巴西在产品注册中使用新方法(NAMs)的监管背景

简介

以前被称为动物实验的替代方法，新方法方法(NAMs)是指任何方法，协议，改变和一套策略，减少动物数量，降低程序的严重性，或取代实验动物的使用，遵循3rs原则(Wambaugh等人，2019年)．从传统的动物实验到NAMs的转变是一种国际趋势，始于关于使用动物进行化妆品试验的伦理问题的讨论。然而，随着科学的发展，NAMs的使用已经超越了伦理问题，其核心前提是改善对人类毒性作用的预测(Parish等人，2020年)．一个基于NAMs的评估策略集成在网上，在chemico,在体外了解导致所观察到的不良影响的初始机制终点的方法在活的有机体内．这些方法并不是设计用来直接替代在活的有机体内方法，但为不同目标物种(通常是人类)的不利影响提供更好的证据;但在兽药开发和生态毒性评估的前提下，其他物种可能成为主要关注对象)。

每种方法的局限性，例如ADME(给药、分布、代谢和排泄)，对毒理学的理解和假阳性在体外结果应仔细观察。

NAMs概念渗透到所有安全评估领域，并反映在如何处理监管毒理学，从而改变了适用的法规。

图1在巴西恢复动物实验/NAMs立法的发展。自1934年起，巴西制定了有关动物保护的立法，包括《动物保护法令》(巴西,1934)、反活体解剖法(巴西,1979)，以及环境罪行法例(巴西,1998)．然而，动物实验只是在颁布Arouca法(第11.794/2008号法律)后才受到关注，该法改变了巴西进行动物实验的方式(巴西,2008)．该法重点关注在教学和研究活动中使用动物，并规范了动物的使用、管理和检测条件，重点关注动物福利。阿鲁卡法的基本要点是建立了国家动物实验控制委员会CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal)。这一民主实体包括科学机构和依法成立的动物保护协会的代表。CONCEA任命了一个专门研究替代方法的常设委员会，负责该领域最重要的决议。2014年9月，CONCEA发布了规范性决议17/2014。本决议规定了由CONCEA批准替代测试的必要性，并在获得批准5年后，批准的方法将优先应用于毒理学评估(CONCEA, 2014)．同样于2014年发布的规范性决议18 (RN 18)首次批准了作为其原始版本替代品的方法。该决议批准了17种方法，包括7种毒理学结果(毒理学结果:毒理学研究监测的效果)的替代品(CONCEA, 2014 b)．在此之后，2016年的第31号决议和2019年的第45号决议批准了其他8种方法(CONCEA 2016，2019)．2022年，规范性决议54/2022取代了NR 17/2014，其中包含了更完整的定义和使用国际公认方法的可能性，即使没有得到CONCEA的正式批准。根据NR54/2022，所有批准的方法必须在批准后立即使用，但保持5年的耐受性(CONCEA 2022)．

CONCEA规范性决议17/2014 (CONCEA, 2014)在巴西卫生监管机构ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)发布董事会决议(Resolução da Diretoria Colegiada) RDC N. 35/2015后变得更加重要，该决议规定接受CONCEA推荐的动物实验替代方法(巴西2015 b)．这项法令赋予CONCEA核准的方法以管制意义;而是关于他们是否被理事会和监管机构所接受，从而影响到ANVISA监管的所有生产部门。

为了促进在巴西使用NAMs, 2012年成立了RENAMA (Rede Nacional de Métodos Alternativos)等倡议，并于2021年重新启动(2021年巴西）;巴西替代方法验证中心(BraCVAM)于2013年正式启动(Presgrave等人，2016）;以及负责近30个培训课程的南方共同市场替代方法平台(Premasul)至关重要。

即使立法在不断演变，具体的立法也并不总是符合准确的要求;保持NAMs的监管接受度是一个持续的问题。挑战包括满足不同行业的立法要求，所提供数据的质量(研究报告和文献综述)，认证设施的可用性(GLP或ISO17025)，数据的正确解释，以及决策过程的透明度。

因此，本工作旨在讨论巴西在药品、医疗器械、食品/补充剂和农用化学品注册安全评估中使用NAMs的监管背景和挑战。

药品

与其他全球卫生机构一样，在ANVISA注册新的合成、生物和草药药物时，安全性评估是必要的。巴西,2010，巴西,2011，巴西,2014，巴西,2017，巴西2018 b)．在注册后阶段，毒理学评价也可能是必要的，例如药物杂质鉴定(巴西2015 c)．

