通过蛋白质组了解T细胞功能的新见解和挑战

简介

有效的免疫反应包括抗原特异性T细胞克隆扩增成效应细胞，这是适应性免疫的基础。这种反应的基础程序需要多种信号通路的联合作用，激活代谢通路和转录因子，启动一系列事件，导致细胞大小、增殖和分化的巨大变化。活化的T细胞至少可以在1-2天内体积增加一倍(1)．在这种变化之后，T细胞迅速增殖，每6-12小时翻一番(2)．进一步，取决于环境环境，抗原特异性CD4⁺T细胞可以分化成任何数量的辅助T谱系(即T_H1、T_H2, T_H17日,等等)。或者，抗原特异性CD8⁺T细胞可以扩展并发展成“效应体”和“记忆体”种群，随着感染的持续或清除，它们的寿命和效应体功能会有所不同。基因组学和转录组学技术的进步极大地提高了我们对免疫反应中T细胞转录调控的理解，在某些情况下，下降到单细胞水平(3.)．虽然在这些方面显然还有很多工作要做，但所有这些过程的核心是蛋白质合成。蛋白质是细胞的组成部分，也是遗传密码执行的基础。蛋白质表达通常由mRNA表达推断，但这些相关性并不总是准确的，它们也不能解释翻译后修饰(PTM)、细胞定位、裂解事件或各种异构体(4- - - - - -6)．因此，与基因组学和转录组学的最新进展相比，我们对免疫反应过程中T细胞蛋白质组的基本了解相当缺乏。重要的是，蛋白质结构、折叠或PTM状态的细微变化可能对我们的健康产生重大影响，这些变化可能无法在mRNA水平上观察到。因此，蛋白质可以是疾病的原因(如阿尔茨海默病)或治疗方法(即使用抗体作为治疗方法)。在这篇综述中，我们描述了我们目前研究T细胞中蛋白质的技术工具箱，蛋白质组学的重要性，以及最近的研究，这些研究使我们更好地理解了T细胞激活和获得效应功能期间蛋白质景观是如何变化的。我们还讨论了蛋白质组学的技术进步，以及未来需要扩展我们目前对T细胞蛋白质组学的知识，使其成为T细胞生物学的更主流应用。

免疫学家目前用来测量蛋白质的工具箱

免疫学家利用多种技术来分析T细胞中的蛋白质，有些技术可以精确到单细胞水平。蛋白质分析技术包括但不限于酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学、western blotting、流式细胞术技术，以及通过测序(CITE-seq)对转录组和表位进行细胞索引。ELISA、免疫组织化学和western blotting是低通量技术，依赖于特异性抗体的可用性，但抗体价格昂贵，而且受限于它们探测的抗原数量。酶联免疫吸附法可以一次检测一个因子，也可以多重检测(如Luminex技术)，但这些检测方法成本很高。单细胞western blotting (scWesterns)应用于几年前被引入，并能够在显微镜载玻片上测量细胞间的异质性(7)．然而，这种方法也是低通量的，并且受限于你感兴趣的蛋白质可用的抗体数量。

一些基于流式细胞术的技术已经发展到能够在单细胞水平上定量蛋白质。传统的流式细胞术，也称为多色细胞术，依赖于一系列带通滤波器来分离一个小的光谱窗口，有利于被分析的特定荧光团。基于此方法最多可定义30个子集(8)．光谱流式细胞术的引入扩大了传统多色流式细胞术的局限性，能够可视化免疫细胞上多达40个参数(8)．细胞术飞行时间(CyTOF)是流式细胞术的一种变体，其中抗体用重金属离子标记代替荧光团(9)．CyTOF是一种强大的工具，可以同时可视化多达60个单独参数来量化标记的目标，特别适用于样本有限的免疫群体的深入分析。CyTOF在艾滋病毒和癌症患者的T细胞衰竭状态的多样化亚群中特别有用(10)．CyTOF还与代谢分析结合使用，以确定人类naïve和记忆细胞毒性T细胞的代谢状态，以建立对T细胞功能状态的更可靠的理解(11)．与其他方法结合使用，CyTOF以及其他基于流式细胞术的技术使我们对正常和疾病状态下的T细胞生物学有了重要的机制洞察。然而，就像上面概述的技术一样，这些方法受限于对你感兴趣的蛋白质的抗体的可用性和每个样品可以分析的参数的数量。

