血液转录组分析:创伤后应激障碍中铁下垂和潜在的炎症途径

介绍

创伤后应激障碍(PTSD)是一种涉及环境和基因相互作用的精神综合征。创伤后应激障碍(PTSD)发生在创伤经历后，随后出现闪回、幻觉、噩梦、持续的警觉和增强的觉醒(1)。根据定义，PTSD与创伤性事件有关。然而，数据也表明，PTSD的发展需要一种基因倾向，这种基因倾向在不同程度上改变个体对创伤暴露的反应或从创伤暴露中恢复(2)。

高通量测序技术的发展使得与PTSD病理生理学相关的基因、途径和蛋白质的无偏鉴别成为可能。来自五项PTSD外周血研究的数据表明，转录中断影响多种免疫相关通路和分子(3.)。在对类似研究的回顾中，Heinzlemann和Gill得出结论，PTSD的发展是表观遗传调控改变和炎症基因高度活跃的结果。4)。

尽管对免疫波动的广泛观察，但仍不清楚具体机制是如何被激活的，以及关键过程是如何被调节的。另一方面，由于神经系统的代谢需求高，且对氧化敏感的脂质细胞(5，6)。PTSD患者血清脂质过氧化升高，抗氧化酶减少(7)。抗氧化蛋白酶、超氧化物歧化酶(SOD)的表达也在PTSD患者中被下调(8)。

氧化应激是一种细胞状态，发生在亲氧化分子，如活性氧(ROS)，超过了抗氧化剂的消除能力(9)。抗氧化衰竭导致细胞变性和凋亡，使氧化应激成为广泛参与多种疾病的主要分子衰老机制。

在过量铁的存在下，或者更准确地说，二价亚铁离子Fe^{2 +}，可产生大量的ROS，如可溶性羟基自由基或脂质烷氧基自由基(10)。这被称为芬顿反应，是由铁产生的细胞中ROS的主要来源^{2 +}。通过产生ROS，线粒体呼吸降低，脂质过氧化，酶被氧化，神经元可能受损(11)。此外，ROS和线粒体功能似乎与先天免疫系统密切相关。线粒体来源的ROS可以触发一些炎症小体，如核苷酸结合和寡聚结构域(NOD)样受体(NLRs)和黑色素瘤(AIM) 2样受体(ALRs) (12，13)。

另一个与铁代谢和ROS密切相关的过程是铁下垂。铁下垂是氧化应激引起的一种依赖铁的细胞死亡，涉及氧化应激常见的分子途径，如脂质过氧化和谷胱甘肽(GSH)耗竭(14)。Fenton反应是铁下垂的关键步骤。高水平的铁会产生过量的ROS，导致脂质体过氧化，从而导致细胞死亡。虽然铁下垂症最初是在癌细胞中发现的，但它与一些神经系统疾病有关，如阿尔茨海默氏症、帕金森症和中风(15- - - - - -17)。Stefanovic等人发现PTSD患者谷胱甘肽转移酶水平较低(18)，提示铁下垂可能参与PTSD的病理生理过程。这些研究表明，铁下垂可能是PTSD病理过程的一个关键影响因素。

本研究的主要目的是综合创伤后应激障碍转录研究的现有数据，并阐明铁脱铁相关基因(FRGs)与创伤后应激障碍病理生理学的关系。6项来自基因表达综合(GEO)数据库的独立研究被纳入。本研究采用多种算法建立PTSD风险预测模型，包括加权基因共表达网络分析(WGCNA)、基于贝叶斯优化的极限梯度增强(XGBoost)模型和最小绝对收缩选择算子(LASSO) Cox回归(图1)。此外，还进行了免疫细胞和功能分析，以揭示PTSD评估的潜在机制。

