肺分枝杆菌感染患者循环线粒体细胞游离DNA动态:一种新型疾病生物标志物的潜力

简介

估计有一千万人感染了结核分枝杆菌(MTB)每年发展为活动性肺结核(1)，而多达三分之一的人口在任何时候都有潜伏性结核感染(LTBI)，其中5-10%的人终身有发展为PTB的风险(2)．慢性结核感染、亚临床结核和活动性结核病构成结核分枝杆菌感染的范围。能够识别结核分枝杆菌患者，区分LTBI与结核分枝杆菌和其他分枝杆菌感染，并验证治疗成功，对于个体患者的结果和预防结核分枝杆菌传播给他人都是关键。MTB痰培养阳性是结核病诊断的主要参考标准之一，正如加强期治疗2个月后痰培养阳性转阴性被认为是治疗疗效的参考指标。然而，MTB培养物的缓慢生长导致了严重的诊断延迟，使得评估痰培养转化既费时又费力。易于测量的宿主炎症生物标志物可将PTB与其他诊断区分开来，或可用于支持结核病治疗反应的评估，这将是革命性的(3.)．c反应蛋白(CRP)水平和血液单核细胞/淋巴细胞比率(MLR)可能有助于在高危人群中识别PTB，两者在治疗期间都有所下降，但它们的变化对2个月时痰培养转化的预测能力较差(3.- - - - - -8)．干扰素-γ释放试验(IGRA)测量干扰素-γ对mtb特异性抗原的反应，并用于识别LTBI个体，然而，它们不能用于可靠地区分LTBI与PTB，也不能用于监测对治疗的反应(9，10)．

游离细胞DNA (cfDNA)是血液中循环的DNA片段，由活细胞主动分泌或由死亡细胞、被破坏的微生物和其他病原体(11，12)．对cfDNA作为改变生理和致病状态的生物标志物的兴趣，促使研究其在怀孕和器官移植监测和癌症诊断中的诊断价值(13- - - - - -15)．宿主源性cfDNA水平升高也可预测感染的不良预后(16- - - - - -18)．核cfDNA (Nu-cfDNA)和线粒体cfDNA (Mt-cfDNA)都是宿主源性cfDNA，前者来源于细胞核，后者来源于分布在细胞内细胞质中的线粒体。它们可由活化的炎症细胞释放，感染期间只有Mt-cfDNA可由血小板释放(19，20.)．研究表明，脓毒症患者血浆Nu-cfDNA和Mt-cfDNA水平与疾病严重程度和死亡率相关(18，21，22)．先前的研究也表明，在hiv阳性个体中，患有结核病和严重炎症的人血浆Mt-cfDNA水平高于没有疾病的人(23)．Wiens等人。报道称，被毒性更强的结核分枝杆菌感染的巨噬细胞向细胞质中释放了更多的线粒体DNA，这表明线粒体DNA可能是表明结核中先天免疫反应的生物标志物(24)．研究还表明MTB可引起巨噬细胞线粒体损伤，导致线粒体DNA的释放(25)．然而，尚不清楚炎症细胞向细胞外空间释放Mt-cfDNA是否与MTB负担有关，也不清楚LTBI或PTB和其他肺部分枝杆菌疾病观察到的Mt-cfDNA水平是否不同。目前还不清楚在结核病得到有效治疗后，结核病诊断时Mt-cfDNA水平升高是否会恢复到基线水平。

我们假设血浆Mt-cfDNA与结核分枝杆菌负担和炎症反应有关。为了探索这些想法，我们a)检查了培养阳性和非培养阳性PTB患者血浆Mt-cfDNA水平之间的关系;b)评估PTB治疗期间血浆Mt-cfDNA水平的变化;c)评估Mt-cfDNA水平对治疗两个月后痰液转化失败的潜在预测价值。最后，我们测量了MTB早期分泌抗原靶(ESAT)-6抗原刺激的细胞系上清液中Mt-cfDNA的水平，以开发MTB对巨噬细胞释放Mt-cfDNA的致病作用的潜在支持证据。