CITE-seq是最近描述的一种在单细胞水平上同时测量RNA和蛋白质转录物的方法。CITE-seq使用寡核苷酸标记抗体的组合，将蛋白质分析与单细胞液滴RNA测序相结合，以整理每个细胞存在的RNA水平和抗体数量(作为蛋白质水平的代理)。每个细胞可以使用多个抗体来获得表面蛋白质的定性和定量信息。这种方法最近被用于描述免疫细胞中与年龄相关的变化。使用这种方法，本研究的作者确定了与年龄相关的CD8亚群⁺具有T细胞衰竭和组织归巢特征的T细胞(12)，这表明这些细胞可能是年龄相关免疫功能障碍的潜在靶点。另一项研究使用CITE-seq与TCR测序的组合来识别CD4的新抗原反应性T细胞特征⁺和CD8⁺T细胞在非小细胞癌中的作用(13)．这种方法可以快速识别新抗原反应性TCRs，并通过改造患者的新抗原特异性T细胞来加快个性化医疗。最后，使用CyTOF、CITE-seq和scRNA-seq的组合来解决心血管疾病(CVD)患者动脉粥样硬化斑块中的免疫多样性，本研究的作者发现CD4的显著多样性⁺T细胞亚群。作者鉴定出T细胞亚群被激活，一些分化，而一些表达衰竭的标记(14)．从这些技术产生的数据可能使设计更精确的CVD疗法成为可能。这些方法非常有用，特别是结合使用时。虽然它们明显优于单独使用单细胞RNA-seq，类似于基于流式细胞术的方法，但CITE-seq受到可用于细胞检测的标记物数量的限制。这些方法是令人难以置信的强大系统，可以询问T细胞的功能，但它们不能提供蛋白质表达的整体概述或细胞群在响应各种刺激时的变化。需要为该可视化实现其他方法。

蛋白质组学

在生物系统的研究中，我们有基因组学、转录组学和蛋白质组学。蛋白质组学最基本的形式是研究蛋白质，特别是不同蛋白质之间如何相互作用。蛋白质组学存在多个子类，目的是扩大我们对细胞或目标组织内蛋白质组成的理解:表达蛋白质组学-对样本之间蛋白质的定量研究;功能蛋白质组学-评估蛋白质-蛋白质相互作用，阐明生物功能;结构蛋白质组学-在全基因组范围内确定三维蛋白质结构;化学蛋白质组学-蛋白质-小分子相互作用的评估。虽然有多种技术可以测量细胞中蛋白质/蛋白质的相互作用，质谱(质谱，MS)是这些应用的核心之一。它是一个全面的工具，不仅能够识别蛋白质，而且还能定量和定性地描述蛋白质结构、蛋白质异构体、蛋白质翻译后修饰(PTMs)和蛋白质-蛋白质相互作用。质谱也是鉴定脂质种类和代谢物的有力工具。虽然所有的亚类和物种鉴定都值得深入讨论，但为了本综述的目的，我们将重点放在表达蛋白质组学和蛋白质鉴定上。

质谱法主要使用两种主要的工作流程方法来识别蛋白质:自下而上的方法，也称为“鸟枪”蛋白质组学，以及自上而下的方法。传统的自下而上蛋白质组学包括胰酶消化蛋白质，使其转化为适合于通过高效液相色谱(HPLC)、电离和串联质谱测序进行分离的肽。蛋白质被消化成长度为5-20个氨基酸的肽(15)．另外，如果样品在电离之前已用化学物质处理以分离化合物，则可用液相色谱-质谱联用(16)．由于高性能仪器、浓缩工具的改进、高分辨率质谱仪的可用性以及创新的数据采集方法，自下而上的蛋白质组学已经成为一种常规程序。然而，由于蛋白质被消化成小肽，敏感性可能会受到影响(17，18)．例如，在单个蛋白质中绘制PTMs、截断、突变和多态性的能力受到多肽分析的限制，经常留下空白和模糊的上下文(19)．肽质量使用搜索引擎(包括Mascot或Sequest)与已知的数据库进行关联，如果数据库不完整或氨基酸具有相同的质量(即亮氨酸和异亮氨酸)，则只能识别有限数量的片段。

