局部应用金属过敏原可引起人体皮肤脂质组成的变化

1介绍

皮肤接触过敏是人类免疫毒性的最常见形式，在多达四分之一的欧洲人口中流行(Thyssen等人，2007年；Diepgen等人，2016)。这是一种IV型迟发性超敏反应，对被称为接触过敏原的化学物质过敏。过敏性接触性皮炎(ACD)是由反复接触过敏原引起的。它与巨大的医疗成本、生产力损失以及患者痛苦有关，是职业性皮肤病的主要原因之一。ACD发生为涉及先天和适应性免疫反应的级联事件，广泛分为致敏和诱导阶段。在致敏阶段，接触过敏原穿透皮肤，刺激适应性免疫系统并诱导记忆T细胞形成。接触性过敏原被认为是半抗原，太小了，不能单独刺激免疫反应，但如果它们与更大的生物分子结合，就能刺激免疫反应。随后暴露于相同或结构相似的接触变应原，触发诱导期:延迟超敏反应，导致炎症症状(卡普兰等人，2012)。半抗原修饰蛋白一直是ACD研究的重点，但过敏原对皮肤脂质的影响尚不清楚。脂质是皮肤的主要成分，存在于细胞间隙和角质细胞脂质包膜(CLE)中。不同皮肤层的脂质组成不同(图1） (诺克斯和欧博伊尔，2021年)。例如，角质层(SC)脂质以神经酰胺为主(占总成分的50%)，但缺乏甘油磷脂。脂质的多样性在皮肤的屏障功能中起着关键作用，抑制过度的经皮蒸发水分流失，防止微生物、过敏原和其他异种生物的进入(法因戈尔德和伊莱亚斯，2014年)。脂质组成的不规则性已被研究于多种皮肤状况，包括牛皮癣和特应性皮炎(哈丁,2004；van Smeden et al.， 2014；Sahle et al.， 2015；格鲁伯等人，2019)。在这些皮肤条件下，脂质含量的变化被认为与皮肤完整性和屏障功能的降低有关。然而，关于脂质在ACD中的重要性的研究还很有限。鉴于脂质在皮肤屏障功能和结构中的重要作用，研究过敏原对皮肤脂质组成的影响具有重要意义。

现有的研究主要研究了人类CD1蛋白家族(CD1a-CD1d)，这是一种脂质传感分子。这些蛋白质不同于主要组织相容性(MHC) I类和II类蛋白质，它们识别肽和蛋白质抗原，通常被认为有助于对接触过敏原的免疫反应。我们对接触性过敏中的非mhc限制性T细胞反应知之甚少。CD1蛋白在许多免疫细胞表面表达，包括皮肤中的免疫细胞，如朗格汉斯细胞和髓系树突状细胞。CD1家族可以结合并呈现一系列结构多样的脂质，从自身脂质，如鞘磷脂，到外源脂质抗原，如微生物中的霉酸和毒葛中的十五烷基儿茶酚(贝克曼等人，1994；穆迪等人，2005年；Kim等人，2016)。有一些证据表明CD1在接触性过敏中起作用，因为CD1d敲除小鼠对接触增敏剂三氯酰和二硝基氟苯的反应受损(坎波斯等人，2003年；Shimizuhira et al.， 2014)。CD1d糖脂拮抗剂可以减少对恶唑啉酮的免疫反应，通过小鼠接触超敏反应模型中耳朵厚度的增加来测量(Nieuwenhuis等，2005)。最近的研究表明，小分子接触增敏剂可以导致cd1介导的T细胞反应，这种反应在某种程度上依赖于内源性脂质(贝茨等人，2017年)。肉桂酸苄酯、苯甲酸苄酯和法尼醇等化合物被发现是cd1a限制性T细胞的刺激物(尼古拉等人，2020年)。