方法

研究设计与入组

这项前瞻性观察性研究于2018年6月至2021年8月在台湾台北市台北退伍军人总医院进行。队列由LTBI、PTB和非结核分枝杆菌肺病(NTM-LD)患者组成。如果1)呼吸道样本MTB培养阳性或2)培养阴性，但肺活检显示相容的病理结果并检测出MTB特异性阳性，则纳入患有PTB的成人门诊患者IS6110基因(6)．在过去6个月内与另一名PTB患者有密切接触史的无症状患者(在入组前)被纳入，如果他们胸片正常且igra阳性，表明LTBI (26)．作为比较，如果NTM- ld患者呼吸样本中NTM培养呈阳性，且符合NTM- ld活动性疾病诊断标准(27，28)．排除标准为:1)在入组时检测的PTB患者和通过回顾索赔数据评估的NTM-LD患者中的HIV感染，2)伴有活动性癌症，3)MTB和NTM-LD混合感染。获得参与者的书面知情同意(台北退伍军人总医院机构审查委员会编号:2017-12-001C, 2018-10-017A, 2019-07-003C, 2020-07-009AC, 2021-01-010BC)。

抽血进行cfDNA检测

在治疗前采集所有参与者的外周血样本。在PTB患者中，在标准强化期抗结核治疗两个月后再次进行血液检测。用于血浆制备，用K2-EDTA真空管(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)收集8 - 10ml全血，并在收集后2小时内以1500转/分的速度离心10分钟(29)．使用QIAamp DNA血液迷你试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)，从400µL血浆样品中提取cfDNA，洗脱量为50µL，并存储在- 80°C的微离心管中，直到实时定量聚合酶链反应(qPCR)分批执行(30.，31)．

实时qPCR，绝对定量

为了估计血浆样本中的Mt-cfDNA和Nu-cfDNA拷贝数，采用qPCR方法测量了非编码人类线粒体基因组区域(hMito)和核DNA人类β 2微球蛋白(hB2M)的水平(20.)．为了从循环阈值(Ct)值计算目标基因的绝对拷贝数，我们在每个平板上用已知的hMito和hB2M扩增子拷贝构建了一个参考5点标准曲线，每组重复一份，如先前报道的那样(20.)．血浆中hMito和hB2M水平用稀释因子1.25调整后的每μL原血浆样本拷贝数(拷贝数/μL血浆)表示附录1详情)。

临床资料收集及结果

PTB和NTM-LD患者的临床数据在基线时收集，接受抗结核治疗的患者的临床数据在2个月时收集。收集的数据包括身体质量指数(BMI)、吸烟状况、医学合并症、放射学评分和调查结果(32)、痰抗酸杆菌培养结果及涂片评分。同时记录c反应蛋白(CRP)、全血细胞计数、淋巴细胞、单核细胞和血小板计数等实验室数据。在至少3个月的随访期间，LTBI患者和NTM-LD患者被证实没有PTB的微生物学证据。治疗两个月后痰培养由阳性转化为阴性是培养阳性PTB患者的结局衡量标准。

测定MTB抗原刺激巨噬细胞中的cfDNA

为了尝试建立MTB感染与巨噬细胞释放Mt-cfDNA和Nu-cfDNA之间更直接的联系，我们还检查了MTB抗原刺激的单核细胞上清液。使用人白血病细胞系(THP-1) (TIB-202, ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)，THP-1细胞被培养，并用phorbol 12-肉芽胞酸13-乙酸酯(PMA, 20 ng/ml) (P8139, Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)处理24小时，然后去除PMA并休息72小时(33，34)．然后用mtb特异性重组ESAT-6蛋白刺激分化细胞(重组蛋白参考标准，NR-49424) (BEI Resources, Manassas, VA, USA) (34)来模拟结核病感染。用ESAT-6蛋白以0、0.1、1.0和2.0µg/mL浓度刺激细胞24小时后，收集培养上清，以Mt-cfDNA和Nu-cfDNA为靶标进行qPCR，并进行绝对定量。

