中和表位Clostridioides固执的两种骆驼VHH抗体的结构揭示了毒素A

简介

革兰氏阳性孢子形成细菌引起的感染Clostridioides固执的（梭状芽孢杆菌)是最常见的医疗相关感染之一(1，2)．根据疾控中心最近的一份报告，约有12,800人死亡，10亿美元的医疗成本可归因于梭状芽孢杆菌感染(CDI) (3.)．抗生素包括甲硝唑、万古霉素和非达霉素是目前CDI的主要治疗选择。然而，高达30%的患者在首次抗生素治疗后复发，复发的风险也会增加(4)，这就迫切需要开发更有效的CDI治疗方法。

两种高分子量外毒素，毒素A (TcdA)和毒素B (TcdB)，由梭状芽孢杆菌是导致CDI的主要毒力因素，导致广泛的临床症状，从轻度腹泻到危及生命的假膜性结肠炎(4- - - - - -7)．TcdA和TcdB的序列和三维结构相似，可分为四个功能域:氨基端糖基转移酶结构域(GTD)、半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)、传递和受体结合结构域(DRBD)和羧基端组合重复寡肽结构域(CROPs) (8- - - - - -10） (图1一个)．TcdA和TcdB被内化到宿主细胞通过受体介导的内吞作用(5，10- - - - - -14)．然后，核内体中的酸化触发DRBD中的疏水孔隙形成区域进行构象重排(15- - - - - -18)，以便将GTD和CPD穿过核内体膜运送到细胞质中，在细胞质中，CPD与六磷酸肌醇结合后将GTD裂解(InsP6) (19，20.)．释放的GTD靶向宿主细胞中的小鸟苷三磷酸酶(GTPases)的Rho和/或Ras家族，通过糖基化GTPases中的关键苏氨酸残基并抑制其作为分子开关的功能，导致肌动蛋白细胞骨架的破坏，细胞圆化，最终细胞死亡(21- - - - - -25)．

事实上，复杂的多步骤中毒过程为我们提供了许多治疗CDI的机会。例如，许多中和抗体已经被开发出来，它们以TcdA或TcdB为目标，并通过阻断中毒级联过程中单个毒素片段的功能来抑制它们的细胞毒性(26- - - - - -30.)．这些努力导致了抗TcdB单克隆抗体(mAb) bezlotoxumab的成功商业化，它通过靶向TcdB CROPs和阻断关键宿主受体CSPG4的结合来中和TcdB。11，27，31)．一些中和TcdA的单克隆抗体，如actoxumab和PA50，也被报道靶向CROPs并阻止TcdA与细胞表面受体结合(27，32，33)．

除了传统的单克隆抗体外，由于骆驼重链抗体(camelid heavy chain only antibodies, VHHs)体积小、亲和度高、特异性强、稳定性好，被广泛用于开发抗TcdA和TcdB的抗毒素(34，35)．例如，在早期的研究中，我们发现VHH 5D结合在TcdB DRBD的成孔区域，并阻止ph诱导的毒素成孔，VHH E3结合在TcdB GTD的n端四螺旋束上，这可能会干扰GTD的膜结合(10)．也开发了几种以tcda为靶向的中和vhs，包括与CROPs结合的A20.1和A26.8，与GTD结合的AH3，以及与CPD-DRBD结合的AA6 (26，36)．AH3和AA6特别有趣，因为它们在纳摩尔浓度下中和了TcdA的细胞病变效应(26)．此外，当AH3和AA6与两个tcdb中和VHHs (E3和5D)以单链异质四聚体VHH设计的形式结合时，它们在动物模型中显示出对原发性和复发性CDI的有效保护(26，28，30.)．在这里，我们报道了VHH AH3和AA6与TcdA GTD(残基1-542)和TcdA DRBD(残基1073-1464)的共晶结构，称为TcdA^{1073 - 1464}),分别。这些结构揭示了两种不同的机制，抗体通过抑制GTD的展开或DRBD中的孔隙形成来中和TcdA，这是中毒级联中的两个关键步骤。