金属是最常见的接触过敏原之一(Thyssen和Menné， 2010；吉久和清水，2012；Diepgen等人，2016；Thyssen等人，2021年)。对镍的接触性过敏尤其普遍，尽管欧洲镍指令限制了镍从与皮肤密切接触和长时间接触的产品中释放的速度。Ahlström等，2019；Rosholm Comstedt等人，2020年)。在一般人群和职业环境中，钴和铬也经常被认为是接触性过敏原(Uter等人，2021年)。铬暴露在建筑工业中的水泥(六价铬)和皮革(Geier et al.， 2011；阿尔托-科特等人，2020年；Hedberg 2020)。钴暴露也很常见，但原因尚未完全确定，这阻碍了预防这种过敏原的ACD的努力(Alinaghi等人，2019年)。力学上，金属离子包括二价镍(Ni^{2 +})和二价钴(Co^{2 +})活化先天免疫系统和T细胞，以人体toll样受体4 (TLR4)为受体(施密特等人，2010年；Raghavan等人，2012)。免疫反应的性质和程度是复杂的，并因接触不同的金属而有所不同(丁格拉等人，2014；施密特和戈贝勒，2015年)。

以前的方法无法同时检测接触过敏原及其对皮肤组织的影响。我们提出了一种基于质谱成像的方法，能够同时检测皮肤组织中的外源性和内源性化合物(马尔姆伯格等人，2018年；Hagvall等人，2021年)。该方法是一种无动物的方法，因为可以进行实验体外使用人体皮肤组织，否则就会被丢弃。此外，它可以在常规扩散细胞实验中暴露的组织中以纳米分辨率直接绘制金属和脂类物种的分布。也可以分析皮肤亚层的分布，例如角质层(SC)和活表皮(VE)。我们现在描述三种金属过敏原的影响——镍(Ni^{2 +})、钴(Co .^{2 +})和铬(Cr^{3 +}) -脂质在体外使用飞行时间次级离子质谱(ToF-SIMS)对人体皮肤进行分析。

2材料与方法

2.1化学物质

六水合硫酸镍(II)甲酸铵₄.6H₂O) (CAS: 10101-97-0)，氯化钴(II)六水合(CoCl . 0)₂.6H₂O) (CAS: 7791-13-1)和六水氯铬(III) (CrCl_3..6H₂O) (CAS: 10060-12-5)从Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州，美国)购买。

2.2皮肤

全层人体皮肤取自瑞典哥德堡Sahlgrenska大学医院整形外科缩乳手术(女性供体)的剩余物。组织在收集时按照当地伦理委员会批准的常规进行匿名处理。皮肤组织从皮下脂肪中修剪，切成2 × 2厘米的薄片，安装在软木板上，用铝箔包裹，保存在- 20°C中，直到手术后3个月内使用。

2.3皮肤暴露

一个供体的皮肤样本在实验前在室温下解冻30分钟。全层皮肤被安装在垂直(franz型)皮肤扩散细胞(实验室玻璃仪器，伯克利，加州)，暴露表面积为1厘米²．受体区填充与质谱一致的甲酸铵缓冲液(0.15 M, pH 7.4, milliq水)。每个皮肤组织样本分别暴露于以下金属化合物之一:六水硫酸镍(0.15M)、六水氯化钴(0.15M)或六水氯化铬(0.15M)。暴露于甲酸铵缓冲溶液的样本作为对照。实验在室温(25°C)下进行，并按照OECD标准(OECD-iLibrary 2022)。实验一式三次。去除时，皮肤样本用蒸馏水轻轻冲洗。然后除去多余的水，样品用铝箔包裹并在液氮中冷冻，然后使用徕卡CM1520在10微米处切片。切片放置在导电玻片上并保持干燥直到ToF-SIMS分析。

2.4仪器

ToF-SIMS成像使用ToF-SIMS V (IONTOF GmbH, Münster，德国)，以铋液态金属离子枪作为主要离子源，C₆₀10kev离子源作为溅射源。用Bi记录了正离子模式下的质谱_3.⁺一次离子在25 keV，脉冲一次离子电流为0.25 pA。采用延迟提取模式获得高空间分辨率(最好为400 nm)和各自高质量分辨率(约为400 nm)的图像。5000年在m / z300)。每个切片的多个图像被记录在大约从。120µm × 120µm - 450 μm × 450µm在皮肤切片上使用256 × 256像素的光栅。

