺胺甲恶唑、酮洛芬、MES (4- morpholineethan磺酸)、草甘膦]和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙胺磺酸(HEPES)作为spike样品，选择性反应监测(SRM)分析中使用的内标盐酸乙酰-d3- l-肉碱购自Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)。乙酰肉碱购自Santa Cruz Biotechnology (TX, USA)，用于测定标准溶液。

样品收集

本研究得到乙支大学机构生物伦理委员会(EMC 2016-08-009-010, October 10, 2016)的批准，并获得参与者的书面知情同意。抑郁严重程度采用汉密尔顿抑郁量表(17项)进行评估。MDD患者组包括发现组和验证组，包括76例药物治疗(DT)或非药物治疗(NDT)患者。对照组由61例患者组成，缓解组由35例达到缓解的患者组成。参与者的人口统计数据显示在表1。所有参与者年龄均在19岁以上。药物治疗(DT)抑郁症患者组包括接受药物治疗(包括抗抑郁药物治疗抑郁症)的患者，非药物治疗(NDT)组包括未接受药物治疗的患者。对照组的所有参与者都是健康的参与者，他们不吸烟，没有头部损伤，从未服用过精神药物，在6个月内没有药物滥用史，包括酒精。在不含抗凝剂的血清管中采集血液(10ml)，室温静置30min确认凝血，2000 × g离心10min。分离血清为上清液，分装于1.5 mL微管中，-70℃保存，供进一步分析。本研究中进行的血清代谢物和非靶向/靶向代谢组质谱方法的样品制备基于先前建立的方案(23，24)．所涉及的整个分析过程说明在图1。

表1

表1。参与者的人口统计数据。

图1

图1所示。实验工作流程。为了发现抑郁症患者组和对照组之间显著不同的代谢物，使用非靶向代谢组学技术和Q-ToF质谱分析血清代谢物。然后，使用Q-Trap质谱靶向代谢组学技术在独立验证集中验证其作为生物标志物的有效性。

代谢物提取和过滤

将解冻的血清(100 μL)分装到1.5 mL的试管中，加入200 μL HPLC级水，进行短暂涡旋。然后加入700 μL的80%冷甲醇，旋流，在-70℃超低温冷冻室中储存淬火。淬火后，样品涡旋1 min，超声10 min，室温静置10 min, 4℃14000 g离心10 min。离心后，取400 μL上清液加入Nanosep过滤器。的Nanosep^®Omega™膜- 3k离心装置(Pall公司，纽约华盛顿港，美国)用hplc级水和70%乙醇激活。将含有上清液的Nanosep滤管在4°C下14,000 g离心20分钟，过滤后的样品溶液转移到新的1.5 mL滤管中。将400 μL样品溶液放入Nanosep过滤器中，得到过滤后的样品溶液，共800 μL过滤后的样品溶液在真空浓缩器(Scan Vac, LaboGene, Lynge, Denmark)中完全干燥，得到过滤后的样品溶液，保存于-70°C，直至MS分析。

LC-MS/MS分析的样品制备

在完全干燥的样品中加入5种内标物(MES、HEPES、草甘膦浓度为20 μM，酮洛芬、磺胺甲恶唑浓度为10 μM)和HPLC级水(5%乙腈、0.1%甲酸)80 μL，重悬。随后，涡旋1分钟，超声10分钟，室温静置10分钟后，在4℃14000 g下离心10分钟。将得到的上清液与重悬溶液稀释10倍，并在MS小瓶中制备。每种样品各取一微升进行LC-MS/MS分析。质谱系统是Agilent 6546四极飞行时间(Q-TOF)系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)连接到Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统。分析柱采用安捷伦ZORBAX快速分辨率高清晰度稳定键SB-Aq (2.1 mm × 150 mm, 1.8 μm)色谱柱，防护柱采用安捷伦ZORBAX stablebond - c8 (2.1 × 5 mm, 1.8 μm)色谱柱。柱放置在40°C的柱炉中，进行色谱分离。流动相A为含0.1%甲酸和5%乙腈的水，流动相B为含0.1%甲酸和5%水的乙腈。流动相流速为400 μL/min，梯度以100% A开始，降低至40%，持续14 min，再进一步降低至35%，持续3 min，保持5% A，持续5 min，最后5 min，采用累计运行30 min的方法恢复至100% A。离子源毛细管的Vcap电压为4000 V, 225℃温度下干燥氮气的流量为11 L/min。 The scanning speed was 2 Hz, and data were obtained through MS scan (range < 1,700 m/z) and auto MS/MS scan (20–1,000 m/z) in positive ion mode.

