古生菌的非常规遗传密码系统

简介

在早期的分类学分类中，古生菌和细菌因其共同的原核性质而被归为“Monera”分类单元(惠塔克,1969)。然而，对通用小核糖体RNA (rRNA)的序列和系统发育分析使人们认识到古生菌是与真核生物和细菌并列的独立的第三个生命域(沃斯等人，1975年)。对古生菌的进一步研究显示，与真核生物相比，它们的分子机制有许多相似之处，现在表明这两个生命领域之间有更紧密的进化史。

像真核生物和细菌一样，古生菌生活在广泛的环境中，从土壤到人类肠道(贝克等人，2020年)。然而，古菌域是独特的，包括许多产甲烷菌和极端微生物，它们可以在pH值、温度、盐浓度和压力以外的环境中生存(罗斯柴尔德和曼西内利，2001年)。鉴于古生菌所居住的极端环境，某些古生菌谱系也具有独特的遗传密码系统，这在其他领域的生物中并不突出。这对于在生态位途径中起作用的酶(如甲烷生成)的形成是必要的，或者更适合在恶劣条件下生存。在古生菌中发现的不同遗传密码系统包括用于插入第21和第22个遗传编码氨基酸(分别为硒化半胱氨酸(Sec)和吡啶赖氨酸(Pyl))的停止密码子的自然编码，以及用于规范氨基酸生物合成的trna依赖通路。最近的研究发现，从地热泉和深海沉积物中发现的古菌谱系拥有不止一种不同的遗传密码系统(Mukai等，2017；Sun等，2021年)。在这里，我们讨论了与这些系统相关的结构元素，调控机制和生物合成策略。

硒代半胱氨酸插入

硒半胱氨酸是第21个基因编码氨基酸，于1976年被发现(Cone等人，1976年)，然后显示由蛋白石(UGA)停止密码子编码(Zinoni等人，1986年；加西亚和斯塔特曼，1992年)。Sec在化学性质上与半胱氨酸(Cys)相似，不同之处在于其巯基被硒醇取代，因此Sec具有高亲核性(斯托克和罗瑟，2009年)。与巯基相比，亚硒醇在较低的pH值下也被去质子化，这导致Sec比Cys更具活性，并且通常存在于氧化还原酶的催化位点。Sec存在于生命的所有三个领域，大多数编码Sec的古生菌是产甲烷菌。产甲烷菌的生长高度依赖硒，因为大多数古生菌硒蛋白都参与了产甲烷(罗瑟等人，2001年)。这些硒蛋白包括异二硫还原酶、脱氢酶和氢化酶(Rother和Quitzke, 2018)。异二硫还原酶中的Sec残基连接铁-硫簇，被认为可以指导构象变化。在脱氢酶中，Sec在催化中心起着协调辅因子的作用。Sec也存在于含Ni的氢化酶中，使Ni与另外三个Cys残基配位。在这些[NiFeSe]-氢化酶中，Sec负责将Ni结合到活性位点并增加对氧化应激的耐受性。与具有四个活性位点Cys残基的[NiFeSe]-氢化酶相比，[NiFeSe]-氢化酶具有更高的酶活性(Evans等人，2021年)。然而，当活性位点Cys残基被Sec取代时，氧化应激耐受性显著增加，但酶活性降低，因为硒破坏了质子转移途径(Evans等人，2021年)。这些发现表明Sec在特定的功能环境中被纳入，并且不一定在所有情况下催化优于Cys。除了甲烷生成，Sec还存在于硒蛋白生物合成途径的酶中，以及功能未知的hesb样蛋白和过氧氧还蛋白样蛋白中(Rother和Quitzke, 2018)。因此，还需要进一步的研究来阐明古菌硒蛋白的不同功能。

最近，基因组分析揭示了新发现的古菌门中已知的完整的sec编码基因Lokiarchaeota而且CandidatusSifarchaeia。这两个Lokiarchaeota和Sifarchaeia属不产甲烷的Asgardarchaeota超门(Sun等，2021年)。系统发育重建假设Lokiarchaeota成为真核生物的姐妹群。根据Sec部分生物合成和插入途径的独特特征，认为该门是古生菌和真核生物之间潜在的进化联系(Mariotti等人，2016)。