2.5多元分析

利用SurfaceLab中的自动选峰功能，选择了200多个峰m / z对照和金属盐处理的皮肤样品在SC和VE(从m / z14日至m / z605)。数据被导出到SIMCA(版本16.0,Umetrics, MKS Instruments Ltd.)。每个样品的数据被导入SIMCA，离子强度归一化为该样品的总离子计数。采用Pareto标度法，采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行分析。

2.6脂质含量分析

两个感兴趣的区域，SC和VE，使用SurfaceLab软件版本7 (IONTOF GmbH, Münster，德国)进行选择。SC的厚度一般在10 ~ 20 μM之间，VE的厚度一般在100 ~ 150 μM之间。分析了三个对照组和三个金属处理的皮肤样品的光谱。光谱内部校准为[C]+ [CH]₂] + [CH_3.[答案]C₅H₁₂N] +。光谱按总离子计数进行缩放。脂质片段在SurfaceLab中使用m / z每个片段的值。由于样本数量较少(n= 3)未进行统计分析，数据定性描述。LipidMaps和先前的研究用于结构鉴定(Sjövall等，2018；脂质图谱，2022年)。分析了以下离子:PC头基片段:m / z184 (C₅H₁₅PNO₄⁺)， 224 (c₈H₁₉PNO₄⁺）;胆固醇的片段:m / z369 (C₂₇H₄₅⁺)， 384 (c₂₇H₄₄O⁺)， 385₂₇H₄₅O⁺）;单酰甘油(MAG)片段:m / z313 (C₁₉H₃₇O_3.⁺；Mag 16:0)， 337 (c₂₁H₃₇O_3.⁺；MAG十八2);339 (C₂₁H₃₉O_3.⁺；MAG第18章);341 (C₂₁H₄₁O_3.⁺；MAG 18:0);二酰基甘油(DAG)片段:m / z547 (C₃₅H₆₃O₄⁺；道32:2)，549 (c₃₅H₆₅O₄⁺；道32:1)，551 (c₃₅H₆₇O₄⁺；道32:0)，573 (c₃₇H₆₅O₄⁺；道34:1)，575 (c₃₇H₆₇O₄⁺；道34:2)，577 (c₃₇H₆₉O₄⁺；(Dag 34:1)， 579 (c₃₇H₇₁O₄⁺；道34:0)，601 (c₃₉H₆₉O₄⁺；道36:3)，603 (c₃₉H₇₁O₄⁺；道36:2)，605 (c₃₉H₇₃O₄⁺；DAG 36:1)。

3的结果

分析考虑了皮肤的两个区域:角质层(SC)和“活的”表皮(VE)，包括颗粒层(SG)、棘层(SS)和基底层(SB) (图1)。用正离子模式分析了金属盐处理皮肤的SC和VE中四种脂类的含量，即磷脂[特别是磷脂酰胆碱(PC)，皮肤中含量最多的磷脂]、胆固醇、单酰甘油(MAG)和二酰甘油(DAG)。本研究中使用的金属盐是六水合硫酸镍(II)，其中镍以二价离子(Ni^{2 +})，六水合氯化钴(II)，其中钴以二价离子的形式存在(Co^{2 +})和六水氯化铬(III)，其中铬以三价离子(Cr^{3 +})。在溶液中形成的结果物种以前已经报道过，其中Cr^{3 +}显示出高溶解性和生物可及性，而Ni^{2 +}和有限公司^{2 +}主要以固体种存在(Hagvall等人，2021年)。

3.1多元数据分析

对对照组和用金属化合物处理过的皮肤进行多变量数据分析(MVA)，以确定SC和VE的整体脂质谱是否存在差异(图2)。在正离子模式下对所有单个样品进行比较，每种金属使用3个皮肤样品和9个对照样品。从PLS-DA中获得的结果表明，对照组皮肤样品中的脂质含量与暴露于三种金属化合物中的两种之间存在差异:Co^{2 +}和铬^{3 +}．MVA结果显示钴和铬两个感兴趣的区域之间没有区别。相比之下，镍处理过的皮肤与钴和铬处理过的皮肤不同。