自上而下蛋白质组学是一种描述和鉴定完整蛋白质的方法。这种方法有其独特的优势，也有其自身的挑战。最引人注目的优势是，它有可能量化完整的蛋白质及其修饰，包括PTMs。然而，由于仪器的限制，这种方法的灵敏度大约比自下而上的MS低100倍(15)，由于难以产生蛋白质的气相碎裂(15)．此外，这些低丰度的蛋白质，包括转录因子，也可能会错过使用该方法。尽管如此，这项技术提供了映射蛋白质序列和定位每个蛋白质上的多个PTMs的潜力，提供了细胞中蛋白质的全面概述(19)．使用自下而上和自上而下的质谱，最近的蛋白质组学研究提供了对人类和小鼠T细胞功能的前所未有的见解。

应用蛋白质组学研究T细胞功能

转录谱分析和下游网络分析有助于我们理解T细胞在免疫系统中的功能。然而，T细胞激活是动态的，诱导一系列信号事件，不能仅通过转录组学捕获。这些事件包括快速蛋白质翻译，PTMs和细胞代谢的变化，所有这些都是T细胞激活和功能的关键调节因子。质谱技术的最新进展，使用串联质量标签(TMT)等技术，实现了样品多路复用，支持从多个样品或组织中鉴定和定量蛋白质。使用这种方法，一组研究人员开始捕捉关键的T细胞激活事件，通过使用抗cd3和抗cd28激活naïve小鼠T细胞2、8和16小时，并对这些细胞进行全蛋白质组分析和磷蛋白质组分析(20.)．与他们最初的假设一致，TCR信号通路诱导的蛋白质组和转录组之间存在弱相关性，mRNA表达明显滞后于蛋白质表达的变化。TCR信号导致不同的激活阶段。初始TCR激活导致磷酸化事件的快速诱导(2h内)，总体蛋白质丰度变化有限(早期)。在8-16h(晚期)之间，蛋白质组和磷酸化蛋白质组发生了广泛的重编程，导致蛋白质翻译和线粒体/代谢功能的改变。综合分析管道的应用导致了naïve T细胞从静止到激活的预测，包括dna损伤反应和MAPK信号通路的下调。这项研究确定了参与退出T细胞静止的分子电路，这对T细胞的维持和生存具有重要意义。重要的是，如果没有全球蛋白质组学和磷蛋白质组学分析，这种T细胞电路是不可能建立的。

显然，PTMs在调节T细胞活化和下游反应中发挥着重要作用。然而，在磷酸化之外还有许多pms可以影响T细胞的激活，包括泛素化。泛素可在TCR-CD28接合后调节蛋白质的丰度和活性(21- - - - - -23)．泛素与赖氨酸残基共价连接，通常与蛋白酶体或溶酶体降解有关，大多数报道将泛素介导的降解与t细胞激活调控联系在一起(24)．然而，越来越多的证据表明泛素化的非降解结果影响T细胞信号转导反应，包括PI3K的p85亚基的泛素化影响其招募到CD28和TCRζ (25)．因此，一组对初级小鼠CD4进行了蛋白质组学和转录组学研究⁺建立泛素化的降解vs.非降解结果(26)．该小组在初级CD4细胞中鉴定出5500个蛋白质⁺T细胞。与Tan等人的发现相似，tcr诱导的转录变化与蛋白质丰度相关性不高(20.，26)．为了探究泛素化事件，他们设计了一种使用二甘氨酸残基分析的方法。二甘氨酸残基是泛素与赖氨酸底物结合时发生的裂解事件。这产生了一个泛素残余，可以与抗体富集，并进行质谱分析。使用这种方法，大约1200底物的泛素化CD4⁺T细胞的鉴定有助于确定T细胞活化驱动降解和非降解的泛素化。发生泛素介导降解事件的蛋白包括NFKB1、ZAP-70和LAT。相比之下，泛素化但未降解的蛋白质包括cd3 ε， CD3γ， CDC42, RAC1, RHOA和GRAP。结合全细胞蛋白质组学、二甘氨酸残基分析和转录组学，该小组建立了一个框架来预测休息和刺激CD4中依赖tcr刺激的泛素化事件⁺T细胞。这项研究为探究非降解性tcr依赖的泛素化事件及其对T细胞激活和功能的影响提供了宝贵的资源，这是仅通过基因组和转录组技术无法获得的资源。

