Pgp3疫苗接种的效果衣原体泌尿生殖道感染取决于其天然构象

简介

沙眼衣原体它是一种革兰氏阴性胞内细菌，至少包括19种血清型。血清轮A至C与眼部上皮细胞感染有关，血清轮D至K主要感染泌尿生殖上皮细胞，血清轮L1至L3主要针对淋巴组织(1)．所有c . trachomatis生物共享一个保守的双相生命周期，在传染性初体(EB)和非传染性网状体(RB)之间切换。衣原体感染是由EB侵入宿主上皮细胞引起的。内化的EB迅速分化为代谢活性RB。它复制并分化回EBs, EBs在生命周期的后期释放并感染相邻细胞(2)．泌尿生殖道感染c . trachomatis在性传播感染患者中经常被发现，2018年全球年发病率估计超过1.31亿例(3.)．虽然衣原体对抗生素治疗敏感，大多数感染妇女无症状且容易被忽视，导致感染的扩散和并发症的发生。值得注意的是，15%-40%阴道衣原体感染的女性会出现炎症并发症，包括输卵管纤维化和堵塞、粘连、异位妊娠和不孕症(4，5)．衣原体生殖道感染的沉重社会负担凸显了开发有效疫苗的迫切需要(6)．

c . muridarum是老鼠的变种衣原体为研究该病的发病机制提供了模式病原体c . trachomatis．c . muridarum阴道感染引起小鼠输卵管积水，类似于雌性输卵管不育症(7)．Pgp3是一种隐性质粒编码蛋白，自从缺乏Pgp3以来，就与衣原体发病有关c . muridarum阴道感染后未诱发输卵管积水，口服接种后无法在胃肠道定植(8，9)．Pgp3是一种约84 kDa的同型三聚体，由球状N-、类似肿瘤坏死因子的C-和三螺旋线圈m结构域(10)．c . muridarum缺乏Pgp3任何区域的突变体减弱了输卵管积水的诱导，这表明结构完整性对Pgp3功能至关重要(11)．此外，Pgp3三聚体分布在衣原体EB外膜和感染细胞胞浆中。从生殖器感染衣原体的女性身上收集的抗血清，主要识别Pgp3的频率高于任何其他衣原体免疫显性抗原，包括衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)、主要外膜蛋白(MOMP)和多态性外膜蛋白，而人类抗血清仅识别三聚体形式的Pgp3 (12- - - - - -14)．

尽管进行了广泛的努力，但仍然没有可用于人类的衣原体疫苗。Pgp3作为衣原体毒力因子和免疫显性抗原，在以前的疫苗研究中经常被报道。用pgp3 DNA免疫C3H/HeN小鼠，可防止病毒的传播c . trachomatis从阴道到上生殖道(15)．重组Pgp3蛋白对C57BL/6N小鼠进行皮下免疫后，肺部的生物负担显著降低c . muridarum呼吸道感染(16)．从衣原体血清D中纯化的重组Pgp3蛋白经鼻内免疫BALB/c小鼠，显示出对血清的交叉保护作用c . muridarum生殖道感染(17)．此外，免疫接种衣原体psitaciCPSIT_P7，同源的c . trachomatisPgp3蛋白序列同源性为70%，具有部分抗c . psitaciBALB/c小鼠肺部感染(18)．因此，Pgp3对两者均表现出稳定的保护作用衣原体这表明Pgp3在临床疫苗开发中的潜在价值。然而，目前尚未研究Pgp3的三聚体构象是否是其保护效力的必要条件，这一问题的答案将指导基于Pgp3的多表位肽和多亚单位衣原体疫苗的设计。

在本研究中，我们测试了接种疫苗的功效沙眼C.Pgp3三聚体与热变性Pgp3单体与th1极化佐剂CpG的比较c . muridarum小鼠生殖道模型。Pgp3三聚体和单体免疫均诱导产生相应的特异性抗体，但只有三聚体诱导的抗体能识别内源性Pgp3，三聚体免疫的小鼠脾细胞在衣原体EB或原生Pgp3重新刺激后IFN-γ产量最高在体外．重要的是，只有Pgp3三聚体免疫的小鼠下生殖道衣原体脱落缩短，上生殖道病理减少，这强调了维持Pgp3构象对其保护效力的重要性。这些观察结果为衣原体疫苗的开发提供了重要和新颖的信息。