代谢物的鉴定显示重度抑郁症和对照组之间有显著差异

将质谱法获得的非目标原始数据导入Profinder (version 10.0, Agilent Technologies)，提取分子特征(MF)。将Profinder导出的CEF格式文件导入Mass Profiler Professional (version 15.1, Agilent Technologies)软件，并进行比对。保持时间窗口为1% + 0.15 min，质量耐受窗口为20 ppm + 0 mDa。随后，对一个条件和所有样本的mf进行频率滤波，并绘制火山图。在Mataboanaylst,¹进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。随后，针对火山图分析和PLS-DA中列出的mf进行了有针对性的MS/MS分析。化合物鉴定采用METLIN数据库。²

生物标志物候选验证的样本准备

组成验证集的参与者独立于发现集。将解冻血清(100 μL)配入1.5 mL管中，加入稳定同位素标记标准液(5μg/mL) 100 μL，作短暂涡旋。样品管加入800 μL的100%冷甲醇涡旋后，置于-70℃深冷冻室中淬火。淬火后，进行与LC-MS/MS分析样品制备过程相同的步骤。过滤后的样品在真空浓缩器中完全干燥，然后在80 μL 100%甲醇中重悬。涡旋10分钟，超声10分钟，室温静置10分钟后，在4℃14000 g下离心10分钟。用流动相A稀释上清100倍，在MS小瓶中制备。

通过选定的反应监测来验证候选生物标志物

选择反应监测(SRM)来验证候选生物标志物代谢物。在流动相A中稀释预先配制的测定标准液后，配制浓度为5、10、50、100、150、200、250和500 ng/mL的9种校准溶液。为了获得碰撞能量、聚类、碰撞出口和入口势等参数值，进行了复合优化，构建了SRM跃迁。SRM转变以前体离子->目标离子的形式表现，乙酰肉碱为204.1- > 85.1，乙酰-d3- l-肉碱盐酸盐为207.1- > 85.1。SRM分析使用SCIEX 5500 QTRAP和Exion LC (AB SCIEX, Foster City, CA, USA)进行。分析柱选用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.8 μm)，防护柱选用Agilent ZORBAX StableBond-C8 (2.1 mm × 5 mm, 1.8 μm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA)。流动相A为含0.1%甲酸和5%乙腈的水，流动相B为含0.1%甲酸和5%水的乙腈。流速设置为400 μL/min。流动相梯度以100% A启动，5 min时下降至0%，7 ~ 10 min时保持100% A。扫描采用正离子模式，机器参数为:离子喷射电压5.5 kV;离子源温度500℃; nebulizer gas (Gas 1), nitrogen, 50 psi; turbo gas (Gas 2), nitrogen 50 psi; curtain gas, nitrogen 30 psi. The software used for data processing was Analyst Software version 1.6.1 (AB Sciex) and MultiQuant Software version 2.0.2 (AB Sciex). To evaluate the reproducibility of the SRM analysis, quality control samples having low, medium, and high concentrations of acetylcarnite in mobile phase A were prepared (补充表1)．

统计分析

IBM SPSS统计版本26.0。(Armonk, NY: IBM Corp.)用于确认MDD组、对照组和缓解组的人口统计学信息变量之间的统计学差异。采用夏皮罗-威尔克正态检验检验数据的正态性。然后，基于正态性结果，Mann-WhitneyU连续变量采用-test和单因素方差分析，χ .²对分类变量进行分析。使用Mass Profiler Professional软件进行统计分析，以检测发现集中MDD患者组和对照组之间代谢物的差异。通过频率函数滤波，对组内所有样品中普遍检测到的mf进行滤波。用Shapiro-Wilk正态检验来确认滤波后mf分布的正态性。基于正态性检验结果，基于折叠变化> 2.0进行Mann-Whitney未配对检验p-value为按频率过滤的mf值< 0.05。多重测试校正设置为Benjamini-Hochberg FDR用于火山地块分析。类似地，在Metaboanalyst(见文本脚注1)中使用相同的MF列表进行PLS-DA分析。采用GraphPad Prism软件(version 8.4.2)对质谱分析得到的代谢物的相对强度和浓度定量值进行统计分析。正态性采用夏皮罗-威尔克正态性检验，未配对t根据正态检验结果进行-test或Mann-Whitney检验，对组间代谢物进行定量比较。