3.2离体皮肤暴露于镍:角质层和活表皮中的脂质

图3描述了典型的m / z200 × 200 μm皮肤样品离子图像²250 × 250 μm²用镍或对照处理。这些图像描述了总离子计数(顶部)，或从PC头组(m / z184)， mag (m / z339)及DAG (m / z577)的对照组和镍处理过的皮肤样本。与对照组相比，镍处理皮肤样品中的脂质片段，包括PC头组、胆固醇、DAG和MAG与SC相似(图4)。与对照组相比，经镍处理的皮肤样本VE中DAG和MAG片段呈下降趋势(图5)。胆固醇(m / z369)在VE组与对照组相比下降。PC头组(m / z184)在VE中增加。在对照组和镍处理的皮肤样本VE中，胆固醇和PC头基片段的水平是相当的。

3.3离体皮肤暴露于铬:角质层和活表皮中的脂质

经铬处理的皮肤样品在SC中DAG片段的数量呈增加趋势(图6)。PC头组(m / z184)在SC和VE中与对照组相比降低(图6，图7)。其他脂质片段，包括MAG和胆固醇，在SC中没有表现出不同。用铬处理的皮肤样本显示，VE中DAG片段的数量增加(图7)。其他脂质片段包括PC头基、MAG和胆固醇在铬处理皮肤VE中与对照组相比没有差异。

3.4离体皮肤暴露于钴:角质层和活表皮中的脂质

用钴处理的皮肤样本显示出SC中DAG片段数量增加的趋势(图8)。钴暴露后，SC中胆固醇含量也明显增加。这与其他金属(铬和镍)不同。在对照组和钴处理的SC皮肤样品中，PC头组和MAG水平保持相似。

钴离子处理后，VE中的胆固醇和DAG片段也明显增加(图9)。MAG水平的变化不像DAG那么明显。与SC中一样，VE中对照组和钴处理过的皮肤样本中PC头基片段的水平保持相似。

4讨论

我们分析了其脂质组成体外人体皮肤暴露于三种常见的金属接触过敏原:镍(Ni^{2 +})，铬(Cr^{3 +})和钴(Co^{2 +})。ToF-SIMS特别适用于金属离子的检测。结果总结于表1．皮肤分为多层，表皮是最外层(图1)。表皮依次根据角质形成细胞的分化再细分成更多的层。在这项分析中，我们考虑了皮肤的两个不同区域——SC和VE。值得注意的是，来自人类生物样本的数据可能是非常可变的，皮肤脂质含量可能因许多因素而变化，包括年龄和解剖位置。我们实验中的所有样本都来自同一个皮肤组织捐赠者。这在一定程度上减少了样本供体解剖位置、年龄和性别差异通常所预期的可变性。

将我们的结果放在不同皮肤层的相对脂质组成的背景下是很重要的。最外层的皮肤层，即SC，由嵌在脂质基质中的富含无核蛋白的角质细胞组成。脂质主要有三个亚类:神经酰胺(50%)、胆固醇(27%)和游离脂肪酸(10%)(诺克斯和欧博伊尔，2021年)。SC含有可忽略不计的磷脂，PC头基和磷脂片段离子在对照和金属处理的皮肤样本中保持一致，这也许并不令人惊讶。钴是唯一能引起SC胆固醇含量变化的金属化合物，最大的变化是DAG的轮廓，在铬和钴处理的样品中，DAG的轮廓升高。DAG离子可能代表三酰甘油(TAG)，因为TAG在ToF-SIMS中被有效地破碎，主要产生DAG离子(Sjövall等，2015)。MAG离子也可能是在类似的过程中形成的。在SC中，TAG是脂质基质的一个次要成分。然而，TAG的代谢对表皮分化和皮肤的屏障功能(Radner和Fischer, 2014)。总的来说，结果表明，与对照组相比，金属过敏原治疗皮肤的SC发生了变化，差异取决于所测试的特定金属过敏原。