统计分析

的Mann-WhitneyU -考试和学生t-test用于比较PTB、LTB和NTM-LD组之间的连续变量。一个配对t-试验比较PTB治疗前后cfDNA水平。组间各分类变量的分布用χ进行比较²和费雪精确检验。使用Pearson相关分析评估cfDNA水平与感兴趣的连续变量之间的线性相关性。采用Logistic回归分析确定与培养阳性PTB和痰液转化相关的因素。利用logistic回归计算优势比(or)和95%置信区间(ci)。所有带有a的变量p-value在单因素分析中小于或等于0.05，则进入独立因素的多变量分析。计算感兴趣变量的受试者工作特征(ROC)曲线(AUC)下的面积，如果AUC的95% CI的下限高于0.5，则确定最佳临界值(35，36)．使用GraphPad Prism 6.0版(GraphPad Software Inc, CA, USA)和SPSS 18.0版(SPSS Inc, IL, USA)完成分析。

结果

参与者特征

在为期3年的研究期间，纳入了64例LTBI结核病接触者、97例PTB患者和51例NTM-LD患者(图1)．在PTB患者中，73例培养阳性，24例培养阴性。在培养阳性病例中，34例(46.6%)涂片阳性，12例(16.4%)耐异烟肼结核分枝杆菌分离株。没有菌株对利福平耐药。PTB组的血小板计数、单核细胞计数、MLR和CRP水平均高于LTBI组(均p<0.05)，但与NTM-LD组相似(表1)．虽然PTB组和NTM-LD组的痰涂片分级相似，但NTM-LD组的咳血率、双侧肺部疾病和x线评分较高。

Mt-cfDNA和Nu-cfDNA水平

Mt-cfDNA和Nu-cfDNA中位水平为45.44 x10⁶拷贝/μ l -等离子体(四分位范围[IQR] 4.52 x10⁶-157.73 x10⁶)和22.25 x10⁴copies/μL-plasma (IQR 2.17 x10⁴-90.45 x10⁴),分别。Mt-cfDNA水平在PTB组较高(87.22 x10⁶μL-plasma [IQR 12.20 x10⁶-252.24 x10⁶])，高于LTBI组(20.63 x10⁶拷贝/μL-plasma [IQR 1.15 x10 .⁶-84.68 x10⁶) (p = 0.001,图2一个)．同样，在PTB组中Nu-cfDNA水平较高(37.01 x10⁴拷贝/μL-plasma [IQR 5.51 x10 .⁴-126.44 x10⁴)比LTBI组(9.18 x10 .⁴拷贝数/μ l -等离子体[IQR 0.57 x10⁴-37.53 x10⁴) (p < 0.001,图2 b)．PTB组中位Mt-cfDNA水平也高于NTM-LD组(19.32 x10⁶拷贝数/μL-plasma [IQR 0.89 x10 .⁶-115.07 x10⁶) (p = 0.006,图2一个)，但Nu-cfDNA不是(30.27 x10⁴拷贝/μ l -等离子体[IQR 2.22 x10⁴-113.94 x10⁴] (p=0.355，图2 b)．在MTB感染患者中，包括PTB和LTBI，但不包括NTM-LD，涂片阳性PTB患者的Mt-cfDNA水平高于涂片阴性PTB患者(p<0.001)，但涂片阴性PTB患者高于LTBI患者(p=0.009) (图2 c)．这种关联趋势与Nu-cfDNA水平不明显(图2 d)．对于NTM-LD患者，在涂片阳性和涂片阴性病例中，Mt-cfDNA水平没有差异(p=0.523)。总体而言，甚至仅在PTB患者中，Mt-cfDNA水平与Nu-cfDNA、血小板计数、单核细胞计数和CRP相关(均p<0.01)，与年龄、性别、BMI、淋巴细胞计数或MLR无关补充表S1)．

与培养阳性PTB相关的因素

在包括LTBI和PTB但不包括NTM-LD的mtb感染队列中(图1)，多变量分析中培养阳性PTB的相关因素包括BMI、血小板计数、MLR和Mt-cfDNA水平高于中位数(45.44 x10)⁶拷贝数/μ l -血浆(校正OR 2.430, 95% CI 1.139-5.186, p=0.022) (表2)．在由培养阳性PTB和NTM-LD患者组成的分枝杆菌培养阳性队列中，与培养阳性PTB相关的独立因素为性别、血小板计数、x线评分和Mt-cfDNA水平高于45.44 x10⁶copies/μL-plasma(校正OR 4.007, 95% CI 1.382-12.031, p=0.011) (表2)．