结果

代谢物显示重度抑郁症和对照组之间有显著差异

将质谱仪获得的原始数据导入MPP软件并进行比对，经频率滤波后，在至少一种条件下，所有样品中普遍检测到1331个mf。基于夏皮罗-威尔克正态检验，采用参数或非参数统计技术进行组间比较。通过对1331个MF的火山图分析，MDD组和对照组之间的MF显示出显著差异。有61个mf满足折叠变化> 2.0，和p-value < 0.05。其中53个呈向上变化的mf和8个呈向下变化的mf (图2)．随后，同样使用频率列表滤波器进行PLS-DA分析，确认MDD组与对照组有明显区别(图3)．在PLS-DA中显示vip > 1的mf和在火山图分析中确认的61个mf无重复，共168个mf。在获得168个mf的质谱扫描数据后(补充表2)，利用METLIN数据库进行化合物鉴定。在确定的14个候选药物中，乙酰肉碱最终通过确认其是否为血液内源性，并与质量值相匹配，在MDD组与对照组之间表现出明显的强度差异(图4)．

图2

图2。火山图分析。与对照组相比，53个MDD增加的mf用红色方格表示，8个MDD减少的mf用蓝色方格表示。水平的绿色线表示修正后的结果p-value = 1.3，使用负公共对数，垂直绿色线表示使用2对数两次以上的折叠变化标准值(向上折叠变化= 1，向下折叠变化= -1)。

图3

图3。PLS-DA评分图。PLS-DA分析，确认对照组与MDD组间差异。红点表示对照组，绿点表示MDD组。

图4

图4。MDD诊断的候选生物标志物。红点表示对照组，绿点表示MDD组。经Shapiro-Wilk正态检验后，经Mann-Whitney检验进行差异检验。每条红色和绿色的垂直线代表标准差，中间的黑线代表平均值。原理图和统计工作使用GraphPad Prism软件(版本8.4.2)进行。＊＊＊P< 0.0001。

通过选定的反应监测来验证选定的代谢物生物标志物

图5描述了在验证集中选择作为最终生物标志物候选的乙酰肉碱的定量结果。整个对照组与整个MDD组的比较(图5一个)显示MDD组乙酰肉碱浓度较对照组降低，MDD组与对照组差异有统计学意义。此外，将所有MDD患者分为NDT组，即不接受药物治疗的患者组和DT组，进行与对照组的差异比较(图5 b, C)，与对照组相比，MDD患者组的乙酰肉碱减少了。这被证实是一个统计上显著的差异，无论暴露于药物治疗。同样，筛选和比较男性对照组和男性重度抑郁症组的所有参与者的结果(图5 d-f)，并比较女性对照组和女性MDD组的所有参与者(图5胃肠道)，与对照组相比，MDD表现出较低的乙酰肉碱浓度，无论是否接受药物治疗，这在统计学上具有显著差异。与缓解组的乙酰肉碱浓度相比，MDD组的浓度明显降低。这与对照组和MDD组之间的比较显示出相同的趋势(图6)．此外，缓解组乙酰肉碱浓度与对照组无明显差异(图6 b)．

图5

图5。乙酰肉碱的验证。(两者)显示了整个控制组和整个MDD组之间的比较，(D-F)显示了男性内部的比较，和(胃肠道)显示了女性内部的比较。红色为对照组，绿色为MDD组，蓝色为男性，橙色为女性。未接受药物治疗的患者用未填满方格表示，接受药物治疗的患者用填满方格表示。经Shapiro-Wilk正态检验后，采用Mann-Whitney检验或未配对检验进行差异检验t-test, GraphPad Prism软件(版本8.4.2)用于原理图和统计工作。图中的值代表平均值±标准差。＊P< 0.05,**P< 0.01，且＊＊＊P< 0.0001。

图6

图6。MDD患者缓解状态的验证。(一)对照组与缓解组乙酰肉碱浓度比较。(B)缓解组与MDD组的比较。对照组用红点表示，重度抑郁组用绿点表示，缓解组用粉红点表示。经Shapiro-Wilk正态检验后，经Mann-Whitney检验进行差异检验。原理图和统计工作使用GraphPad Prism软件(版本8.4.2)进行。图中的值代表平均值±标准差。＊＊＊P< 0.0001。