虽然Sec存在于生命的所有领域，但在Sec生物合成和结合的机制上存在一些差异(图1)。最初的步骤在所有结构域上都是保守的:sec特异性tRNA异受体(tRNA)的氨基酰化^{证券交易委员会})通过seryl-tRNA合成酶(SerRS;Rother和Quitzke, 2018)。正是在Ser到Sec的转换过程中，细菌机制从古生菌和真核生物中分裂出来。在细菌中，这种转化发生在一个步骤中，之后细菌的sec特异性伸长因子SelB运输硒半胱氨酸- trna^{证券交易委员会}(Sec-tRNA^{证券交易委员会})到核糖体(图1一个)。在古生菌和真核生物中，需要两种不同的酶将Ser转化为Sec (图1 b，C)。丝氨酸首先被磷酸丝氨酸- trna磷酸化为磷酸丝氨酸(Sep)^{证券交易委员会}atp依赖性反应中的激酶(PSTK)，转化Ser-tRNA^{证券交易委员会}对Sep-tRNA^{证券交易委员会}（Carlson等人，2004年；Sherrer等人，2008b)。Sep随后转换为Sec byO-phosphoseryl-tRNA^{证券交易委员会}:Sec合成酶(SepSecS)，以吡哆醛磷酸盐依赖的方式。由此产生的Sec-tRNA^{证券交易委员会}然后被带到核糖体来解码UGA密码子。在这一点上，无论是真核生物还是古生菌，都没有完全了解详细的延伸机制。目前的信息表明，一个特化延伸因子(真核生物中的EFSec和古生菌中的aSelB，也称为aEFSec)除识别Sec- trna外，还识别mRNA的3 ' -非翻译区(UTR)中的Sec插入序列(SECIS)元素^{证券交易委员会}，以重新编码UGA。在真核生物中，人们认为包含SECIS元件的3 ' -UTR包裹在一起，使SECIS元件更接近UGA密码子(图1 b)。这一过程在细菌中不会发生，因为细菌的SECIS位于翻译区，紧接UGA密码子的下游(金齐等人，2005年；图1一个)。据推测，Sec在古生菌中的插入过程与真核生物中的插入过程相似，因为SECIS元件位于同一区域(图1 c)。

除了直接参与Sec生物合成途径的蛋白质外，古生菌基因组还编码硒结合蛋白(SeBP;Self等人，2004年；Patteson et al.， 2005)。四聚体SeBP结合一个还原态硒分子。虽然SeBP的确切作用尚未阐明，但这些蛋白质被假设为将胞质硒运输到古生菌磷酸硒合成酶(细菌的同源物)selD基因(Self等人，2004年)。然后磷酸硒合成酶将还原的硒转化为硒单磷酸，硒供体将Sep转化为Sec。tRNA的独特特征促进了复杂的Sec生物合成和翻译途径^{证券交易委员会}结构和SECIS元素的存在。

tRNA^{证券交易委员会}结构

tRNA的结构^{证券交易委员会}是Sec生物合成和插入多肽的单个反应的关键介质。与具有12 bp受体结构域(受体茎和t茎结合)的典型tRNA结构相反，tRNA^{证券交易委员会}有一个13 bp的受体域(Sturchler等人，1993年；图2)。这是tRNA的主要特征^{证券交易委员会}，可阻止一般伸长因子(EF-Tu或EF-1α)的识别，并可通过SelB或EFSec进行伸长。在古生菌中，这个13 bp的受体结构域以9/4的结构被发现，其中9 bp在受体茎，4 bp在t茎(图2 b)。同样的结构也发生在真核生物中(图2 c)，而在细菌中，tRNA^{证券交易委员会}采用8/5配置(Schön等人，1989；伊藤等人，2009年；图2一个)。13 bp的受体结构域在古生菌和真核生物中也作为PSTK和SepSecS的识别元件，并且在细菌中被SelA识别所需要，以将Ser转化为Sec。