材料与方法

标准应变衣原体

c . trachomatis菌株D/UW-3/CX和c . muridarum在融合的HeLa 229细胞(ATCC, CCL-2.1)上培养菌株Nigg，并通过前面所述的Renografin梯度从感染细胞中纯化EBs (19)．用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤两次后，将EBs悬浮在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液中，并在−80°C保存。

Pgp3三聚体及单体的制备

将重组质粒pGEX6p/pgp3转化为大肠杆菌XL-1蓝色表示GST-taggedc . trachomatis菌株D/UW-3/CX蛋白Pgp3，如前所述(17)．GST- pgp3使用谷胱甘肽偶联琼脂糖珠纯化，并使用精密蛋白酶(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.， Piscataway, NJ, USA)分离以去除GST标签。为了排除内毒素污染，使用毒素清除试剂盒(GenScript, Piscataway, NJ, USA)处理纯化的Pgp3蛋白，并使用鲎试剂(中国马蹄蟹试剂制造厂，厦门，中国)检测内毒素水平。内毒素含量小于0.05内毒素单位(EU)/ml，不能导致免疫细胞的非特异性激活。通过将天然无内毒素Pgp3蛋白煮沸1、5或10分钟制备热变性或线性化单体Pgp3抗原。使用12%天然凝胶电泳和考马斯蓝染色评估天然Pgp3蛋白(三聚体)和单体的质量和分子量。

小鼠与免疫

值得注意的是，本实验使用的是购自湖南SJA实验动物有限公司的5-6周龄特殊无病原体雌性BALB/c小鼠。总共获得45只小鼠，分为三组，每组15只。两组小鼠分别用纯化的Pgp3三聚体或单体蛋白30 μg与10 μg CpG佐剂(Coralville, IA, USA)混合鼻内免疫。第三组单独用CpG佐剂免疫，作为对照。所有小鼠分别在3天(第0天、第20天和第30天)免疫3次。在第3次免疫后14天采集5只/组小鼠血清，分析抗体产生情况。为确定各组小鼠抗血清中是否含有构象依赖的Pgp3蛋白识别抗体，以重组Pgp3蛋白和内源性Pgp3蛋白作为抗原，通过western blot或免疫荧光法与这些小鼠血清反应。第3次免疫后20 d，每组处死5只小鼠，检测脾细胞因子。所有动物程序均符合华南大学动物福利与伦理委员会的指导方针。

天然凝胶-western印迹法

本实验中使用的12%天然凝胶是根据制造商的说明(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)制备的。用于天然凝胶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的蛋白质加载缓冲液与用于变性凝胶的相同，但不含十二烷基硫酸钠(SDS)。值得注意的是，将2-µg纯化的重组Pgp3蛋白或热变性蛋白溶解在天然凝胶蛋白加载缓冲液中，无需煮沸即可加载到凝胶孔中。电泳后，凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜(中国上海生工生物技术有限公司)上进行抗体检测。以Pgp3三聚体、Pgp3单体或CpG单独免疫的小鼠血清为一抗，以酶标山羊抗小鼠IgG为二抗。使用ECL发光试剂(生工生物技术有限公司)观察蛋白结合。

免疫荧光分析

在覆盖膜上培养的hela229单层细胞被感染c . muridarum菌株Nigg和处理抗体染色如上所述(19，20.)．感染细胞用2%多聚甲醛固定30分钟，用1%皂角苷(Sigma-Aldrich)在室温下渗透45分钟。堵塞后，赫斯特染色液(蓝色;使用生工生物技术有限公司)来可视化DNA。一种抗衣原体EBs和Cy2的兔属特异性抗体(绿色;Jackson免疫研究实验室，Inc.， West Grove, PA, USA)标记的山羊抗兔IgG二抗用于观察衣原体包裹体。各免疫组小鼠抗血清及Cy3(红色;Jackson免疫研究实验室，Inc.)偶联的山羊抗小鼠IgG二抗被用来可视化Pgp3抗原。所有图像均使用AX-70荧光显微镜(Olympus, Melville, NY, USA)获得。

IgG和IgG亚类的检测

Ultraviolet-inactivatedc . muridarum以EBs为抗原，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)监测小鼠抗血清中衣原体特异性IgG及其亚类。简单地说，96孔板(Thermo Labsystems, Franklin, MA, USA)涂上1µg EB /孔，并在4°C下保存一夜。2.5%乳汁阻断后，加入连续稀释的每只小鼠抗血清，37℃孵育1.5 h，加入hrp偶联山羊抗小鼠IgG (h +L)、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3二抗和ABTS (Sigma-Aldrich)底物，检测衣原体特异性IgG及亚类。在405nm处使用微板阅读器(BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)测量吸光度(OD)。