转录因子的翻译后修饰在转录因子的功能中起着关键作用。然而，识别这些ptm具有挑战性。在这方面，蛋白质组学在识别关键PTMs方面发挥了重要作用。免疫沉淀rt γ T的质谱分析_H17个细胞鉴定出两个重要的T细胞磷酸化位点_H17 .细胞发育;其中一个磷酸化位点对T细胞至关重要_H17种细胞发育，而另一种抑制它(27)．另一项单独的研究发现，RORγt上的几个乙酰化位点被Sirtuin 1 (SIRT1)去乙酰化，促进自身免疫(28)．定量磷酸化蛋白质组学已用于描述T细胞IL-23信号通路_H17格(29)．这些研究的数据确定了168个磷酸化位点通过IL-23信号通路导致肌球蛋白调节轻链(pRLC-S20)的磷酸化，肌动球蛋白细胞骨架收缩和细胞迁移的关键调节因子。他们的研究揭示了IL-23在调节细胞运动中的关键作用。另一组研究人员使用高分辨率磷蛋白组质谱法鉴定细胞毒性CD8中il -2介导的磷酸化事件⁺T细胞(30.)．IL-2对CD4和CD4细胞的克隆扩增至关重要⁺和CD8⁺T细胞，但在这项研究之前，对IL-2信号的全球了解是缺乏的。利用磷酸化蛋白组学，作者对il -2调控的磷酸化蛋白组进行了全面的描述，揭示了ctl中src家族激酶控制的磷酸化网络和IL-2-JAK信号调控的单独协调磷酸化级联。具体来说，他们发现SRC激酶调节CTL磷酸化蛋白组的一个很大的组成部分，控制不同于其他il -2- jak1 /3介导的事件。SRC激酶需要维持关键代谢激酶的活性，包括mTORC1和AKT，而IL-2-JAK信号协调转录因子磷酸化、染色质调节因子、mRNA翻译、GTPases等。这些数据揭示了ctl中蛋白质磷酸化的复杂性，并确定了未来鉴定细胞磷酸化动力学的工作是为了确定信号通路是如何协调调节的。最后，从T调节细胞(Tregs)中纯化的Foxp3复合物的生化和质谱分析显示，Foxp3存在于400-800kDa或更大的多蛋白异质复合物中(31)．鉴定出350多个相关蛋白，其中许多与转录有关，包括Cbfb、Bcl11b、Ikzf3和Chd4。有趣的是，Foxp3结合并调节了许多作为其辅助因子的基因，包括Runx、NFAT和GATA-3。GATA-3在Treg功能和稳态中发挥作用(32，33)，质谱分析证实了这种调节作用，并进一步确定了Foxp3和GATA-3共同调节的一个基因子集，对Treg细胞的命运和功能至关重要，包括Ets2，Satb1,Klf3．这些研究是基于质谱的蛋白质组学如何识别关键T细胞调节事件并帮助理解T细胞生物学的明确例子。