根据与药品注册相关的ANVISA立法，新药的安全性评估包括非临床和临床研究(巴西,2010，巴西,2011，巴西,2013，巴西,2014，巴西,2017，巴西2018 b；巴西2019 b；巴西,2019 d)．根据ICH(国际人用药品技术要求协调委员会)、EMA(欧洲药品管理局)和FDA(美国食品和药物管理局)的相关指南，急性毒性、剂量重复毒性、生殖毒性、遗传毒性、局部耐受性、致癌性、安全药理学、免疫毒性和毒性/药代动力学是需要研究的最小非临床终点。研究应根据经过验证和认可的指导方针进行，如经合组织(OECD)议定书，并在良好实验室规范(GLP)认证的设施中进行。ANVISA建议更换在活的有机体内采用国际公认的替代方法进行的研究(巴西,2013，巴西2019 c)．

对于药物杂质，根据在药物稳定性分析和产品生理中检测到的杂质水平，还可能需要进行毒理学评价，以证明产品的安全性。这一过程被称为杂质鉴定，至少涉及致突变性和一般毒性(2015年巴西；2015 c)．药物中DNA反应性(致突变)杂质的ICH M7评估和控制以限制潜在的致癌风险(我,2017)， ANVISA推荐在网上作为致突变性评估的首要方法(2015年巴西)．根据结果概况，质量和置信度，一个确认在体外测试(如艾姆斯测试)应该进行。因此，根据文献数据，在网上,在体外结果该杂质分为1类和5类。对于一般毒性，通常需要在啮齿动物中进行28天或90天的重复剂量毒性试验。至于新药开发，必须按照OECD和GLP的技术和质量要求进行研究。

医疗设备

根据RDC No. 546:2021 (巴西2021 b)，医疗仪器的设计和制造必须保证其特性和性能，并特别注意:

1)所使用材料的选择，特别是在毒性方面，如适用，可燃性方面;而且

2)材料与生物组织、细胞和体液之间的相容性，考虑到医疗产品的预期用途。

因此，需要对直接与患者接触的产品进行临床前和临床安全性评估。生物评价(非临床安全性)根据ISO 10993指南系列进行。ISO 10993-1(风险管理过程中的评估和测试)的前一个版本提供了基于所需毒理学终点列表(包括大多数毒理学终点的动物试验)的生物学评估。然而，2018年的版本带来了一个新的概念:唯一强制性的方法是物理化学表征(ISO 2018)．所有毒理学终点应根据专家评估并考虑现有数据来确定。毒理学的基本原理应该被很好地描述，并通过文献综述得到适当的支持，必要时，通过适当的化验报告。信息的一致性和清晰度至关重要;提出一个充分解释和记录的理由来集成技术档案是至关重要的一步。然而，监管机构不接受糟糕的文献综述，这些公司明白，这些机构更有可能授权测试设备，通常会直接进行动物实验。在这种情况下，监管的不确定性与信息冲突无关，而是与指导方针的正确解释有关。

只有当完整的文献回顾不足以确保生物相容性时，才必须进行特定的测定。ISO 10993系列不断更新，包括评估特定端点的NAMs。考虑到CONCEA的新规定(RN 54/2022;CONCEA 2022)，国际标准化组织就医疗仪器发布的新方法，应足以取代动物试验。因此，它不应带来监管方面的不确定性。另一方面，新测试应在合格实验室验证和实施的范围内使用(根据GLP或ISO17025) (ISO 2018)，他们的结果应该得到充分的评估、讨论，并包括在生物相容性报告中。大多数问题源于没有正确地进行实验或没有充分讨论结果。在这种情况下，所有过程中的科学严谨性是监管机构接受的主要因素。

食品/保健品

为了在巴西注册供人类消费的新食品或新配料，申请公司必须向ANVISA提交一系列关于产品的信息，主要是根据第16/1999号和第17/1999号决议(巴西,1999;1999 b)及有关决议。ANVISA将那些在巴西没有使用历史或已经被消费，但用量将远远高于目前日常饮食中所使用的食物的物质归类为“新食品或新食品成分”(巴西,1999)．

在必要的信息中，有安全证据，其目的是保护人们的健康，减少与产品消费相关的可能风险。安全评估包括完整的风险分析，包括有关特性、使用历史数据、毒理学数据、预期用途和暴露的信息，这些信息必须组成技术科学报告。报告必须符合指引第23/2019号(2019年巴西)用于食物及食材。益生菌的安全性评估也包括在其他立法中，如RDC 241:2018 (2018年巴西)，并有专门的指引第21/2021号(巴西2021 c)．这两份指南都没有详细说明具体的协议，但一般都指出了终点。两份文件都建议使用特定终点的动物进行毒理学评估，主要是因为需要得出一个安全值，如ADI(可接受的每日摄入量)。此外，指南主要提到在活的有机体内评价大多数毒理学终点的方法。在这种情况下，使用NAMs的不确定性与非基于动物结果的安全值外推有关，这是一个尚未巩固的主题。