抗原特异性IFN-γ产生的检测

抗原特异性IFN-γ生产采用酶联免疫吸附测定，如前所述(21，22)．第三次免疫后20 d，每只小鼠(5只/组)制备脾细胞单细胞悬液接种(1 × 10⁶细胞/孔)进入96孔培养板，不加任何处理(培养基)，或每孔1μg不相关蛋白胎牛血清(BSA)，或uv灭活c . muridarumEBs在1 × 10⁶ifu /孔，或每孔1μg重组Pgp3(原生Pgp3)或热变性Pgp3。刺激72 h后，收集上清液，使用IFN-γ ELISA试剂盒(生工生物技术有限公司)进行评价。

小鼠泌尿生殖道感染和衣原体脱落的监测

末次免疫25天后，2.5 mg Depo-Provera/小鼠皮下注射，同步小鼠发情周期。5天后，每只小鼠阴道内灌喂2 × 10⁴的包体形成单元(ifu)c . muridarum．每4天取一次阴道拭子，直到感染后28天，监测小鼠下生殖道的衣原体脱落情况。如前所述，适当稀释每个拭子样本并用于感染HeLa 229单分子层(17，22)．培养24 h后，用免疫荧光法观察培养物中的包涵体，并在显微镜下计数。计算每个拭子的ifu总数并转换为log10，用log10个ifu报告每组小鼠在每个时间点的平均值±SD。

病理评价

攻毒后60天，处死所有小鼠进行病理评估。首先，检查整个生殖道，包括阴道、宫颈、子宫角、输卵管和卵巢，检查肿胀、炎症和粘连变化原位．在肉眼下，输卵管积水明显，严重程度评分见前文报道(17，23)．简单地说，每只小鼠的卵巢作为大小参考:0，无输卵管积水;1、输卵管积水可疑，不确定;2、输卵管积水清晰，大小小于卵巢;3、与子房大小相近;第四，比卵巢大。整个生殖道被隔离进行H&E染色，并由病理学家进行评估。镜下见子宫角及输卵管明显改变。采用双盲法分别对严重程度进行评分，评分标准如下。子宫角或输卵管扩张:0，无明显扩张; 1, mild dilation of a single cross-section; 2, one to three dilated cross-sections; 3, more than three dilated cross-sections; and 4, confluent pronounced dilation. Inflammatory cell infiltration (at the chronic stage of infection, the inflammatory cells that infiltrate are mainly mononuclear cells): 0, no significant infiltration; 1, infiltration at a single focus; 2, infiltration at two to four foci; 3, infiltration at more than four foci; and 4, confluent infiltration. The scores assigned to each mouse were used to report the mean ± SD of each group of mice.

统计分析

对三组数据进行方差分析。双尾学生的t以及通过使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad software, Inc.， La Jolla, CA)比较两组之间的均值。清除速度差异采用Wilcoxon秩和检验(spss20.0)，病理评分分级采用Kruskal-Wallis检验。采用卡方检验(Microsoft Excel)比较两组的发病率。＊p< 0.05和**p< 0.01为有统计学意义。

结果

Pgp3三聚体和变性单体的生成

先前有报道从原核表达系统纯化的重组Pgp3蛋白形成稳定的三聚体(13)．在本研究中，Pgp3在大肠杆菌作为gst标记的融合蛋白，并使用谷胱甘肽偶联琼脂糖珠纯化。使用精密蛋白酶去除GST标记。Pgp3蛋白在原生凝胶中迁移到~84 kDa，与三聚体Pgp3的分子量相对应(图1一个)．为了生成Pgp3单体，将重组Pgp3蛋白等分煮沸1,5或10分钟。正如预期的那样，在100°C下加热逐渐将Pgp3三聚体转变为单体。煮沸5min后，所有蛋白在原生凝胶中迁移至~28 kDa，与单体Pgp3的分子量相对应。煮沸10分钟后，所有蛋白质均被降解(图1一个)．因此，采用未经处理的原生Pgp3三聚体和5分钟热变性Pgp3单体进行后续疫苗接种实验。