哺乳动物细胞(包括T细胞)中的蛋白质周转受到多种细胞过程的调控，其中哺乳动物雷帕霉素复合物1靶点(mTORC1)发挥着重要作用(34)．由于对其在T细胞蛋白质水平上的功能的基本分子理解尚未建立，一个小组使用定量质谱来比较CD4⁺与CD8⁺抗原相遇时T细胞蛋白质组重组以确定mTORC1如何调节这些事件(1)．超过9000个蛋白质被鉴定出来，证明了环境信号通路如何与抗原和细胞因子信号通路相结合，以确保特定和适当的免疫反应。作者发现了CD4之间的关键差异⁺和CD8⁺T细胞，包括CD8⁺T细胞的氨基酸转运体SLC1A5比CD4增加了10倍⁺T细胞。他们还发现CD8⁺T细胞还具有更高浓度的蛋白质翻译机制和营养转运蛋白，这可能解释了它们增强的增殖能力。而mTORC1与CD4无明显差异⁺和CD8⁺T细胞，naïve CD4⁺T细胞对mTORC1有独特的依赖性，特别是在细胞周期调节方面。这个研究小组使用了类似的方法来更好地理解转录因子Myc如何控制CD4⁺和CD8⁺通过TCR刺激后的T细胞活化和代谢(35)．本文的数据表明，Myc控制T细胞中的蛋白质组重组，调节对T细胞生物能量和细胞正常生长和发育所需的生物合成程序至关重要的氨基酸转运蛋白。虽然在T细胞代谢过程中发现了Myc依赖和独立的功能，但氨基酸转运蛋白的上调是维持T细胞中Myc表达的前馈循环的一部分。这些数据阐明了为什么Myc对特定的T细胞代谢功能如此重要，包括谷氨酰胺代谢和糖酵解。为了进一步研究T细胞的代谢调节，在另一项研究中，该小组使用高分辨率质谱来绘制CTL的蛋白质组，以更好地了解CTL功能中的mTORC1和mTORC2活性(36)．作者在ctl中绘制了约6800个蛋白质的图谱，发现ctl具有较高的mTORC1活性，在ctl中比mTORC2发挥主导作用。尽管如此，只有一小部分CTL蛋白质组是由mTORC1活性控制的;mTORC1控制代谢、效应和粘附分子的表达。当比较CTL转录组和蛋白质组时，他们发现mRNA和蛋白质丰度之间不一致。例如，虽然T-bet和eomesdermin (EOMES)的mRNA表达在ctl中具有可比性，但T-bet蛋白表达明显高于EOMES。IL-2受体的mRNA和蛋白表达也存在显著差异。mRNA对受体链(α:β:γ)的化学计量比为3:1:2，而蛋白质对受体链的化学计量比为92:1:2。此外，通过使用mTORC1和mTORC2抑制剂，本研究证明了无偏倚蛋白质组学在理解药物在细胞中的作用方面的力量。总的来说，这些研究强调了蛋白质含量的定量非靶向分析在理解T细胞功能和代谢调节方面的力量。

与小鼠研究相比，人类T细胞蛋白质组学研究更令人困惑。例如，与小鼠研究不同，蛋白质组学和转录组学数据之间有很强的相关性，这取决于评估的细胞类型和时间点。一组使用蛋白质组学和转录组学的组合来研究细胞因子对人类naïve (T_N)和记忆(T_米) CD4⁺为了更好地理解记忆细胞中的细胞因子反应，在这一点上还没有深入研究(37)．T_N和T_米细胞向四种不同的CD4细胞极化⁺T辅助子类型(T_H1、T_H2, T_H17和iTreg)，分别于激活后16小时和5天收集，并进行蛋白质组学和转录组学分析。与小鼠研究相似，作者发现在初始T细胞激活期间，蛋白质组和转录组之间存在差异。然而，在初始激活的下游，RNA和蛋白质表达在所有评估人群中都有高度相关性。一个令人惊讶的发现是T_N可以分化成任何辅助T种群，T_米细胞无法获得T_H2表型。有趣的是,T_米获得T_H17种表型对iTreg信号的响应，可能是由于依赖TGFβ信号(38)．当与转录组学结合使用时，蛋白质组学揭示了T细胞从naïve到中央记忆到效应记忆T细胞表型的进展。进展伴随着效应分子表达的增加，从而增强了对来自环境的激活和细胞因子信号的响应性。