tRNA的另一个独特之处^{证券交易委员会}是它的长d形杆和小d形环(图2)。在古生菌中，d臂有一个7 bp的茎和一个4碱基环(图2 b)，不同于真核和细菌tRNA^{证券交易委员会}有6个bp的阀杆和4个基环(图2一个，C)。目前，古生菌中这种7 bp d茎结构的唯一已知例外是在Methanopyrus kandleri编码tRNA的种和石竹门^{证券交易委员会}带6 bp d型阀杆(Sherrer et al.， 2010)。此外，虽然在细菌和真核生物中，d -干分别对SelA和PSTK的识别很重要，但在古生菌中，d -臂与PSTK的c端结构域(CTD)的结合仅在识别中起很小的作用。相反，它是tRNA之间相互作用的主要贡献者^{证券交易委员会}而在古生菌中PSTK是PSTK的13 bp受体结构域与n端结构域(NTD)的结合(Sherrer等人，2008a)。G73鉴别器碱基在所有tRNA中都是保守的^{证券交易委员会}并与PSTK残基相互作用促进Ser-tRNA磷酸化^{证券交易委员会}．此外，tRNA的CCA尾部^{证券交易委员会}并不像在细菌中经常观察到的那样，在古细菌基因组中编码，而是在转录后由cca添加酶添加，类似于真核生物(santesmass等人，2017)。

虽然tRNA的结构^{证券交易委员会}在大多数古生菌中是高度保守的，有某些有机体具有独特的特征。值得注意的是,Lokiarchaeota谱系中含有tRNA的唯一古菌病例^{证券交易委员会}带有内含子的基因(santesmass等人，2017)。内含子LokiarchaeotatRNA^{证券交易委员会}长度为31个核苷酸，位于t臂，这是先前在典型古古tRNAs中观察到的内含子位置(Mariotti等人，2016)。真核生物，水蚤pulex，是迄今为止唯一一个在其tRNA中同时编码的内含子^{证券交易委员会}基因(santesmass等人，2017)。的tRNA^{证券交易委员会}的Candidatus深海古菌还有一个独特的特征，这是古菌所没有的。它的tRNA^{证券交易委员会}U6:U67不匹配(Mukai等，2021)，这是真核tRNA的保守特征^{证券交易委员会}（图2 c)。真核tRNA之间的这些共同特征^{证券交易委员会}与LokiarchaeotaBathyarchaeota表明真核生物的Sec途径是从它们进化而来的。

Sec插入的监管

生物体已经进化出一种高度复杂的方法来区分UGA停止密码子和UGA信号Sec插入密码子。主要的区别因素是被称为SECIS元件的mRNA发夹的存在，它在细菌中与SelB结合，并被认为在古生菌和真核生物中与其他蛋白质形成复合物(Leibundgut et al.， 2005)。细菌SelB通过c端延伸(IV结构域，24 kDa)与SECIS元件结合，而EF-Tu中没有(塞尔默和苏，2002年)。在真核生物中，EFSec的结构域IV明显短于其细菌同源体，因此EFSec不直接结合SECIS元件(Zavacki等人，2003年)。相反，EFSec与SECIS结合蛋白2 (SBP2)相互作用以促进SECIS元件的识别。与EFSec相比，aSelB具有更短的IV结构域(8 kDa)，也不能结合SECIS元素(罗瑟等人，2001年；Leibundgut et al.， 2005)。SelB, aSelB和EFSec与一般延伸因子具有广泛的同源性，包含EF-Tu/EF-1α中发现的五个鸟苷三磷酸结合域中的四个(Fagegaltier等人，2001)。与它们相应的一般伸长因子相比，SelB、aSelB和EFSec在共畴中也含有四个大小不同的缺失，在的aSelB中有第五个缺失产甲烷球菌属jannaschii．然而，SelB、aSelB和EFSec的CTD序列几乎没有相似之处，除了aSelB和EFSec的IV结构域有一个显著的序列守恒块(Fagegaltier等人，2000年)。这些序列和aSelB和EFSec特性之间的相似性进一步支持了古生菌Sec插入机制类似于真核生物的假设，这表明细菌SelB和SECIS元件之间的直接识别在古生菌和真核生物中演变为一种介导的相互作用(Fagegaltier等人，2001)。