材料与方法

数据可用性

PTSD患者的RNA测序(RNA-seq)数据来自GEO数据库(登录号:GSE97356、GSE81761、GSE63878、GSE64813、GSE67663和GSE109409) (表1)。GSE97356包含324名世贸中心应答者，其中123人属于PTSD组，201人作为对照组。GSE81761包括患有创伤后应激障碍的军人(n= 39)和无PTSD的对照组(n= 27)。GSE63878包含来自部署到冲突地区的美国海军陆战队的96个样本，其中一半人返回时患有PTSD。GSE64813涉及188个军人样本，其中一半患有PTSD。GSE67663总结了112例PTSD患者和72例对照组的基因表达谱。GSE109409包含85名加拿大步兵，其中27人患有PTSD。所有的研究项目都使用外周血来获得转录组范围内的RNA-Seq数据，这两项数据都是公开的。因此，本研究无需获得当地伦理委员会的批准。GSE97356和GSE81761数据集作为训练集，其余数据集作为独立验证数据集。铁坠铁相关基因(FRGs)列表来源于先前发表的研究(19- - - - - -23)。

结合转录数据处理和批处理效应控制

所有统计分析均使用R程序3.6.2版本和GraphPad软件(Prism 8)进行。根据芯片和平台将基因符号映射到微阵列探针后，总结每个个体的基因表达谱。如果将多个微阵列探针映射到单个基因上，则表达水平表示为平均值。分析不包括缺失的数据或低覆盖率的样本。归一化前对基因表达值进行log2变换，即log2 Fold Change (log2FC)。使用R包ComBat和sva函数进行批量校正，以减少队列效应并消除技术、临床或人口统计学因素的系统变异性(3.，24)。随后，合并和归一化队列包含来自两个GEO队列的基因表达数据，其中包括PTSD和对照个体。我们进行了主成分分析(PCA)来验证批次效应是否被消除。连续变量组间比较采用等方差法T以及。的显著性阈值，除非另有说明P-value设置为0.05。

加权相关网络分析

通过limma包进行非参数分布的Wilcoxon检验，检测PTSD与对照组之间的差异基因表达(DGEs)。加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)是将基因表达数据转化为共表达网络，识别疾病相关基因模块和影响表型性状的关键基因的常用方法(25，26)。利用R程序的WGCNA包在DGEs数据上识别高连接模块，总结出与PTSD相关的特定基因表达模式。在适当的软阈值功率下，聚类分析可以成功建立标准的无标度网络，然后利用重叠WGCNA函数得到拓扑重叠矩阵(TOM)。采用高度截断为0.25的层次聚类方法对相似模块进行合并。模块特征基因(MEs)是将所有基因表达模式归纳为一个特定模块的主成分。随后，使用spearman的相关分析(在我们的研究中，临床特征指的是PTSD)估计模块-特质的相关性。提取spearman相关系数最高的模块。然后，在模块基因中聚集的基因与FRGs进行交叉匹配，从而确定FRGs在PTSD发展中可能至关重要。

超参数优化与特征重要性排序

为了进一步细化关键基因的筛选，我们采用了极限梯度增强(Extreme Gradient Boosting, XGBoost)算法。XGBoost算法是一种将多个学习算法组合成一个高级预测算法的方法。它主要由两部分组成:决策树算法和梯度增强算法(27)。提振是通过单独设置弱求值器和迭代集成多个弱求值器来实现的。由于超参数会极大地影响XGBoost模型的分类性能，因此采用基于高斯过程的贝叶斯参数优化方法对超参数进行调整(28)。本文中与贝叶斯优化相关的超参数主要有四个:Eta(学习率)、Max depth(树的最大深度)、Min child weight(每个child需要的实例权重的最小总和)和Subsample(训练实例的子样本比)。我们用曲线下面积(AUC)作为目标函数。特征的等级是由所有树中每个特征的平均增益决定的。高价值特征对于预测来说比低价值特征更重要。根据学习曲线对模型的性能进行了比较分析。因此，可以有效地评估分类模型的泛化能力(过拟合或欠拟合)(29)。

功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用网络

为了更好地了解DGEs和FRGs的生物学功能，进行了基因本体论(GO)富集和京都基因和基因组百科(KEGG)通路分析。GO分析使用了生物过程术语，该术语提供了关于编码和非编码基因功能的当前科学信息，并允许探索单个基因如何在分子、细胞和生物水平上对生物体的生物学做出贡献。KEGG数据库为细胞、生物、生态系统等生物系统功能提供信息，主要由基因组测序等高通量技术产生的大规模数据集生成。通过R VennDiagram包评估DGEs和frg的交集。GO生物过程和KEGG途径分析通过R“clusterProfiler”包确定了主要的生物学术语。使用R“GOplot”包来可视化浓缩项。