在另一项研究中，对人类T细胞蛋白组和转录组的评价_H17个单元格显示数据集之间高度相关(39)．然而，当与相应的已发布的鼠标数据集(40)，作者发现人类和小鼠T蛋白表达之间的重叠很少_H17细胞。这种差异可能是由于作者只比较了他们的人类T_H17个数据到一个鼠标数据时间点。另外，激活条件也可能影响整个蛋白质组。Revu等人最近发表的一篇论文表明，抗cd28信号在人T细胞中并不必需_H细胞发育体外实验(41)．相反，IL-23信号作为第二个信号就足够了，这些细胞产生的IL-17A数量比传统的人T细胞更多_H17在体外分化条件下，量与小鼠T比较一致_H17细胞。在这项特殊的研究中，尚不清楚IL-17A在人T细胞中表达的程度_H17个细胞相对于小鼠T中表达的~45% IL-17A_H将17个细胞与(40)．此外，作者发现关键T蛋白几乎没有上调_H17种蛋白质，包括IL-17A, IL-17F和RORγt_H17个细胞，表明分化可能并不理想。虽然在小鼠和人类样本之间进行平行研究以了解所进行工作的翻译方面很重要，但在比较数据集时，特别是在两个物种之间，在解释数据时应谨慎。不仅要验证细胞类型，它们的激活和分化状态也应具有可比性，以便进行公平和准确的比较。

还有其他明确的例子表明蛋白质组和转录组数据集之间的差异，这不可避免地定义了独特的T细胞亚群和特征。一个例子来自于一项研究，该研究旨在解决人类Foxp3如何⁺T调节(Tregs)细胞抵抗T效应细胞或传统细胞的获取。作者结合蛋白质组学和转录组学对人类血液来源naïve CD4⁺T细胞和效应体treg (eTregs)，并鉴定出功能不同的Foxp3⁺CD4⁺人类血液中的T细胞，定义了一个共同的Treg签名，和一个特定的效应Treg (eTregs) (42)．这些特征包括参与不同细胞功能的蛋白质。常见的Treg特征包括Foxp3、Helios、代谢蛋白(GK、SHMT2)、铁储存蛋白和溶酶体蛋白。eTreg特征包括参与细胞凋亡、有丝分裂、DNA复制等的蛋白(42)．与小鼠样本所描述的相似，定义的蛋白质组Treg签名与转录组签名几乎没有重叠。作者假设这种差异可能是由于treg的细胞状态(即稳态vs.激活)，因为mRNA的稳定性可能是一个问题(43)．在需要蛋白质合成的循环细胞中，这些差异可能不太明显。无论如何，Treg签名不能仅根据转录组学来预测。总的来说，这些研究表明需要仔细分析和解释T细胞中的蛋白质组学数据，并考虑细胞状态和/或将这种方法与转录组学数据结合起来，以生成T细胞的完整视图。

蛋白质组学的挑战和未来展望:单细胞质谱分析及其他

虽然蛋白质组学是一个强大的系统，但它也面临着阻碍其成为主流应用的挑战。蛋白质组学不像基因组学和基于转录组学的方法，在这些方法中人们可以快速测序数千个基因，蛋白质组学的通量没有那么高。此外，基因组学和转录组学工作的核心基础设施比蛋白质组学核心先进得多。例如，蛋白质组学涉及的样本处理、仪器仪表和分离科学并不像基因组学那样主流。数据分析在技术上也有很高的要求，需要一定水平的专业知识，而这些专业知识通常只有在定期执行蛋白质组学的学术实验室才能找到。因此，非常需要开发用于数据分析的管道，以避免这个问题。也许可以从将目前用于转录组学的管道改造为蛋白质组学开始。