PTB组的痰转阴和Mt-cfDNA改变

73例最初培养阳性的PTB患者中，12例(16.4%)在治疗2个月后仍为MTB培养阳性。2个月培养阳性与入组时痰涂片分级和x线评分相关(图3一)．在ROC曲线分析中，涂片分级和x线评分区分抗结核治疗2个月后持续培养阳性的AUC分别为0.716 (95% CI 0.569-0.862)和0.736 (95% CI 0.586-0.885)，而Mt-cfDNA水平的AUC为0.658 (95% CI 0.507-0.810)。Nu-cfDNA水平、血小板计数、单核细胞计数、MLR和CPR的auc分别为0.634 (95% CI 0.480-0.788)、0.536 (95% CI 0.35 - 0.746)、0.663 (95% CI 0.488-0.839)、0.582 (95% CI 0.416-0.748)和0.643 (95% CI 0.490-0.795)， 95% CI下界均低于0.5。使用62.62 x 10的最佳截断值⁶拷贝数/μ l -血浆进行Mt-cfDNA水平的二分类，高Mt-cfDNA预测2个月培养阳性的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值分别为91.67%、49.18%、26.19%和96.77%。Mt-cfDNA水平高于此水平与持续培养阳性的10倍风险相关(粗OR 10.645, 95% CI 1.293-87.607, p=0.028)。在调整涂片分级和x线评分后，结果相似(调整后OR 9.691, 95% CI 1.046-89.813, p=0.046) (表3)．

在随访血液检测的PTB患者中(n=59，包括48例初始培养阳性)，治疗2个月后Mt-cfDNA中位水平较基线水平(75.31 x10)降低⁶拷贝/μ l -等离子体[IQR 25.53 x10⁶-197.93 x10⁶]而不是97.78 x10⁶μL-plasma [IQR 15.72 x10⁶-314.22 x10⁶]， p=0.010t-test)，但Nu-cfDNA水平无统计学差异(图3B、C)．我们还检查了48例初始培养阳性PTB患者的Mt-cfDNA变化，并使用Mt-cfDNA动力学对患者进行分层(图3一)．在最初Mt-cfDNA水平较低的患者中(小于62.62 x 10⁶2个月后，无论Mt-cfDNA水平随后发生什么变化，所有人的培养结果均为阴性⁶拷贝数/μ l -血浆)，16%(4/25)在2个月时培养阳性，而在最初Mt-cfDNA水平较高并随后逐渐升高的患者中，40%(2/5)在2个月时仍培养阳性(趋势p=0.023) (表4)．

受刺激单核细胞上清中的Mt-cfDNA

我们定量了MTB ESAT-6抗原刺激THP-1细胞(原代单核细胞分化的巨噬细胞)上清液中Mt-cfDNA和Nu-cfDNA的水平。我们观察到Mt-cfDNA的平均水平显著升高(3.00 x10⁶±0.87 x10⁶高剂量(2.0µg/mL) ESAT-6蛋白刺激后上清液中MTB抗原拷贝数/μ l -血浆)明显高于未刺激的上清液(1.18 x10⁶±0.50 x10⁶拷贝/μL-plasma) (p = 0.011)。而MTB抗原刺激组与非刺激组之间Nu-cfDNA水平无显著差异(图4A、B)．

讨论

在我们对MTB和NTM感染患者的研究中，我们发现与LTBI和NTM- ld患者相比，PTB患者的Mt-cfDNA水平升高，尽管NTM- ld患者的疾病临床严重程度更高。值得注意的是，在PTB患者中，血浆Mt-cfDNA与炎症标志物和涂片阳性(细菌负担的代理)呈正相关，表明这种生物标志物与疾病严重程度的潜在关联。对于培养阳性的PTB患者，高水平的Mt-cfDNA水平和不断增加的Mt-cfDNA水平似乎也有可能预测治疗2个月后的持续培养阳性，但更重要的是，治疗开始时的低水平Mt-cfDNA水平高度预测治疗2个月后的培养阴性。此外，在评估我们提出的血浆Mt-cfDNA与MTB感染之间联系的合理性时，我们观察到MTB抗原ESAT-6对THP-1细胞的刺激与Mt-cfDNA释放到炎症细胞的细胞外空间有关，这支持了PTB中血浆Mt-cfDNA水平升高的起源假设。