相互作用基因数据库检索工具¹提供来自大规模测序来源的蛋白质相互作用信息(30.)。使用该工具，可以计算预测特定基因簇之间的物理和功能关联(基于用户需求)。利用最大团中心性(maximum Clique Centrality, MCC)进行拓扑分析，计算了DGEs和FRGs交叉基因之间的蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。

建立风险预测模型

基因表达水平的全基因组分析和高通量技术产生了大量数据，可以对复杂疾病的遗传原因进行统计分析。通过最小绝对收缩和选择算子(LASSO)的正则化通常用于减少所选解释变量集，以检查所有生物标记物与给定表型(31)。LASSO模型的构建使用R包“glmnet”完成。在用最小标准进行十次交叉验证以确定惩罚参数(λ)后，建立Lasso模型。受试者工作特征(ROC)曲线验证了对疾病风险的预测能力。

来自免疫细胞标记和CIBERSORT分析的基因集富集

单样本基因集富集分析(ssGSEA)通过识别出的免疫标记对具有免疫生物学作用的基因集进行分类(32，33)。免疫标记包括782个免疫相关基因，代表不同的免疫细胞和功能(34)。将表达数据转换为ssGSEA评分，以预测单个样本中每种基因集类型的丰度。两项合并PTSD研究的基因表达谱被转化为基因集富集谱。

通过估计RNA转录本的相对亚群来识别细胞类型，也称为CIBERSORT，是一种计算算法，可以区分从RNA测序基因表达谱中检索到的22种免疫细胞类型(35)。每个样本的细胞类型包括B细胞naïve, B细胞记忆，浆细胞，T细胞CD8, T细胞CD4 naïve, T细胞CD4记忆静止，T细胞CD4记忆激活，T细胞滤泡辅助，T细胞调节(Tregs)， T细胞γ δ， NK细胞静止，NK细胞激活，单核细胞，巨噬细胞M0，巨噬细胞M1，巨噬细胞M2，树突状细胞静止，树突状细胞激活，肥大细胞静止，肥大细胞激活，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞。这样，基因表达谱就转化成了免疫细胞谱。

结果

联合基因表达综合队列中差异表达基因和铁坠病相关基因

基于非归一化表达式值的样本按批次显示分布偏倚(图2一个)。归一化后，PCA图显示不同平台的批处理效应被去除(图2 b)，训练数据集中包括185名PTSD受试者和248名对照组。批量校正对差异基因的log2FC值有显著影响。平均log2FC的绝对值由89下降到1以下。因此，我们没有使用log2FC，而是使用了一个更强的P-value准则，即P- FDR(错误发现率)校正后的值。FDR值小于0.05，在基线时从19281个基因中筛选出5362个DGEs，其中369个上调，4993个下调(图2 c)。在与之前研究中报道的60个frg进行匹配后，我们得到了29个差异frg (图2 d): ACACA, ACO1, ACSF2, ACSL3, ACSL4, AIFM2, AKR1C3, ALOX5, ALOX12, ALOX15, CBS, CD44, CHAC1, CISD1, CRYAB, CS, DPP4, EMC2, FADS2, FANCD2, FDFT1, FTH1, G6PD, GCLC, GCLM, GLS2, GOT1, GPX4，和GSS。

铁坠铁相关差异基因的功能注释

与生物过程相关的基因本体富集分析(BP)发现，29个差异FRGs在羧酸生物合成、有机酸生物合成、长链脂肪酸代谢和谷胱甘肽代谢等多个代谢途径上富集。细胞成分(CC)基因集中在各种细胞器膜上，如细胞器外膜、线粒体外膜和微体膜。分子功能(MF)基因主要富集于多种酶的活性，包括酰基-辅酶a连接酶活性、酸性-氨基酸连接酶活性和酸性-巯基连接酶活性(图3)。不足为奇的是，在KEGG途径分析中，29种不同的frg明显与铁衰和一些代谢途径有关，这些代谢途径与氧化石墨烯富集所揭示的代谢途径相似，如脂肪酸生物合成、2-氧羧酸代谢和谷胱甘肽代谢(图4)。

蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建与分析

PPI网络由29个不同的frg使用STRING数据库(图5一个)。随后，15个显著网络节点(GCLC、G6PD、ACACA、GCLM、GPX4、GOT1、CS、GSS、ACSL4、FADS2、GLS2、ACSL3、ALOX15、FTH1、ACO1)被识别出来，PPI综合评分> 0.4，表明网络为中高置信网络(图5 b)。

共表达网络构建

我们使用WGCNA来评估高连接模块，将PTSD病例的DGEs与所有对照个体进行比较。通过WGCNA算法，PTSD患者和对照组的基因层次聚类图显示两个聚类(图6)。高度超过20000的异常值被移除。当软阈值功率β设置为7时，无标度拓扑拟合指数R^2大于0.9，平均连通性稳定，表明网络连接良好(图6 b)。删除高度相似的模块后(图7)、12个基因簇模块(图7 bmeyan(96个基因)、MEblack(258个基因)、MEblue(1550个基因)、MEpurple(173个基因)、MEbrown(989个基因)、MEsalmon(135个基因)、MEgreenyellow(149个基因)、meered(274个基因)、MEtan(149个基因)、MEmagenta(434个基因)、MEyellow(385个基因)和MEgray(770个基因)。spearman的相关分析揭示了各个模块与PTSD的相关系数。我们选择了相关系数最大的模块MEgreenyellow(相关系数= -0.54，P= 5e-09)，作为进一步分析的关键模块。

MEgreenyellow模块基因的功能注释

对149个MEgreenyellow基因再次进行GO富集和KEGG通路分析(图8，9)。在GO分析中，这些基因聚集在多种免疫相关反应中，如细胞对干扰素- γ的反应、T细胞受体信号通路的负调控以及IgG结合。值得注意的是，这149个MEgreenyellow基因也富集在KEGG途径的铁脱铁中，并参与了一些类似的代谢途径，包括长链脂肪酸- coa连接酶活性和脂肪酸生物合成。

XGBoost检测关键基因

表2显示了XGBoost模型的参数范围和优化值。据此，我们得到了提供最高AUC的最优特征子集和超参数组合。在学习曲线中，最优模型同时满足训练集和验证集的准确性(图10 b)。根据XGBoost模型中每个特征的排序顺序，保留前20个关键基因(图10)。

最小绝对收缩和选择算子模型的构建

在交叉匹配60个FRGs和20个关键基因后，我们确定了三个与PTSD发展相关的关键FRGs: ACSL4, ACO1和GSS (图10 c)。他们也是我们PPI网络的重要节点。t-测试表明，这三个基因在训练数据集和验证数据集(图11 f)与对照组相比。利用3个交叉基因构建PTSD LASSO模型。如图10 d，生成3-FRG签名时，λ的最优值为:估计分数= ACSL4 × 0.000296 + ACO1 × -0.001032 + GSS × 0.001216。PTSD组的得分高于对照组(P< 0.001)。ROC曲线评估了估计评分对PTSD的预测性能，训练数据集的AUC达到0.769，验证数据集的AUC达到0.922 (图11 g, H)。

免疫状态与创伤后应激障碍评估风险的关系

我们将每个样本的ssGSEA富集评分进行量化，并以估计评分的中位数作为阈值来划分高危组和低危组。如图12，与抗原提呈过程内容相关的元件如adc(活化树突状细胞)、B细胞、dc(树突状细胞)在高危组显著上调。与细胞免疫相关的元素，如中性粒细胞、T辅助细胞、NK细胞、Tfh(滤泡辅助T细胞)、Th2细胞、TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)和Tregs(调节性T细胞)在高危组中表达上调。抗原提呈过程包括APC(抗原提呈细胞)共抑制，CCR (CC趋化因子受体)，checkpoint, cytoolytic activity, HLA(人白细胞抗原)，T细胞共抑制，T细胞共刺激，Type II IFN Response在高危组也上调(图12 b)。高危组细胞免疫和抗原呈递功能水平升高，可能与铁下垂障碍有关。