材料与方法

蛋白表达及纯化

编码两个VHHs (AH3, AA6)的基因，TcdA GTD(残基1-542，菌株VPI10463)和TcdA的截断DRBD(残基1073-1464，称为TcdA^{1073 - 1464}(株VPI10463)克隆到修饰过的pET28a载体中，该载体n端插入6×His/SUMO标记通过BamH我/Xho我限制网站。如前所述，TcdA GTD携带K190A突变，以减少蛋白质表达和纯化过程中的降解(22)．

重组蛋白在大肠杆菌菌株BL21-star (Invitrogen)。细菌在37℃含卡那霉素的LB培养基中培养。1 mM异丙基-β- d -硫代半乳糖皮苷(IPTG)诱导细胞密度(OD₆₀₀)达到~0.8。然后将温度降至18℃，蛋白继续在18℃下表达18小时。通过离心收集细胞，并在-80°C保存以备将来使用。

为了纯化，将细胞球重新悬浮在含有50 mM Tris, pH 8.5, 400 mM NaCl, 30 mM咪唑的缓冲液中，并用超声波溶解。用Ni-NTA亲和树脂(Qiagen)纯化his标记蛋白，用含有400 mM咪唑、pH 8.5的类似缓冲液洗脱结合蛋白。His/SUMO标签被SUMO蛋白酶裂解。然后将蛋白质交换到含有20 mM Tris、40 mM NaCl、pH 8.5的缓冲液中，并使用NaCl梯度进行Mono-Q离子交换层析(GE Healthcare)。将峰值组分合并，浓缩至~10 mg/ml，并在-80°C保存，直到将来使用。

TcdA GTD-AH3和TcdA^{1073 - 1464}将纯化后的TcdA GTD和TcdA混合，组装成-AA6配合物^{1073 - 1464}以AH3和AA6的摩尔比为1:1.5，在冰上放置3小时。使用Mono-Q离子交换层析(GE Healthcare)使用NaCl梯度进一步纯化复合物。为了结晶，TcdA GTD-AH3配合物被交换到含有20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0, 2 mM udp -葡萄糖，2 mM MnCl的缓冲液中₂和TcdA^{1073 - 1464}-AA6配合物交换到含有20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0的缓冲液中。将两种配合物浓缩至~10 mg/ml，并在-80°C保存，直到将来使用。

结晶

TcdA GTD-AH3和TcdA的初始结晶筛选^{1073 - 1464}-AA6配合物在18°C下使用Gryphon结晶机器人(Art Robbins Instruments)和高通量稀疏基质筛选试剂盒(Hampton Research和Qiagen)进行，使用静滴蒸汽扩散法(0.3µl蛋白质+ 0.3µl储层对55µl储层进行平衡)。在18°C下，通过混合等体积的蛋白质和储层溶液，使用悬滴蒸汽扩散法进行晶体优化。在含0.2 M磷酸钾和20% (w/v) PEG 3350的条件下，TcdA GTD-AH3配合物得到了最佳结晶。TcdA中最好的晶体^{1073 - 1464}-AA6配合物在0.2 M乙酸铵，0.1 M Bis-Tris, pH 5.7, 15% PEG 3350的条件下得到。晶体在添加15% (v/v)甘油的母液中冷冻保护，并在液氮中快速冷冻以收集数据。

数据收集和结构确定

x射线衍射数据采集于100 K的NE-CAT光束线24-ID-E，高级光子源。数据使用在RAPD (https://github.com/RAPD/RAPD） (37)．利用TcdA GTD (PDB 7U2P)的结构进行分子置换，得到TcdA GTD- ah3配合物的结构。22)及VHH 5D (PDB 6OQ5) (10)作为搜寻模型通过凤凰。Phaser-MR (38)．TcdA的结构^{1073 - 1464}-AA6配合物采用TcdA DRBD (PDB代码:7U1Z)中对应片段(1073-1464)的结构进行分子置换(8)及VHH (pdb5m2j) (39)作为搜寻模型通过凤凰。Phaser-MR (38)．所有的改进和模型构建程序都是使用PHENIX进行的。完善(40)及COOT (41)．使用5%随机选择的测试集(42)．该结构已由MolProbity (43)．表S1显示数据收集和优化的详细统计信息。所有结构图均由PyMOL (DeLano Scientific)制备。利用PISA(蛋白质，界面，结构和组装)程序(44)和CCP4程序中的SC (45，46),分别。