Pgp3三聚体和单体免疫均诱导特异性抗体应答

为了确定Pgp3蛋白的构象是否影响特异性抗体的产生，从每组5只小鼠采集的血清使用天然凝胶-western印迹法进行评估。重组Pgp3经或不经1分钟或5分钟热处理作为抗原，用Pgp3三聚体(图1 b，面板a)或单体(图1 b，面板b)，但不仅仅是CpG (图1 b，面板c)诱导产生pgp3特异性抗体。有趣的是，三聚体免疫的小鼠血清对三聚体和单体Pgp3都有反应，但单体免疫的小鼠血清只识别单体Ppg3。这些结果表明，Pgp3三聚体同时包含构象表位和线性表位，线性表位可能在分子内部，而5min热变性单体失去构象表位，但暴露出线性表位。

确定Pgp3单体诱导的特异性抗体是否能够识别内源性Pgp3蛋白、HeLa单层感染c . muridarum采用免疫荧光法进行小鼠抗血清染色。如图2，内源性Pgp3仅在Pgp3三聚体免疫的小鼠血清中染色。c . muridarumELISA进一步定量了eb特异性抗体滴度，结果显示只有Pgp3三聚体免疫小鼠产生高滴度的抗eb总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3 (图3)．然而，Pgp3单体和CpG单独免疫的小鼠显示出最低水平的抗eb抗体。总的来说，这些观察结果表明，Pgp3三聚体和单体都具有免疫原性，但它们诱导不同的特异性抗体。只有Pgp3三聚体免疫小鼠的血清能识别内源性Pgp3，其位于宿主细胞胞浆、包涵体腔和衣原体EB表面。

Pgp3免疫诱导产生INF-γ

由于Th1标志细胞因子INF-γ对于清除衣原体感染至关重要，INF-γ水平已成为评估疫苗候选抗原保护效果的重要指标。在本研究中，每只小鼠(5只/组)的脾细胞被接种到培养皿中，并用不相关的培养基抗原BSA、EB、原生Pgp3或加热的Pgp3刺激。ELISA法检测IFN-γ的产生（图4)．与CpG单独免疫组相比，两种pgp3免疫组IFN-γ的分泌均显著升高。值得注意的是，当用EB或原生Pgp3重新刺激脾细胞时在体外在Pgp3三聚体免疫组中，IFN-γ的产生比Pgp3单体免疫组更强劲。

免疫小鼠感染后衣原体脱落动力学

为评价Pgp3构象结构是否可诱导保护性免疫，第一次免疫后60天，所有小鼠均接种i.vag。2 × 10⁴IFUs的c . muridarum．阴道衣原体脱落每4天监测一次，直到挑战后28天。虽然与CpG单独免疫的小鼠相比，Pgp3三聚体免疫的小鼠在第12、16、20和24天的活衣原体脱落显著减少，但在Pgp3单体免疫的小鼠中未观察到明显减少(图5)．此外，80%的Pgp3三聚体免疫小鼠在感染后第20天停止了衣原体脱落，所有小鼠在第24天显示出感染消退。相比之下，Pgp3单体和CpG单独免疫组中70%或更多的小鼠在第20天表现出阳性的衣原体脱落，这些组中50%的小鼠在第24天继续脱落(表1)．这些结果表明，只有Pgp3三聚体免疫可以加速小鼠下生殖道的衣原体清除。

Pgp3三聚体疫苗可减轻小鼠上生殖道病理

攻毒后第60天，处死所有小鼠进行病理评估。我们发现生殖道与周围的器官或组织没有粘附。肉眼观察阴道、宫颈、子宫角、卵巢均未见明显病变，但三组小鼠输卵管阻塞(输卵管积水)的严重程度差异较大。如表290%(60%双侧)的Pgp3单体-和80%(70%双侧)的CpG单独免疫小鼠发生输卵管积水。相比之下，Pgp3三聚体免疫小鼠双侧输卵管积水的发生率显著降低(20%)。总的来说，Pgp3单体或CpG单独免疫小鼠的20只输卵管中有15只(75%)发生输卵管积水，这明显高于Pgp3三聚体免疫小鼠的输卵管积水(20只中有7只;35%)。图示左侧和右侧完整的泌尿生殖道组织及相应放大的输卵管/卵巢(图6，补充图1)．我们使用评分系统半定量评估每个输卵管输卵管积水的严重程度。采用多样本Kruskal Wallis H检验比较三组输卵管积水严重程度评分，差异有统计学意义(H=12.503, p=0.002)。这一观察结果表明，Pgp3三聚体+ CpG免疫可减少输卵管积水的进展。在大体外观评估后，我们进一步用组织学切片在显微镜下评估炎症的严重程度(图6 b)．Pgp3三聚体+ CpG治疗小鼠输卵管组织炎症浸润和管腔扩张明显降低。这些结果表明，Pgp3的构象影响其保护作用。