古生菌中的SECIS元件位于mRNA的3 ' -UTR (Wilting等人，1997年)。古生菌硒蛋白基因编码一个或两个Sec残基，尽管在每个基因中只发现了一个SECIS元件(罗瑟等人，2000年)。这说明一个SECIS元件在同一基因的两个不同的UGA密码子上插入Sec。观察到的SECIS元件与其调控的Sec密码子之间的距离在70到1500个核苷酸之间(Rother和Quitzke, 2018)。的SECIS元素是一个例外fdhA基因m . jannaschii．在这种情况下，SECIS元素位于5 ' -UTR，其同源Sec密码子上游450个核苷酸(Wilting等人，1997年；Rother和Quitzke, 2018)。据推测，这是由于距离限制，3 ' -UTR距离Sec密码子超过1600个核苷酸。因此，由于SECIS元素位于5 ' -UTR中，更接近Sec密码子，它可以以类似于3 ' -UTR中建议的方式弯曲来调节Sec插入。

尽管SECIS结构高度保守，但其序列在硒蛋白和生物体之间变化很大，这表明没有明显的进化起源。值得注意的是，大多数古细菌SECIS元素都有两个顶端环，这与真核生物和细菌SECIS元素的单一顶端环不同(图1 b，C)。然而，最近研究这些结构的工作揭示了SECIS元素在Lokiarchaeota只有一个尖环(Mariotti等人，2016)，与真核生物(Latrèche等，2009；Mariotti等人，2016)。自Lokiarchaeota与其他古生菌中表达相似的硒蛋白，SECIS元素的不同特征进一步加强了这一理论Lokiarchaeota可能是古生菌和真核生物之间的联系。而且，的发现Lokiarchaeota支持了编码Sec的能力是通过垂直基因转移从古生菌引入真核生物的观点(Rother和Quitzke, 2018)。

虽然SBP2通过将SECIS元件招募到UGA密码子来促进真核生物的Sec插入，但古生菌中还没有发现任何蛋白质参与与SECIS元件的结合(Rother和Quitzke, 2018)。然而，核糖体蛋白L30的同源物被编码在m . jannaschii而且产甲烷球菌属maripaludis（Bult等人，1996年；Poehlein等人，2018)。真核生物中的L30结合真核SECIS元件的扭结转结构，被认为可以触发Sec-tRNA的插入^{证券交易委员会}进入核糖体A位点(Rother和Quitzke, 2018)。确定L30的古生同源物在硒蛋白生产中的功能尚未作为L30在硒蛋白生产中最接近的同源物进行m . maripaludis被证明是必不可少的，从而阻止了通过突变分析来研究其功能。此外,在体外实验结果表明，L30从m . maripaludis不结合古菌SECIS元素。因此，在古生菌中，SelB、核糖体和SECIS元件之间的通信机制是插入Sec来重新编码UGA密码子的机制仍然未知。目前的研究仍然需要解决的问题是，是否有其他潜在的结合蛋白编码在古菌基因组中尚未被发现。

Pyrrolysine插入

吡咯赖氨酸的遗传编码首次在植物的甲胺甲基转移酶中发现甲烷八叠球菌属巴氏细菌2002年(Hao等，2002；Srinivasan等人，2002年)。从那时起，目前已知的大多数编码Pyl的古生菌分为两个甲烷菌科:Methanosarcinaceae而且Methanomassiliicoccus（加斯顿等人，2011a；Borrel等人，2014)。然而，最近发现的非产甲烷菌谱系，CandidatusSifarchaeia，表明Pyl并非产甲烷菌所独有(Sun等，2021年)。氨基酸Pyl是生物合成的酶编码通过pylB，pylC,pylD基因(加斯顿等人，2011b)。与Sec生物合成和插入途径相反，Pyl不以trna依赖的方式合成。相反，像典型氨基酸一样，有一个专用的tRNA等受体(tRNA^所有供试)和氨酰基- trna合成酶(pyrrolyyl - trna合成酶，PylRS)，用于在特定的UAG(琥珀)密码子上插入Pyl (布莱特等人，2004年)。