蛋白质融化试验

TcdA GTD和TcdA GTD- vhh配合物的热稳定性是在StepOne实时PCR仪(Life Technologies)上使用基于荧光的热位移法测定的。加入或不加入VHHs(摩尔比为1:1.2)的TcdA GTD在含有150 mM NaCl和50 mM乙酸钠(pH 5.0-5.5)或50 mM Bis-Tris (pH 6.0-6.5)的缓冲液中冰孵育2小时。在实验开始前，将蛋白质(~0.25 mg/ml)与荧光染料SYPRO Orange (Sigma-Aldrich)混合，并将混合物从25°C加热到95°C，呈线性斜坡。蛋白质融化曲线的中点(T_米)采用仪器制造商提供的分析软件进行测定。从三个独立的实验中获得的数据被平均以生成图表。

ANS(8-苯胺萘-1-磺酸)结合试验

将1µM的TcdA GTD, TcdA GTD-AH3, TcdA GTD- aa6(摩尔比为1:1)或AH3与200µM ANS在50 mM醋酸钠(pH 4.0-4.6)或50 mM柠檬酸钠(pH 5.0-6.5)中孵卵20分钟。1.5 μ M的TcdA^{1073 - 1464}, TcdA^{1073 - 1464}-AA6, TcdA^{1073 - 1464}-AH3(摩尔比1:1)或AA6与375µM ANS在50 mM醋酸钠(pH 4.0-4.6)或50 mM柠檬酸钠(pH 5.0-6.5)中孵卵15分钟。所有缓冲液均含有150mm NaCl。使用Molecular Devices SpectraMax M2e分光光度计在25°C下记录荧光强度，激发在366 nm，发射在480 nm。荧光强度通过在不含蛋白质的缓冲液中减去ANS的背景荧光来校正。误差条表示三次重复测量的SD。

结果

VHH AH3的晶体结构与TcdA的GTD呈络合关系

先前的研究表明AH3与TcdA的GTD结合(26)．我们成功地在udp -葡萄糖和Mn的存在下结晶出了TcdA的GTD(残基1-542)和AH3的配合物^{2 +}．这些晶体属于空间群P12₁1单元尺寸a = 80.12 Å， b = 131.64 Å， c = 83.80 Å， α = 90°，β = 110.02°，γ = 90°。以TcdA GTD (PDB代码:7U2P)和VHH 5D (PDB代码:6OQ5)为搜索模型，通过分子置换确定TcdA GTD- ah3配合物的结构为2.10-Å分辨率。图1 b)(见材料与方法)。集中在TcdA GTD-AH3配合物相互作用区域的二级结构如图所示图S1．数据收集和细化的统计数据显示在表S1．

ah3结合TcdA GTD的整体架构与udp -葡萄糖结合TcdA GTD相似(PDB代码:3SRZ，称为apo TcdA GTD) (47)，在387个残基上，均方根偏差(RMSD)为~0.522 Å。大多数相互作用是由AH3的互补决定区域3 (CDR3)介导的，该区域插入TcdA GTD的α8和α11螺旋之间形成的沟槽(图1 b)，埋藏界面面积~909.6 Ų形状互补得分为0.760 (45)．TcdA GTD-AH3界面的核心主要由广泛的氢键相互作用介导，辅之以盐桥和van del Waals相互作用(图1 c而且表S2)．值得注意的是，连接TcdA GTD的α8和α9螺旋的环比载脂蛋白状态移动了2.1 Å，以便更好地适应AH3的结合(图1 d)．因此TcdA GTD的N194位移~2.9 Å，避免与AH3的K114发生潜在的碰撞，同时与AH3的G113、D115和D116的主链建立了三对氢键(图1 e)，而TcdA GTD的V198采用了~2.6 Å的移动，以避免与AH3的A98和F99 (图1 f)．这一区域的其他一些TcdA氨基酸如Y189、I193、K195、P196和D203也与AH3的CDR3形成氢键和盐桥相互作用(图1 c)．作为核心界面的补充，α11螺旋结构周围的12个TcdA氨基酸以及α10和α11之间的连接环主要与AH3的CDR3产生疏水作用，进一步稳定复合物(表S2)．