讨论

在此之前，我们报道了重组Pgp3 + CpG佐剂免疫诱导的跨血清保护c . muridarum生殖道感染(17)．当Pgp3在受感染细胞中内源性表达或纯化时，其原生构象是同源三聚体的大肠杆菌表达系统。用SDS、尿素、煮沸或各种变性方法的组合处理将部分或全部Pgp3三聚体转化为单体(13)．为了评估Pgp3的构象结构是否可消耗以提供抗衣原体免疫，我们用重组Pgp3三聚体或热变性单体免疫小鼠。我们发现这两种免疫都能诱导特异性抗体的产生;然而，只有三聚体诱导的抗血清能识别内源性Pgp3，而三聚体诱导的eb特异性IFN-γ产量最高。重要的是，仅接种Pgp3三聚体即可显著缩短下生殖道衣原体脱落，减少上生殖道病理，且Pgp3三聚体的保护效果优于Pgp3单体。

为了评估蛋白质诱导的免疫保护是否与构象有关，应破坏蛋白质构象，但应保留初级结构(24)．沸水使大多数蛋白质变性通过氢键的破坏，导致二级和高级结构的丧失。然而，适度高温处理可能会使蛋白质保留初级结构，但过高温处理或处理时间过长可能导致蛋白质聚集，免疫原性消失(25)．根据我们以往的研究(13)，从细菌表达系统纯化的重组Pgp3是一种稳定的三聚体，用纯化的Pgp3蛋白培养的小鼠多克隆抗体可以识别天然和变性的Pgp3。为了监测Pgp3的寡聚状态，纯化后的Pgp3未经处理或煮沸处理，使用12%天然凝胶+ Western blot法分析(图1)．注意，未处理的Pgp3的迁移位置为~ 84 kDa(对应于三聚体Pgp3的分子质量)，而煮沸5分钟处理的Pgp3的迁移位置为~ 28 kDa(对应于Pgp3的单体形式)。此外，在煮沸5分钟后，小鼠抗Pgp3多克隆抗体识别天然和变性Pgp3不能检测任何Pgp3三聚体带，这表明加热5分钟将所有Pgp3三聚体转化为单体。然而，尚不清楚这种热变性单体是否具有免疫原性。为了证实这一点，我们评估了Ppg3单体免疫的特异性体液和细胞因子回忆反应。我们发现，在western blot检测中，单体诱导的小鼠抗血清能识别Pgp3单体，而CpG单独免疫的小鼠血清不能识别Pgp3单体，并且单体免疫小鼠的脾细胞IFN-γ生成水平在加热再刺激Pgp3后显著高于对照小鼠在体外．Chaganty等人还表明，将CPAF煮沸5分钟会导致酶活性的丧失(依赖于三级构象)，但线性表位没有改变(24)．在我们的研究中，高温处理破坏了构象结构，但保留了免疫原性，这与Chaganty等人的发现是一致的，尽管使用了不同的蛋白质免疫原。

Pgp3单体具有良好的免疫原性，但其诱导的体液和细胞因子免疫应答与Pgp3三聚体诱导的免疫应答有显著差异，这可能解释了其免疫保护效果的差异。Pgp3单体免疫后的小鼠抗血清western blot检测不能与三聚体化的Pgp3反应，也不能识别衣原体感染细胞内的内源性Pgp3，提示Pgp3单体诱导的抗体可能在宿主衣原体感染过程中不起作用。这与Kari的发现相一致，即Pgp3抗体与衣原体感染的根除相关，有效的疫苗需要Ppg3和其他衣原体免疫显性抗原以其原生构像传递(26)．然而，Tímea Mosolygó的衣原体气道感染小鼠模型显示，即使获得针对原生Pgp3的抗血清也不能减少小鼠肺部的衣原体数量(16)．Chaganty等人报道，接种热变性CPAF可诱导产生非常低水平的CPAF特异性抗体，但提供了与天然CPAF相当的保护，这表明对抗衣原体感染的特异性抗体的作用可以忽略不计(24)．