确定传染性PTB患者并监测治疗效果仍然是全世界结核病控制的关键方面。在目前可用于此目的的血液生物标志物中，CRP作为艾滋病毒感染者PTB筛查工具的表现优于基于症状的方法(4)，但无论是其基线水平还是随时间的变化都不能预测MTB痰液转换，尽管存在局限性，但仍被认为是治疗成功的参考标准(5)．单核细胞和血小板计数升高与PTB的炎症相关，治疗后呈下降趋势，但它们不能可靠地预测治疗结果(37- - - - - -39)．MLR可用于识别艾滋病毒感染儿童的结核病，并在一般人群中区分活动性结核病与LTBI (6- - - - - -8)，但未发现持续高的mlr与2个月培养阳性相关(7，8)．虽然目前的研究规模和范围有限，但表明与LTBI患者相比，PTB患者中的Mt-cfDNA水平升高，这加强了Mt-cfDNA作为区分PTB与LTBI的新型生物标志物的潜力，可能与现有的检测方法(如IGRAs)相结合。在PTB患者中，Mt-cfDNA水平与CRP、单核细胞计数和血小板计数呈正相关，且涂片阳性患者的Mt-cfDNA水平高于涂片阴性患者，提示Mt-cfDNA与炎症过程和细菌负担均相关。我们的发现得到了先前研究的支持，这些研究显示Mt-cfDNA的升高与结核病相关的免疫重建炎症综合征和白细胞介素-18(一种促炎细胞因子)在hiv感染患者中相关(23)．从临床角度来看，当排除使用现有诊断方法更容易诊断为PTB的MTB涂片阳性患者时，Mt-cfDNA水平在涂片阴性PTB患者和与LTBI接触者之间也存在统计学差异，这表明Mt-cfDNA在区分低细菌负担PTB与IGRA阳性LTBI患者方面具有潜在作用。然而，在涂片阴性PTB亚组中存在低Mt-cfDNA水平的异常值，提示Mt-cfDNA单独在临床环境中可能没有足够的敏感性来区分所有涂片阴性PTB与LTBI。然而，在评估这些患者时，它仍然可能在医疗决策模型中发挥补充作用。基于我们的全部结果，我们认为人类起源的Mt-cfDNA有可能被用作MTB感染的临床阶段和严重程度的指标，反映了MTB感染从LTBI到涂片阴性和涂片阳性的临床谱系，其作为独立或补充的生物标志物在评估疑似PTB和LTBI患者中的应用值得进一步研究。

重要的是，我们的研究表明Mt-cfDNA可能在结核病患者的治疗监测中也有一定的用途。在PTB患者中，高基线Mt-cfDNA水平被发现是2个月培养阳性的中度预测，并且观察到Mt-cfDNA水平在治疗2个月后下降。我们观察到的2个月持续培养阳性率为16.4%，与之前的报告一致(35，40)．值得注意的是，利用Mt-cfDNA的变化对患者进行分层，我们注意到，最初Mt-cfDNA高，2个月后Mt-cfDNA水平升高的PTB亚组持续培养阳性的比率最高，而其他亚组的比率较低，具有统计学意义。我们假设Mt-cfDNA可能是PTB中细菌负荷和炎症的综合替代标记物，这是与治疗中培养转化率降低相关的重要因素(3.，41，42)．同样，Mt-cfDNA水平的降低反映了治疗后细菌载量的降低和炎症的减轻，这可能与临床相关，表明治疗成功。为此，虽然循环Mt-cfDNA水平升高的确切原因可能是复杂和多维的，但我们的概念验证研究表明Mt-cfDNA监测PTB治疗反应的潜在价值。