VHH AA6的晶体结构与DRBD的片段呈络合

在之前的一项研究中，AA6的表位被定位在TcdA的CPD-DRBD中(26)．我们使用下拉法检测了AA6与一系列重组TcdA片段的结合，发现TcdA DRBD片段(残基1073-1464，称为TcdA^{1073 - 1464})足以结合AA6，最适合结晶(表S3)．TcdA的^{1073 - 1464}-AA6配合物在空间群P12中成功结晶₁1单元尺寸a = 54.02 Å， b = 86.00 Å， c = 109.34 Å， α = 90°，β = 91.45°，γ = 90°。TcdA的结构^{1073 - 1464}利用TcdA的片段结构进行分子置换，确定-AA6配合物的分辨率为1.81-Å^{1073 - 1464}采用PDB 7U1Z中的TcdA结构和PDB 5M2J中的VHH结构作为搜索模型(图2一个)．接近完整的TcdA结构^{1073 - 1464}除前7个n端残基无可见电子密度外，其余残基均为1080-1464。二级结构侧重于TcdA的相互作用区域^{1073 - 1464}-AA6配合物显示在图S2．数据收集和细化的统计数据显示在表S1．

aa6结合TcdA的整体结构^{1073 - 1464}与全毒素中单独的TcdA片段相似，RMSD为~0.576 Å，超过313个残基，表明AA6不会使毒素发生明显的构象变化(8)．AA6的所有三个cdr的残基都有助于与TcdA的直接相互作用^{1073 - 1464}其中CDR3起主导作用(图2一个)．作为cdr的补充，框架区FR3中的一些AA6残基也参与TcdA结合。该复合体的总界面面积约为957.8 Ų形状互补得分为0.696 (45)．结构显示AA6识别TcdA中的两个区域^{1073 - 1464}残基I1105-N1111(区域1)和T1305-N1387(区域2)(图2一个)．值得注意的是，区域1是TcdA成孔区域的一部分，其中包括全息毒素中的958到1130残基。孔隙形成区域在结构上被埋藏，因此在中性pH下被保护在DRBD中，但在核内体酸化时被释放，以促进GTD和CPD向细胞质的转运(10，15- - - - - -18，48)．AA6结合稳定了这部分成孔区域的构象通过FR3和TcdA残基I1105、P1106、L1108、N1110和N1111中主要涉及AA6残基D61、S62、R66和E88的van del Waals相互作用(图2 b而且表S4)．TcdA的区域2介导了大部分AA6的结合通过与所有三个cdr进行广泛的交互。值得注意的是TcdA的N1387^{1073 - 1464}可能是AA6的关键表位，因为它指向AA6中的一个由CDR3中的R99、V100、I101、S102、S104和A105残基组成的小袋，形成三对氢键和两种范德华相互作用(图2 c而且表S4)．相反，AA6的CDR3中的残基R99与TcdA中由残基S1330、N1351-I1356和N1387组成的口袋结合，建立了四对氢键和四种范德华相互作用(图2 d而且表S4)．

AH3干扰GTD的ph依赖性展开

先前对TcdB GTD中和表位的研究揭示了几种不同的中和机制(49)．例如，VHH 7F和E3分别抑制TcdB的GTD的自动加工和破坏质膜关联(10，50)．人源mAb PA41通过阻止其GTD进入宿主细胞的细胞液来中和TcdB (51)．相反，据我们所知，AH3是唯一已知的靶向TcdA GTD的中和抗体。26)，其中和机制尚不明确。我们的晶体结构表明AH3的表位位于GTD的底物结合位点的对面，因此它不应该直接影响Rho GTPases的糖基化(22） (图3一)．GTD的另一个独特之处在于，当它被核内体中的酸化触发时，它会部分展开，随后在DRBD中的孔隙形成区域的帮助下，它会转移到细胞质中(5)．对肉毒杆菌毒素、白喉毒素和炭疽毒素等其他孔隙形成毒素的研究表明，它们的酶结构域的部分展开是转位到细胞质所必需的(52- - - - - -56)．因此，我们假设AH3的结合可能会干扰GTD的ph依赖性构象变化和展开。