研究人员比较了高危组和低危组每个样本中22个免疫细胞的丰度。采用Pearson相关系数计算各成分之间的相关性。滤泡辅助T细胞、活化的NK细胞、巨噬细胞M1、静止的树突状细胞和活化的肥大细胞被排除在外，因为它们在每个样本中均为零。图13显示了上述17种免疫细胞类型之间的相关性。共有四种免疫细胞类型明显相关。中性粒细胞与T细胞CD4记忆休止负相关(r= -0.46)，单核细胞(r= -0.56)， NK细胞静息(r= -0.40)，提示中性粒细胞、T细胞CD4记忆静息、单核细胞和NK细胞静息之间可能存在拮抗关系。

CIBERSORT评估的免疫细胞差异表达显示在图13 b。高危组B细胞naïve、B细胞记忆、T细胞CD8、T细胞CD4 naïve、T细胞CD4记忆静息、T细胞CD4记忆激活、NK细胞静息、单核细胞、肥大细胞静息上调，服用P< 0.05为阈值。这些结果也证实了ssGSEA富集的结果，表明铁下垂参与了PTSD患者免疫状态的紊乱。frg是评估PTSD风险和潜在免疫状态的潜在指标。

讨论

我们通过结合六个独立的研究数据集，对PTSD病例和对照个体进行了全面的转录组范围分析，旨在揭示FRGs在PTSD病理生理学中的潜在参与。作为研究的第一步，我们应用批归一化来降低批效应，使我们能够提高统计能力并明确验证PTSD的不同分子途径。氧化石墨烯和KEGG的富集分析表明，氧化石墨烯与谷胱甘肽代谢直接相关，而谷胱甘肽代谢是铁衰的关键过程(36)。谷胱甘肽是细胞内对抗氧化应激的重要抗氧化剂(19，37)由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸(19)。氧化应激中的谷氨酸积累抑制半胱氨酸的输入，导致谷胱甘肽消耗和脂质过氧化物积累(38，39)。

Dixon等人首先描述了铁下垂症(40)，随后被定义为铁依赖性调节坏死伴脂质过氧化(19)。铁下垂的主要生化机制是多不饱和脂肪酸(PUFAs)的催化作用，在催化铁(II)的作用下引起脂质过氧化(41)。创伤后应激障碍的动物模型表明，与认知相关的大脑区域铁含量增加，导致神经元损伤(42)。因此，高催化Fe (II)丰度表明氧化应激水平高。PUFAs经常被脂氧合酶氧化，并被谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)及其辅助因子谷胱甘肽(GSH) (20.，43)。细胞内谷胱甘肽由半胱氨酸合成。因此，半胱氨酸耗竭导致细胞内谷胱甘肽耗竭并引发铁下垂(40)，表明维持某些半胱氨酸水平对于保护细胞免受铁下垂症至关重要。半胱氨酸对铁下垂的保护需求与GPX4 (38，44)。因此，抑制GPX4和耗竭GSH导致脂质过氧化物升高和铁下垂引起的细胞死亡(19，40，43)。我们的研究确定了三个预测PTSD风险的关键基因，这也是铁下垂的重要组成部分。ACSL4、ACO1和GSS调节脂质、铁、半胱氨酸和谷胱甘肽代谢过程，这些代谢过程参与了铁下垂的复杂生物学相互作用(45)。