讨论

乙酰肉碱在本研究中被确定并验证为MDD生物标志物，在健康人群中自然存在适量的乙酰肉碱。乙酰肉碱是由左旋肉碱和乙酸酯组成的酯，由人的大脑、肝脏和肾脏中的乙酰肉碱转移酶合成(25，26)．乙酰肉碱在脂肪酸氧化过程中促进乙酰辅酶a进入线粒体，增强乙酰胆碱的产生，刺激蛋白质和膜磷脂的合成，并通过为细胞能量生产提供底物库来防止过度神经元细胞死亡(25)．许多研究已经证实乙酰肉碱在抑郁症中是减少的(3.，5，27)．这些结果证实了乙酰肉碱是一种潜在的抑郁症诊断生物标志物。也有报道称内源性左旋肉碱衍生的乙酰左旋肉碱可能通过改善脑能量代谢和调节神经递质和神经可塑性作为抗抑郁药(5)．先前的几项研究证明了重度抑郁症和乙酰肉碱之间的联系。在具有类似抑郁症特征的啮齿动物模型中，乙酰肉碱水平下降和海马谷氨酸功能异常被证实(28)．在人类中也发现抑郁和乙酰肉碱水平下降(3.)．除了本研究的结果外，几项研究证实内源性乙酰肉碱水平的下降可以作为抑郁症的客观指标，补充乙酰肉碱的抗抑郁作用也有报道(5)．在最近的一项研究中，乙酰肉碱被确定为一种差异代谢物，通过比较MDD组和对照组的血浆代谢物分析，使用代谢组学方法来识别MDD诊断生物标志物(27)．然而，没有使用独立样本集进行验证，以评估所发现的生物标志物候选的有效性。在本研究中，考虑到抗抑郁药物暴露是影响抑郁症亚组异质性的主要因素，疾病组包括接受过药物治疗的患者，包括抗抑郁药物，以及未使用药物的患者。通过比较MDD组和对照组的非目标代谢物谱来鉴定差异代谢物。随后，通过SRM进行验证，以确定所发现的代谢物是否有效地作为诊断MDD的生物标志物。通过发现过程，与以往研究结果相似，确认了MDD组乙酰肉碱水平明显下降的趋势。与发现结果相似，验证结果中，MDD组乙酰肉碱浓度明显低于对照组和缓解组。此外，缓解组和对照组之间乙酰肉碱水平无显著差异。本研究的样本量计算是考虑到先前研究中的效应量为0.8 (3.)，双侧检验，显著性水平为0.05，幂次为0.8。基于这些参数，使用Cohen的d和幂函数计算，每组至少需要26个样本(29)．在本研究中，所有属于发现集和验证集的MDD组、对照组和缓解组均为26个或以上，因此满足确认各组比较有统计学意义的最低标准。然而，MDD组、对照组和构成验证集的缓解组之间的平均年龄有显著差异(表1)．在多个年龄变量的比较中，MDD组与对照组、MDD组与缓解组之间的差异有统计学意义，但对照组与缓解组之间无统计学差异(表1)．这表明，在比较MDD组、每个对照组和缓解组的结果中，可能存在年龄变量的影响。如果在后续研究中对乙酰肉碱进行进一步验证，考虑到更大的样本量、受控的受试者变量、抗抑郁药物类型和由于药物机制的异质性，乙酰肉碱作为诊断抑郁症和缓解状态的生物标志物的潜力将进一步阐明。

结论

在这项研究中，无论是否接受药物治疗，MDD组的血清乙酰肉碱显著降低，这在MDD组与对照组和缓解组之间存在显著差异。我们确定乙酰肉碱是诊断抑郁症、确定缓解状态和监测治疗效果的潜在生物标志物。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

道德声明

以人类为对象的研究得到了乙支大学机构生命伦理委员会的审查和批准。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。

作者的贡献

SL、SM、Y-RL、JL和H-GK对研究概念和设计做出了贡献。SL、SM、Y-RL、HC和E-JJ参与了研究的进行和数据的获取，并对数据进行了分析和解释。SL起草了手稿。JL和H-GK监督了研究过程，并修改了手稿以供出版。所有作者都对手稿做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

本研究由韩国政府(MSIT)资助的韩国国家研究基金(NRF)资助(No. 2020R1C1C1009196)。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fpsyt.2022.1002828/full#supplementary-material

脚注

参考文献

1.重度抑郁症。N英语J医学。(2008) 358:55 - 68。

谷歌学者

2.Costa LNG、Carneiro BA、Alves GS、Silva DHL、Guimaraes DF、Souza LS等。重度抑郁症的代谢组学:临床研究的系统回顾。Cureus。(2022) 14: e23009。doi: 10.7759 / cureus.23009