为此，我们以AA6为阴性对照，采用基于荧光的热位移试验研究了AH3对GTD热稳定性的影响。熔点温度(T_米)在pH 6.5和6.0时，TcdA GTD的温度分别为36.4°C和34.9°C，但在pH 5.5和5.0时未观察到明显的熔融相，说明在pH低于6时，GTD部分展开(图3 b)．当AH3存在时，T_米在pH 6.5和6.0时，GTD的稳定性分别提高了5.1°C和4.8°C，在pH 5.5和5.0时，GTD的稳定性显著提高_米分别为37.3°C和35.9°C。在一项独立实验中，我们使用8-苯胺萘-1-磺酸(ANS)监测AH3对酸性ph诱导的TcdA GTD展开的影响，ANS是一种荧光疏水染料，通常用于探测蛋白质折叠(57)．在pH值低于5.5时观察到荧光强度的大幅增加，这是由于TcdA GTD展开过程中疏水表面的暴露引起的。但AH3对GTD展开有明显抑制作用，而AA6对GTD展开无明显抑制作用(图3 c)．GTD-AH3复合物的结构表明，AH3的CDR3同时与TcdA GTD的α8、α9和α11螺旋上的残基以及连接α8-α9和α10-α11的环相互作用，有助于提高GTD的稳定性(图1B、C而且表S2)．这些数据表明，AH3在结合时稳定了GTD的结构，从而抑制了GTD的ph依赖性展开，从而阻碍了GTD向细胞质的传递。类似的中和机制已被报道用于针对蓖麻毒素和肉毒毒素的VHHs，其中VHHs与蛋白质货物结合并抑制其传递(58- - - - - -60)．

AA6可以阻断TcdA的孔隙形成

在确定TcdA的结构之后^{1073 - 1464}-AA6复合物时，我们惊奇地注意到TcdA中的aa6结合位点与TcdB中的有效中和VHH 5D的结合位点有很大的重叠^{1072 - 1433}（10） (图4一)．此外，两种vhs结合到孔隙形成区域的关键部分(例如，TcdA中的I1105-N1111残基)，在那里它们抓住一个β发夹motif (β1-β2) (图4B, C)．之前的一项研究证明了该区域对细胞毒性的重要性，该研究表明，只要突变TcdB该区域的一个残基L1107K(相当于TcdA中的L1108)，毒性就会降低1000倍(10，15)．我们之前对5D和TcdB的研究表明，5D抑制酸性ph诱导的TcdB成孔区介导的构象变化和成孔(10)．受到这些发现的吸引，我们研究了AA6如何影响TcdA的结构^{1073 - 1464}在酸性pH下，我们发现AA6显著抑制TcdA的展开^{1073 - 1464}pH低于4.3时，这与5D对TcdB的影响一致，说明AA6可能会阻碍TcdA的成孔(图4 d)．

人们普遍认为，含有大量疏水残基的TcdA/TcdB在中性pH时，其成孔区域受到DRBD的保护，但在酸性内体pH诱导下，其部分展开并与DRBD分离以形成孔(5，10，48)．将中性pH条件下TcdA的结构与酸性pH条件下代表成孔中间状态的TcdB的结构(图4 e） (8- - - - - -10)．然而，已有研究表明，5D能够抓住并稳定TcdB孔隙形成区域的β发夹基序，这可能随后阻止酸性ph诱导的TcdB展开(10)．我们发现AA6在TcdA的孔隙形成区域以一种与5D对TcdB高度相似的方式抓住β发夹motif (图4 e)，这表明AA6可能限制了TcdA中β发夹motif的构象，并抑制了内体ph时孔隙形成所必需的构象变化。这一结构发现需要进一步的研究来验证TcdA全息毒素的结构。值得注意的是，AA6和5D识别的这部分孔隙形成区域在大型梭状芽胞杆菌糖基化毒素(lcgt)家族中高度保守，包括TcdA和TcdB，c的新世界α毒素(Tcnα),c . sordellii致命和出血性毒素(TcsL和TcsH)，以及c . perfringens毒素(TpeL) (5，10，15，61） (图4 c)，这表明它可能是开发针对lcgt的广谱疫苗和抗体的一个很好的靶点。