人类cfDNA起源于细胞凋亡、中性粒细胞细胞外陷阱和炎症细胞对微生物的反应死亡，以及通过细胞外载体的活跃细胞分泌(12)．与Nu-cfDNA相比，Mt-cfDNA的拷贝数高出1000倍，因为除了红细胞外，每个细胞都含有丰富的DNA线粒体。我们发现Mt-cfDNA水平比Nu-cfDNA更好地与培养阳性PTB相关，并预测2个月培养阳性。我们观察到的ESAT-6刺激与活化THP-1细胞上清液中Mt-cfDNA水平之间的关系可能支持了这些发现。然而，人类Mt-cfDNA可因各种生理或精神压力和病理损伤而升高(17，43，44)．为了研究Mt-cfDNA作为PTB生物标志物的特异性，我们还将NTM-LD患者纳入研究，发现高Mt-cfDNA促进了培养阳性PTB与NTM-LD的分化。有趣的是，尽管NTM- ld组有更高的咯血率和更高的x线评分，表明NTM患者的病情更严重，但Mt-cfDNA水平升高仍然可以将PTB与NTM- ld区分开来，这表明PTB疾病与Mt-cfDNA水平之间可能存在一种超越肺部病理的独特联系。使用不同毒力的MTB菌株感染骨髓来源的巨噬细胞，Wiens等人。报告了菌株依赖性感染相关的线粒体DNA释放到细胞质中(24)．由于PTB和NTM-LD组中几种炎症标志物和细菌负荷水平相似，PTB患者中Mt-cfDNA水平的差异较高可能表明MTB在导致Mt-cfDNA释放方面的特定作用，值得进一步研究。

本研究存在一定的局限性。首先，在PTB患者强化治疗阶段进行实验室检测的时间仅限于两个时间点，符合持续性培养阳性评估条件的病例数量相对较少。大规模的研究需要验证随访期间Mt-cfDNA动态变化与结核病治疗期间和治疗后细菌负担之间的关联。其次，入选的参与者都是同一所研究所的临床稳定的未感染艾滋病毒的门诊患者，因此我们的发现对不同治疗方案的不同病情的其他人群的普遍性仍然未知。Mt-cfDNA在PTB和NTM-LD合并HIV感染患者中区分分枝杆菌诊断和预测预后方面的性能有待进一步研究。此外，诸如糖尿病严重程度和抗高血糖药物等混杂因素可能会影响PTB患者的治疗结果，但无法进行分析(45)．我们的研究也受到缺乏健康对照组的限制。在最近发表的一项研究中，作者披露，与健康个体相比，耐多药结核病患者血液白细胞中的线粒体DNA拷贝数增加，并提出这一发现是结核病患者氧化应激的结果(46)，这可能是解释PTB患者细胞外血浆Mt-cfDNA水平升高的合理机制之一。纳入健康对照的进一步研究可能有助于确认Mt-cfDNA在区分从未感染人群到LTBI和PTB的频谱方面的潜在作用。最后，血浆样本没有进行双重离心，因此cfDNA的水平可能被高估了(31)．然而，我们的结果应该是可靠的，因为使用相同的方案，所有组间和治疗后比较一致地表明，高水平的Mt-cfDNA与结核相关的炎症和细菌负担有关。然而，应该承认不同研究之间cfDNA测量方案差异的潜在影响。

总之，我们发现Mt-cfDNA水平与PTB中的炎症标志物和涂片阳性相关。重要的是，Mt-cfDNA，而不是Nu-cfDNA，与培养阳性PTB相关，与治疗2个月时痰培养阳性相关，并在治疗后下降。进一步的研究需要评估Mt-DNA在PTB鉴定和治疗反应监测中的潜在补充作用。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。访问这些数据集的请求请发送至潘胜伟，sanweipan@gmail.com。

道德声明

涉及人类参与者的研究由台北退伍军人总医院机构审查委员会(2017-12-001C, 2018-10-017A, 2019-07-003C, 2020-07-009AC, 2021-01-010BC)审查并批准。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。

作者的贡献

S-WP, T-YT, J-YF和W-JS收集数据。所有作者均进行了数据分析。S-WP, RS, DC, M-LH和C-CS撰写了手稿。J-YF和TR对论文进行了关键修改。S-WP和J-YF是论文的担保人，对论文从开始到发表的完整性负责。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

S-WP由台北退伍军人总医院[V110C-040]和台湾科技部[107-2314-B-075-057, 108-2314-B-075-001, 109-2314-B-075-094, 110-2314-B-075-077, 111-2314-B-075-059]资助。TR, DC和AC由NIH NIAID拨款# R01AI137681资助。

致谢

作者感谢台北退伍军人总医院医学科技大楼和加州大学圣地亚哥分校Stein临床研究大楼提供的研究设施。作者还感谢Peter G Chiles博士在实验咨询中提供的帮助。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fimmu.2022.1040947/full#supplementary-material

参考文献