虽然特异性体液免疫反应在控制衣原体感染中的作用存在争议，但Th1细胞及其标志性细胞因子IFN-γ的作用已得到明确定义(27- - - - - -29)．Pgp3单体和三聚体的构象结构可能不同，但其一级氨基酸序列和线性表位是相同的，Th1细胞的激活依赖于抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)呈线性表位。因此，Pgp3单体和三聚体诱导的Th1细胞因子IFN-γ的产生预计是相同的，类似于热变性CPAF诱导的IFN-γ的产生水平与天然CPAF相当。不幸的是，EB或原生Pgp3再刺激在体外，单体组脾细胞IFN-γ水平明显低于三聚体组。对此，我们提出了三个可能的原因。首先，Pgp3三聚体比单体更复杂，可能提供更多的表位来刺激免疫系统。其次，Pgp3三聚体的c端结构域是与人类和啮齿动物TNF家族成员最接近的细菌同源物(10)，这可能在宿主细胞结合中起作用，并可能促进APC摄取Pgp3抗原并向Th1细胞提呈。第三，Pgp3三聚体可以与cathelicidin peptide LL-37结合并形成稳定的复合物，增强髓系细胞的促炎活性(30.)，可能刺激APC表达共刺激分子，改善抗原提呈。进一步研究Pgp3蛋白的重叠肽及其诱导的Abs和细胞因子反应的作用，以检查这些反应是否依赖于构象或APC激活状态，将是很有趣的。

Pgp3单体免疫不能预防泌尿生殖道衣原体感染。Pgp3三聚体免疫小鼠在第12天衣原体脱落减少，第20天清除增强，但Pgp3单体免疫小鼠表现出与CpG单独免疫小鼠相似的脱落时间过程和清除模式。此外，仅接种Pgp3三聚体疫苗可显著降低上生殖道病理。本研究使用了一个成熟的衣原体感染动物模型，Pgp3三聚体的保护功效与之前的观察结果一致(17)，证实了构象结构和构象表位在Ppg3疫苗保护中是不可或缺的。这一发现对设计以pgp3为基础的人用衣原体疫苗具有重要意义。首先，SDS和其他洗涤剂不应用于Pgp3制备，无论是来自细菌表达系统还是EB生物外膜复合物，因为Pgp3三聚体含有SDS-可接近的半胱氨酸残基(13)．第二，Pgp3沸腾1 min后，三聚体大量转化为单体;因此，在疫苗制备过程中不能使用高温。因此，低温储存和运输是必要的。第三，Pgp3必须处于原生构象中才能诱导高IFN-γ的产生，这表明多表位肽疫苗应该设计包含构象表位和线性表位的Pgp3小片段。最后，由于衣原体多亚基疫苗通常比单组分亚基疫苗提供更好的保护，并且Pgp3构象可能由c端75%氨基酸序列维持(10，31- - - - - -33)，测试是否组合亚基候选，如MOMP-Pgp3将是有趣的_C或CPAF-Pgp3_C，形成三聚体，并提供比相应的单亚单位疫苗更好的保护。

综上所述，本研究的结果，加上我们之前的研究结果，表明Pgp3是一种很有前途的候选疫苗，其保护效果对衣原体泌尿生殖道感染高度依赖于原生构象。我们的发现为Pgp3作为临床衣原体疫苗的开发提供了新的和重要的信息。

数据可用性声明

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中补充材料．进一步的查询可以联系通讯作者。

道德声明

该动物研究得到了华南大学动物使用与伦理委员会的审查和批准。

作者的贡献

构思并设计实验:CL。进行实验:BP, SZ, YH, QL，分析数据:CL, BP, CW, ZL, CY, AL，撰写论文:BP, CL。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

国家自然科学基金(81471969)、湖南省自然科学基金(2022JJ30505)、湖南省教育厅创新平台开放基金项目(20K108)、湖南省学生创新创业训练计划(湘交[2022]174号，项目编号S202210555244)资助。

致谢

谨向美国德克萨斯州圣安东尼奥市德克萨斯大学健康科学中心微生物学、免疫学和分子遗传学系的钟光明博士表示衷心的感谢，他为本研究提供了衣原体生物并提出了一些很好的建议。我们要感谢Editage (www.editage.com)进行英文编辑。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fimmu.2022.1018774/full#supplementary-material

参考文献