ACSL4(酰基辅酶A连接酶4)编码长链脂肪酸辅酶A连接酶家族的同工酶，从而在脂质生物合成中发挥重要作用(46)。ACSL4有助于产生含有磷脂酰乙醇胺的花生四烯酸(AA)或肾上腺酸(AdA)，后者参与铁下垂的脂质过氧化(47，48)。ACSL4激活与缺血性脑卒中铁上坠症诱导的脑损伤和神经炎症有关(49)。ACO1(乌头酶1)编码一种调节细胞内铁含量的必需酶，降低ACO1可以抑制氨基酸/半胱氨酸剥夺引起的铁下垂(20.，50)。细胞内铁和ACO1的表达在脂肪组织中呈定向串音关系，同时影响其成脂能力，并将铁代谢与脂肪形成联系起来(51)。GSS(谷胱甘肽合成酶)是影响谷胱甘肽合成和代谢的核心基因(52)。GSS突变导致谷胱甘肽合成酶缺乏，并导致各种代谢性疾病(53- - - - - -55)。

对WGCNA中高连接模块基因的富集分析揭示了免疫应答途径，包括细胞对干扰素- γ的应答、T细胞受体信号通路的负调控以及IgG结合。同时，基于FRGs模型的ssGSEA和CIBERSORT分析显示，高危组之间存在特异性免疫状态差异，尤其是细胞免疫和抗原提呈，主要在高危组上调。我们的结果与最近的研究一致，这些研究报告了免疫反应和PTSD之间的直接或间接关系。例如，从五项转录组研究中提取的联合数据分析发现，在聚集的炎症途径中，包括细胞因子、先天免疫和I型干扰素(3.)。PTSD患者的免疫反应在基线时上调，症状改善后下调(1)。检测外周血细胞中的促炎细胞因子，发现CRP、IL-6、TNF-α、IL-1β和IFN-γ升高与PTSD症状相关(56)。PTSD患者外周血的转录测序也支持先天免疫和干扰素信号基因在发展PTSD病理生理学中的作用(57)。

最近的研究显示，铁坠病相关的细胞死亡是先天免疫系统的有效激活因子(36)。破裂的铁下垂细胞可释放促炎因子，如损伤相关分子模式(DAMPs) (36)，这是一个免疫原性的过程，可增加许多促炎症细胞因子的分泌(58，59)。此外，ROS和氧化脂蛋白也是DAMPs的关键成分。DAMPs通过与模式识别受体(PPRs)结合来刺激炎症，如toll样受体(TLRs)、NLR家族和ALR家族(12，60)。激活这些受体通过招募免疫细胞进一步增加炎症反应。一些铁下垂细胞释放信号，如PGE2，这可能会影响局部免疫环境(44)。免疫治疗激活的CD8 + T细胞已被发现促进铁坠铁特异性脂质过氧化，这增加了抗肿瘤治疗肿瘤疾病的疗效(61)。因此，我们有理由认为铁下垂症可能是与PTSD相关的免疫变化的潜在调节途径，使其成为有助于识别PTSD发展和治疗目标的潜在标记物。

限制

我们的研究有一些局限性。首先，我们的模型建立在一个有限规模的公共数据库上。需要跨多个中心的研究来验证我们的发现并评估其临床效用。其次，用单一的标志来估计PTSD发展的风险是不够的，因为我们知道，PTSD的发生也与各种环境因素有关。缺乏时间复杂度是我们研究的另一个局限性。由于原始数据的性质，采用横断面研究来分析结果。需要进一步的研究来确定我们的结论在前瞻性研究中的有效性。我们的研究提示了铁下垂在PTSD中的潜在作用，甚至提示它可能作为治疗PTSD的治疗靶点。然而，应该强调的是，铁下垂和创伤后应激障碍之间的联系需要实验确定。

结论

总之，我们的研究定义了一个与PTSD相关的新模型。目前的工作还表明了铁下垂在PTSD发生中的潜在免疫作用。需要进一步的研究来了解铁下垂与PTSD发展之间的联系机制。

数据可用性声明

这些数据可在此找到:公共数据集可在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。在正文中给出了相应的加入编号。

作者的贡献

JZ生成原始概念并进行统计分析。YZ和RR帮助撰写了初稿。LS修改了整个手稿。LS和XT监督了整个研究。所有作者都有充分的机会获得所有研究数据和分析，参与了本报告的准备，并批准了其最终提交的表格。

资金

中华人民共和国科技部项目(2021ZD0201900)和国家自然科学基金项目(No. 82120108002)资助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

脚注

1. ^http://string-db.org/

参考文献