在基因组中Methanosarcinaceae,所有供试基因以不间断的簇形式存在pylTSBCD,pylT而且所有供试编码tRNA^所有供试和PylRS，分别(Borrel等人，2014)。Methanohalobium evestigatum是一个例外，包含两个独立的基因组簇，pylTS而且pylBCD（加斯顿等人，2011a)。在Methanomassiliicoccus家庭,所有供试基因的组织方式不同于Methanosarcinaceae也来自彼此。在Candidatus甲甲基嗜菌Mx1201所有供试基因编码为pylTSCD,pylB从集群中分离出来(Borrel等，2012)。Methanomassiliicoccus luminyensis拥有两份pylTSBCD的附加第三个隔离副本pylT（Borrel等人，2014)。Pyl系统之间的区别Methanosarcinaceae而且Methanomassiliicoccus进一步反映在他们的PylRS酶的结构中，下面讨论。

PylRS

PylRS的CTD结构与其他II类氨基酰基- trna合成酶(aaRSs;Eriani等人，1990年)。值得注意的是，PylRS的结构与苯丙酰- trna合成酶相似，因为这两种酶都属于II类aars中的同一亚类(Kavran等人，2007年)。PylRS的CTD含有高度保守的催化核心，可容纳Pyl和ATP进行氨酰化(Kavran等人，2007年)。某些类型的PylRS酶还包括一个n端rna结合域，它不像目前已知的任何蛋白质结构域(Jiang和Krzycki, 2012；Wan et al.， 2014)。在古生菌中，PylRS通常由单个编码所有供试而所有细菌和某些古细菌PylRS的CTD和NTD是由两个独立的基因编码的，pylSn而且pylSc（袁等，2010b；Guo等，2022)。在古生菌中发现的PylRS酶可分为三大类:PylSn-PylSc融合类、PylSn+PylSc类和ΔPylSn类(图3一；邓克尔曼等人，2020年；Krahn等人，2020年；Guo等，2022)。

PylSn-PylSc融合类

PylSn-PylSc融合类的古细菌PylRS酶，例如来自Methanosarcinaceae，具有CTD和NTD，由连接器连接在一起。虽然在体外实验表明，NTD是可有可无的活动在活的有机体内没有tRNA的招募是不可能的^所有供试由PylRS NTD (Herring等人，2007年；Nozawa等人，2009年；铃木等人，2017)。

晶体结构表明甲烷八叠球菌属mazeiPylRS与tRNA的T-loop和可变loop相互作用^所有供试，而CTD与tRNA的另一侧相互作用^所有供试（铃木等人，2017)。这种相互作用区分了tRNA^所有供试它的小(三个核苷酸)变量环(图3)从其他具有四个或更多核苷酸的正则trna中分离出来。在PylSn-PylSc类的PylRS酶中，存在广泛的序列变异性。特别是，连接器区域的长度变化很大，从Methanococcoides burtonii连接子长度为14个氨基酸，连接到Myceliophthora thermophila72个氨基酸的连接子(Herring等人，2007年)。此外，与大多数典型氨基酸的aars不同，tRNA的反密码子之间没有相互作用^所有供试以及PylRS的CTD或NTD，便于PylRS编码不同密码子上的非规范氨基酸。

PylSn + PylSc类

最近，人们发现了7个古细菌基因组，它们将NTD和CTD编码为两个不同的基因，pylSn而且pylSc，在细菌中常见(图3一；Guo等，2022)。两个例子是在甲烷微生物古生菌JdFR-19和Candidatus深海龙(Guo等，2022)。在这些情况下，pylSc这两种古菌谱系的序列更接近于细菌pylSc序列在Acetohalobium arabaticum而且Halarsenatibacter silvermanii而不是古生菌中的。与之前发现的Pyl操纵子的相似之处相吻合答:arabaticum和古生菌之间的相似之处pylSc的研究结果进一步支持了Pyl操纵子从古生菌到细菌的LGT假说(Borrel等人，2014；Guo等，2022)。

虽然JdFR-19的PylRS属于PylSc+PylSn类，但该太古菌与PylSc+PylSn类有密切的亲缘关系Methanosarcinaceae，对PylSc-PylSn融合类的PylRS进行编码(Guo等，2022)。另一个近亲Methanosarcinaceae是有机体Methermicoccus shengliensis，对PylRS的ΔPylSn类进行编码(Cheng等，2007)。结合起来，这两个观察结果表明PylSc和PylSn结构域的融合发生在一个祖先的Methanosarcinaceae（Guo等，2022)。由于这类PylRS酶最近才在古生菌中被发现，而且大多在未培养的世系中，这些酶的序列和结构仍需要进一步探索。