农用化学品

巴西农业化学品毒性监管的演变被广泛回顾da Silva等人(2020)．毒理学评估和分类方法在2019年发生了重大变化，当时ANVISA推出了一项新法规RDC 294:2019 (巴西2019 c)．更新后的方法基于全球化学品统一分类和标签系统(GHS)标准，使ANVISA更接近国际要求(巴西、2019 c)．

法规直接提到了使用CONCEA、OECD或具有类似监管要求的当局批准的替代方法的偏好。然而，与分类相关的严格要求引起了人们对NAM结果可接受性的怀疑。

我们可以拿皮肤刺激和腐蚀为例。经合组织指南TG431在体外皮肤腐蚀:重建人表皮(RHE)试验方法(经合组织,2019年)和TG439在体外皮肤刺激:重建人表皮试验方法(经合组织,2021年)经过验证并广泛用于识别GHS 1类腐蚀性，2类刺激性和无分类-无刺激性。使用这些指南在分类上的唯一差距是依赖于3类轻度刺激物。这两种检测方法都获得了CONCEA的批准，并在GLP条件下可在巴西获得;根据ANVISA法规RDC 35:2015，他们将是测试该端点的首选。然而，RDC 294:2019中描述的分类标准仅基于动物数量和皮肤损伤(巴西2019 b)．在这种情况下，即使有完善的替代指南，公司也更倾向于使用动物试验来满足RDC 294:2019的特定要求。

结论/观点

巴西在对NAMs的监管接受和使用方面处于拉丁美洲的前沿。在过去的20年里，ANVISA和CONCEA已经发布了一些关于NAMs在产品毒理学评估中的接受度的指南(总结在表1而且图1)．

在ANVISA接受药品、医疗器械、食品/补充剂和农用化学品的注册，前提是遵循经过验证的协议，在其验证的范围内，并在质量控制条件(GLP或ISO17025)下进行。然而，重要的是要记住，每一种策略都有自己的局限性，所以了解每个实验可以得出什么结论是至关重要的。监管机构认可的方法等效性通常不能直接替代一种测试方法。需要所有信息来补充该方法，并应提供对不良影响的理解。

然而，一些法规在监管机构或被监管部门之间产生了相互矛盾的解释。在许多情况下，并不是NAMs本身不被ANVISA接受，而是缺乏可靠的结果以及注册过程中包含的检测执行和描述阶段的缺陷导致了这种负面反应。监管机构需要确信任何结果都是可以接受的，这来自于使用经过充分设计的实验，并考虑到被测试产品的特殊性。与此同时，受监管部门需要确定监管机构将如何解读数据。

关于NAMs的监管接受的要点可以总结如下:

-在验证的范围内使用验证的方法。

-严格的实验操作，GLP实验室优先考虑。

完整的测试报告，至少包括参考资料、历史实验室数据、重复次数和负责的研究。

-完整的文献综述，有检索和详细的方法和分析。

-由该学科的专家对结果进行强有力的科学分析，并得出科学支持的结论。

-监管评估过程的透明度，明确如何评估每个结果。

从开发和验证方法到决策，透明度是整个过程的一个基本点。不同的观点/期望、缺乏透明度和数据强度是在NAMs中建立信任的主要障碍。这些问题不仅来自巴西的现实，也在国际上不断被讨论。

要解决这些问题，分享知识至关重要。诸如PremaSul(实验动物使用替代方法区域平台)等培训举措在通过学院和监管部门传播已获批准的方法方面取得了巨大成果。现在，我们需要更多的部门之间的互动。由科学学会和技术协会(如RENAMA(国家替代方法网络))调解的工作组的创建，将学术界、工业界和监管机构带到同一张桌子上来讨论解决不同端点的最佳方法，将是协调需求和期望的下一步。不同利益相关者之间的合作将为整个过程提供透明度，建立对NAMs的信任，从而建立监管确定性。

数据可用性声明

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作者的贡献

所有列出的作者都对该工作做出了实质性的、直接的和智力上的贡献，并批准了其出版。

利益冲突

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致谢

作者感谢在毒理学方面的合作者、合作伙伴和客户的学习经验，帮助建立了这方面的知识。

参考文献