除了这些限制之外，还有一些基本问题阻碍了蛋白质组学的主流应用。例如，与RNA和DNA不同，蛋白质不能被放大，因此低丰度的蛋白质，包括转录因子，经常被遗漏。另一个挑战是数据稀疏。理论上，所有的多肽都应该被质谱仪“读取”。然而，这并不总是如此，蛋白质组的完全覆盖是不可能获得的。样本数量是使蛋白质组学成为主流的另一个障碍。单细胞rna测序(scRNA-seq)、转座酶-可达染色质检测(ATAC)-seq和CUT&RUN的出现使对少量细胞的询问能够解决生物学问题。这些检测需要的细胞数量很少，在试图确定某些细胞类型如何导致疾病时特别有用。然而，目前蛋白质组学所需的细胞数量远远超过了scRNA-seq等分析方法，限制了我们的询问能力体外从疾病小鼠模型中分离出T细胞。最后，虽然磷酸蛋白组学的方法学有了显著的进步，但有多种类型的PTMs调节细胞功能，包括sumo化和糖基化。此外，为了更好地理解细胞中的分子信号事件，需要更深入地了解pms的亚细胞定位，直至细胞器水平。虽然已经开发了几种方法来尝试这样做，包括酶接近标记方法，如APEX/APEX2 (44，45)及BioID/TurboID (46- - - - - -48)，但它们也有需要注意的地方。APEX利用过氧化氢可以影响细胞代谢，因此，PTM状态(49)．TurboID和类似的方法受到内源性蛋白的普遍生物素化的影响，不仅产生了对细胞内PTMs的过度估计，而且还可能导致细胞毒性和正常细胞反应的扰动(50)．解笼辅助生物素化和磷酸化蛋白组定位的研究进展(51)可能有助于缓解这些乱交和毒性问题。然而，很明显，我们需要更好的方法来检查PTMs，无论是在全球范围内还是在细胞器水平上，以更好地了解它们如何影响T细胞功能。

虽然测量蛋白质丰度的变化对于理解细胞命运的决定至关重要，但蛋白质的结构重塑同样重要。有几种方法可以在原子水平上测量蛋白质结构，但很少有方法可以直接观察功能细胞中的蛋白质结构。最近的发展已经开始解决这个问题。AlphaFold是一种人工智能(AI)系统，可以根据蛋白质的一维氨基酸序列预测蛋白质的三维结构，它的发布大大提高了我们对静态蛋白质结构的理解(52)．然而，该软件仍然存在一些局限性(即无序的蛋白质区域无法精确解析)，所提出的结构仍然需要验证，蛋白质不是静态的，而是始终处于运动状态。然而，该软件可以预测生物学见解，并为可以通过实验测试的活细胞中蛋白质功能和相互作用的假设驱动研究提供燃料。使用像有限蛋白水解耦合质谱(LiP-MS)这样的方法，可以在蛋白质组范围内识别其生物背景下的蛋白质结构变化，这比AlphaFold高出了一步，可以观察结构变化。这种方法背后的想法是，蛋白质结构中的残基可能被ptm、与其他分子或蛋白质的其他部分的相互作用所屏蔽。利用定时蛋白水解消化，产生反映蛋白质/结构可达性的多肽，再加上质谱，人们可以在复杂的生物环境中预测蛋白质结构(53，54)．这些方法可以潜在地用于补充蛋白质丰度读数，以最大限度地检测细胞生物学状态的变化。无论如何，方法灵敏度和数据分析管道的进步，类似于为基于基因组学的研究开发的深度机器学习算法，都需要推进结构蛋白质组学，并揭示对功能的重要见解，帮助揭示质谱计产生的肽/肽片段数据中的“隐藏”信息。