讨论

在这项研究中，我们在TcdA中发现了两个新的中和表位，它们是VHH AH3和AA6的靶标。我们的结构和生化研究表明，AH3与GTD结合，提高了其整体稳定性，从而阻碍了其在酸性pH下的展开;AA6与DRBD结合，阻碍了TcdA成孔区域的构象变化。我们发现AA6在TcdA上的结合模式和中和机制与VHH 5D在TcdB上的结合模式和中和机制非常相似(10)．由于分别用全长TcdA和TcdB免疫的两只羊驼中饲养了AA6和5D，并分别进行了筛分(26)，这一发现表明，AA6和5D的保守表位对TcdA和TcdB都具有重要的功能，因此是开发疫苗和治疗性抗体的良好候选。

膜转运和GTD传递到宿主细胞质是TcdA中毒的必要步骤。因此，阻断这一步骤的抗体应该能提供有效的保护。我们发现AH3和AA6可以同时结合TcdA全息毒素(8，9） (图5)．因此，将AH3和AA6结合在一个杂化分子中应该会导致更高的中和效力，因为这两种VHHs的协同结合。事实上，已经开发出几种将AH3和AA6与两种抗TcdB VHH E3和5D结合成单一分子的多价VHHs，在中和TcdA和TcdB时，其表现显著优于单个VHHs (26，28，30.)．在这些多价vhs中，四个vhs连在一起通过不同取向的短肽连接体，如AH3-E3-E3-AA6 (26)， ah3-5d-e3-aa6 (28)，以及AH3-5D-AA6-E3(虚线表示肽连接物)(30.)．在TcdA全息毒素中，如果AH3与AA6的n端相连，AH3的c端与AA6的n端之间的最短线性距离为~131 Å，反之为~169 Å (图5)．理想的肽连接物应该具有足够的长度和灵活性，允许AH3和AA6同时结合在TcdA上，同时不与毒素本身发生冲突。我们认为，根据已知的结合表位以及这四种VHHs在TcdA和TcdB全息毒素上的相对位置，可以进一步优化这些多价VHHs的设计，以确保AH3/AA6同时结合TcdA和5D/E3同时结合TcdB，从而获得更高的中和效力。

这两个中和表位的鉴定也为开发基于片段的TcdA疫苗提供了新的思路。TcdA和TcdB的大体积对开发疫苗提出了挑战，因为它们会诱导大量的非中和抗体。先前的研究表明，非中和抗体可以增强细胞毒性和炎症通过抗体介导进入细胞(26，62)．事实上，各种毒素碎片先前已被探索作为疫苗的候选(63- - - - - -67)．我们设想，这两个新发现的TcdA中和表位是开发片段疫苗的良好候选，将免疫反应集中在TcdA中这些功能关键的表位上，诱导抗体阻止TcdA易位，从而保护宿主细胞免受毒素攻击。

数据可用性声明

TcdA GTD-AH3和TcdA的坐标和结构因子^{1073 - 1464}-AA6复合物已存入蛋白质数据库，访问代码分别为7UBY和7UBX。

作者的贡献

概念化:BC和RJ;调查:BC和KP;监督和资金获取:RJ;写作:BC和RJ。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了美国国家过敏和传染病研究所(NIAID)拨款R01AI139087, R01AI158503和R21AI156092的部分支持。先进光子源(APS)的NE-CAT由美国国家普通医学科学研究所(P30 GM124165)资助。APS是由阿贡国家实验室为美国能源部(DOE)科学办公室运营的科学用户设施办公室，由美国能源部根据合同编号支持。DE-AC02-06CH11357。

致谢

我们感谢塔夫茨大学的Charles B. Shoemaker博士与我们分享编码VHH AH3和AA6的基因。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fimmu.2022.978858/full#supplementary-material

参考文献