VE是一个复合术语，描述了剩余的三个表皮层:SG, SS和最里面的SB (图1） (van Smeden et al.， 2014)每个子层都有不同的特征。虽然被广泛认为是“可活的”，但这些表皮层是无血管的。因此，尽管被切除，体外本研究中使用的皮肤组织是研究金属过敏原对皮肤脂质影响的代表性模型。然而，皮肤经历了冻融循环，这将影响酶的活性。在样品中没有观察到人工制品，例如由冰晶引起的裂缝，由冻结/解冻过程引起的裂缝。SB主要由磷脂(70%)、胆固醇及其衍生物(13%)和TAG(11%)组成。角质形成细胞的逐步分化改变了脂质组成，在SG中，形成了称为层状体的胞内细胞器，其中储存了糖酰神经酰胺、磷脂和鞘磷脂(Jiang和Feingold, 2011)。我们的结果表明，在SC和VE中，这三种金属化合物在不同的脂类上存在差异。

4.1镍

有趣的是，与对照组皮肤样品相比，镍处理样品中的MAG和DAG片段减少了，在VE (图5)。这种趋势不同于其他金属离子在金属处理过的皮肤样品中的增加。未观察到对照组和镍处理样品间SC的差异(图4)。局部应用的水溶性镍盐主要沉积在SC中，只有一小部分进入VE，与所使用的镍盐无关(Hostýnek等，2001；马尔姆伯格等人，2018年；Ahlström等，2019；Hagvall等人，2021年)。本研究中先前发表的皮肤组织接触镍的研究结果与此一致(Hagvall等人，2021年)。这与钴和铬形成对比，钴和铬可以穿透皮肤(下图)。基于我们的发现，我们推测镍过敏是由进入VE的少量镍引起的，或者，镍作为催化剂产生具有免疫原性作用的产品。这可以解释镍的致敏作用，尽管它主要分布在SC中。这些作用的组合也是可能的。倪^{2 +}是通过直接激活人类TLR-4来引发炎症反应的，TLR-4是先天免疫反应的一部分(施密特等人，2010年)。然而，如果大多数局部应用的镍仍然停留在SC中，似乎只需要很小的浓度就可以激活角质形成细胞中的TLR4。有趣的是,倪^{3 +}和倪^{4 +}能够使小鼠对镍敏感，而镍^{2 +}不会单独引起过敏。我们可以推测，这些氧化值较高的镍离子可能是由镍生成的^{2 +}通过活性氧(Artik等人，1999年)。

4.2钴

氯化钴(Co^{2 +})[和重铬酸钾(Cr^{6 +})]通常表现出不同的免疫激活与硫酸镍(Ni^{2 +}） (丁格拉等人，2014)。在对金属盐增敏效能的动物研究中，发现钴是比铬更强的增敏剂(Basketter et al.， 1999)。与镍不同的是，钴可以穿透皮肤，因为在皮肤暴露后的尿液样本中可以检测到钴(Scansetti等人，1994年；Kettelarij等人，2018)。在皮肤内，局部应用后钴分布于SC和VE体外人体皮肤(Hagvall等人，2021年)。职业环境中的钴皮肤暴露是不可预测的，例如，瑞典一家硬金属工厂工人在工作2小时后皮肤上的钴浓度变化很大，在0.1至200 μg/cm之间²/2小时(Wahlqvist等，2020年)。经钴处理的皮肤样品中SC和VE的胆固醇、DAG和MAG含量均有所增加。

4.3铬

六价铬(Cr^{6 +})可以穿透人体皮肤，而三价铬(Cr^{3 +})最近被证实能穿透皮肤(Lidén和伦德伯格，1979；Hagvall等人，2021年)。铬的氧化状态很重要，因为只有三价和六价铬化合物足够稳定，可以作为半抗原(Samitz和Katz, 1964年；Gammelgaard等人，1992年)。Cr^{3 +}化合物的毒性和致敏性比Cr低^{6 +}虽然Cr^{6 +}还原为Cr^{3 +}皮肤内(亚当等人，2017年)。酶的氧化还原活性不太可能仍在发挥作用体外皮肤，因此我们选择铬^{3 +}．例如，三价铬在人单核细胞系THP-1中不诱导线粒体活性氧的产生、炎症小体的激活和细胞毒性。相反，六价铬确实通过活性氧依赖机制激活NLRP3炎性小体(亚当等人，2017年)。铬处理过的皮肤样品^{3 +}与对照组相比，SC和VE中DAG含量均有差异(图8，图9)。