虽然仍处于起步阶段，但最近仪器和方法的进步已经能够使用质谱法测量单个细胞中的脂质、蛋白质和小分子(55)．（表1；图1)微流控芯片系统的实现，使反应在小体积内发生，大大加快了这一方法的发展。ProteoCHIP和nanodroplet processing in one pot for trace sample (nanoPOTS)就是两种这样的设计(61，68)．例如，nanoPOTS使用基于芯片的纳米液滴处理平台来增强小细胞群体的蛋白质组学处理和样本分析。nanoPOTS减少了处理体积(<200nL，从数百微升下降)，同时保持了被认为是最佳批量蛋白质组样品制备所必需的参数。减少处理样品体积使样品的吸收损失最小化，这在以前是样品制备过程中损失的瓶颈。使用nanoPOTS，该小组能够从大约10-100个细胞或临床样本中实现3000多种蛋白质的可重复性覆盖。具体来说，他们能够从1型糖尿病患者和健康对照组的单个人胰岛横截面中量化约2400个蛋白质，这些蛋白质是通过激光显微解剖分离出来的。61)．作者指出，他们的平台可以与细胞排序接口通过流式细胞仪，这将是一个理想的工作流程，免疫学家希望进行类似的实验。在此平台上进行优化，另一个小组开发了一种“一体化”的单细胞蛋白质组学样本制备和数据采集系统，称为SciProChIP-DIA。该方法可在单个设备中复用样品，自动化细胞分离、制备、细胞计数、成像和样品处理，并结合数据独立采集质谱方法。从本质上讲，他们为低输入样本开发了一个完全自动化的工作流程，最大限度地减少样本损失，同时实现高再现性和灵敏度。使用这种自动化方法，研究人员能够在每个细胞中描述多达1500种蛋白质，在人类腺癌细胞(PC-9)和慢性B细胞白血病细胞(MEC-1)中错误发现率为1% (69)．与其他使用单细胞蛋白质组分析的研究相比，SciProChIP-DIA显示出比其他测试(包括nanoPOTS)更敏感的覆盖范围。作者假设SciProChIP-DIA是通用的和可扩展的，以适应各种应用，包括研究细胞刺激后动态蛋白质组学的改变。

Mann实验室的最新进展已经突破了单细胞质谱的界限。在最近的一篇文章中，他们强调了一种名为深度视觉蛋白质组学(DVP)的新技术(66)．该方法将成像技术与无偏蛋白质组学相结合，以量化细胞中表达的蛋白质的数量，绘制组织或细胞类型的特定蛋白质组，或识别细胞中的药物靶点。利用这种方法，他们利用自动化单细胞激光显微解剖结合超高灵敏度质谱技术，发现了黑色素瘤进展中的细胞表型和异常通路。该系统适用于任何可以成像的生物系统，类似于最近描述的另一种应用，称为FUNpro (65)．FUNpro还使用基于显微镜的方法，结合SCOPE-MS，执行功能性单细胞蛋白质组分析，以便将蛋白质组与细胞表型联系起来。这两种方法都可以识别和描述罕见的细胞状态和相互作用。曼恩实验室最近还开发了一种工作流程，使单细胞蛋白质组学具有更高的灵敏度。使用facs分离的细胞，他们将单个细胞逐个注入质谱，他们称之为真正的单细胞衍生蛋白质组学(T-SCP) (67)．使用他们改进的自动化工作流程，他们证明了比以前的方法提高了两个数量级的灵敏度，并能够解剖癌细胞(HeLa细胞)中的细胞周期阻滞状态。这些工作提高了scMS的灵敏度。不幸的是，这些研究大多是使用从固定组织中分离出来的细胞系或细胞进行的。未来的工作将需要对原代细胞(包括T细胞)的单细胞蛋白质组学进行研究，这些细胞来自新分离的离体样本(即小鼠或pbmc)，以生成最可靠的蛋白质组学图景可视化在活的有机体内．

考虑到方法之间的敏感性，单细胞蛋白质组学倾向于使用“自下而上”的方法来识别蛋白质，而不是寻找完整的蛋白质。（图1因此，改进的关键挑战与上述相似，包括分析物的覆盖范围和分析物表征的深度。无论如何，单细胞质谱技术的进步在过去5年里已经迅速提高。55)．如果这一速度继续下去，人们可以设想在更常规的基础上使用这种技术来解决问题，以更好地了解肿瘤中的T细胞异质性和耗竭。这些知识可以为免疫肿瘤学确定新的治疗方法。单细胞质谱也可以用来更好地了解自反应T细胞中蛋白质水平失调的事件，这些事件不太可能仅通过转录组学捕获。就像癌症疗法一样，这一信息可能会为各种自身免疫性疾病带来潜在的新治疗方案。无论如何，使用蛋白质组学，无论是在大量还是在单细胞水平，是必要的，以描述正常和异常激活T细胞的分子特征，目前缺乏的信息，但显然需要进一步推进我们对生物学和疾病机制的理解。

作者的贡献

LS收集了所有相关的资料和文章，撰写、编辑和修改了手稿。

资金

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款号R21AI164722和R01CA241816的支持。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

出版商的注意

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参考文献