通过分析金属离子对SC和VE的影响，发现对照组和金属处理后的样品中脂质含量存在明显差异。这三种过敏原没有明确的趋势，可能的解释是皮肤渗透和分布的差异。镍与钴和三价铬表现出明显不同的特征，在MVA (图2)。铬和钴对彼此造成了类似的变化。有趣的是，考虑到钴和铬比镍更深入人体皮肤，如下所述。总体而言，MAG和DAG片段的差异最大。

金属等氧化/还原物种可能对内源性脂质产生影响，这可能并不令人惊讶，因为内源性脂质对过氧化非常敏感。所分析的脂类范围仅限于正离子模式，因此并非所有皮肤脂类(例如脂肪酸)都在这里被表示出来。具有较高分子量的脂质，例如神经酰胺，也没有分析，因为在较高的电离相对较差m / z值。发现了不同的脂质谱体外而且在活的有机体内在其他皮肤病如牛皮癣和特应性皮炎中，与对照受试者的皮肤相比(诺克斯和欧博伊尔，2021年)。根据我们的发现使用体外人类皮肤，对金属皮肤过敏的患者与对照组相比，脂质谱也可能存在差异。这项研究仅限于一个皮肤捐赠者(从一个皮肤切片中提取三个样本，每个样本独立暴露)，并有必要对不同的捐赠者和过敏原进行进一步研究。所有过敏原暴露时间为24小时;研究长期接触的影响将是有趣的，但这将是困难的体外组织。尽管该模型存在局限性，但我们的结果也表明，皮肤增敏剂可以影响VE中的脂质，尽管渗透到VE的程度很低(镍)。

十五烷基儿茶酚和法尼醇的共晶结构显示了它们在CD1a内的结合模式，并取代了内源性脂质配体(Kim等人，2016；尼古拉等人，2020年)。这两种化合物都是亲脂性的，它们的相互作用模拟内源性配体，在蛋白质的A'和F'口袋内结合。然而，金属过敏原和小有机分子影响cd1介导的免疫应答的机制尚不清楚。根据本文的结果，可能是过敏原引起内源性脂质平衡的改变，从而引发这些反应，但还需要进一步的工作来证实这一点。此外，包括dag在内的脂质参与细胞信号传导，过敏原暴露后其水平的变化可能会改变这些信号传导途径(Mérida等，2007)。

总之，这项研究是第一个同时研究半抗原及其对皮肤组织的直接影响的研究。这可以通过使用ToF-SIMS实现。我们研究了皮肤敏化剂镍(Ni^{2 +})、钴(Co .^{2 +})和铬(Cr^{3 +})的血脂体外人类的皮肤。在SC和VE中观察到许多脂类的变化。MAG和DAG受到所有金属的影响，至少在一个被分析的皮肤层中，但与铬和钴相比，镍的趋势相反。我们的研究结果表明，脂类在导致皮肤过敏的分子机制中可能不是惰性旁观者。需要进一步的研究来量化这些脂质组成变化对ACD的影响。

数据可用性声明

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中补充材料，可向通讯作者查询。

道德声明

捐献的皮肤组织在收集时按照当地伦理委员会(哥德堡)批准的常规进行匿名处理。

作者的贡献

NO’b提出了这项研究的概念。LH和PM制定了方法并进行了实验。SK正式分析了数据。NO'B写了原稿。NO’b, LH和PM写了部分手稿。所有作者都参与了稿件的修改，并阅读并批准了所提交的版本。

资金

NO’b感谢分析化学信托基金提供CAMS-UK奖学金(编号:600310/07)。PM感谢Forska utan Djurförsök (F2020-0001)的友好支持。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

致谢

我们要感谢IONTOF对SurfaceLab软件的访问和支持。我们也非常感谢Cian O 'Boyle (cian.oboyle.2013@gmail.com)图1图形。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/ftox.2022.867163/full#supplementary-material

参考文献