ΔPylSn函数类A和B

在某些种类的Methanomassiliicoccus而且CandidatusSifarchaeia血统,所有供试基因被大约140个残基截断，类似于pylSc在细菌中(Borrel等人，2014)。基因组搜索显示，没有类似细菌的基因pylSn，因此，这些PylRS酶属于ΔPylSn类，并被命名为ΔNPylRS (Borrel等人，2014；Willis和Chin, 2018)。尽管NTD对于募集和氨基酰化活性是必要的在活的有机体内， ΔPylSn类的酶表现出与PylSc-PylSn融合类酶相同或更高的活性水平(Willis和Chin, 2018；邓克尔曼等人，2020年)。此外，ΔPylSn PylRS和来自PylSc-PylSn融合类的CTD之间有很强的序列和结构一致性，这表明在没有NTD的情况下，这些酶的催化能力取决于它们同源tRNAs的独特结构(Krahn等人，2020年)。PylSc-PylSn融合类或ΔPylSn类是否是PylRS的祖先形式还有待确认。然而，考虑到大量编码pyl的古生菌和细菌同时包含PylRS的CTD和NTD，很可能祖先的PylRS同时包含CTD和NTD，以及PylRS的n端所有供试基因在7级产甲烷菌中丢失(Borrel等人，2014)。

在ΔPylSn类中，有两个PylRS酶簇(A类和B类)根据它们的序列(邓克尔曼等人，2020年)。相似的聚类反映在同源tRNA中^所有供试基于特征差异。一些ΔPylSn类A酶与tRNA有活性^ΔNPyl(tRNA^所有供试ΔNPylRS所认可的)，并且偏好a类tRNA^ΔNPyl，而另一些则是自然正交的(邓克尔曼等人，2020年)。另一方面，B类酶只对tRNA有活性^ΔNPyl来自同一个班级(邓克尔曼等人，2020年)。这种特异性表明A类和B类氨基酸序列ΔNPylRS进化为识别tRNA的类特异性身份元素^ΔNPyl．此外，许多ΔNPylRS与同源tRNA正交^所有供试PylRS的PylSc-PylSn融合类(邓克尔曼等人，2020年)。然而，这种正交性是单向的，因为PylSc-PylSn融合类的PylRS对A类和B类tRNA都有活性^ΔNPyl．为了实现完全正交，A类和B类tRNA的变量环路^ΔNPyl需要扩展以避免被PylSc-PylSn融合类PylRS (铃木等人，2017；邓克尔曼等人，2020年)。利用这些ΔNPylRS酶对tRNA的特异性^ΔNPyl在同一类中，它们已成为在同一蛋白质中插入多个非规范氨基酸的工程正交策略的重要元素。

tRNA^所有供试结构

所有特征tRNA^所有供试具有高度保守的结构，包括一些显著特征:一个由3个碱基组成的可变环，一个由3-5个核苷酸组成的小d环，以及一个长度为6-8个碱基的长反密码子梗(Tharp等人，2018；图3)。这些tRNA^所有供试还包含G73鉴别器基，由PylRS识别。鉴于最近发现的古细菌编码PylSc+PylSn类PylRS, tRNA的序列和结构^所有供试这类PylRS酶的等受体尚未被探索(Guo等，2022)。因此，我们对tRNA的讨论^所有供试下面的结构将仅限于那些被PylSc-PylSn融合类和古菌PylRS ΔPylSn类所识别的结构，对于这些结构，还有额外的区分特征将它们各自的tRNA分开^所有供试．尽管存在这些差异，但目前尚不清楚tRNA之间是否存在差异^ΔNPyl和其他tRNA^所有供试分子是由于PylRS的NTD缺失而适应的，还是突变产生了tRNA^ΔNPyl促进了新台币的损失(Borrel等人，2014；Willis和Chin, 2018)。

tRNA^所有供试PylSc-PylSn融合酶识别

的tRNA^所有供试PylSc-PylSn类序列发散性较大;然而，有明显的二级结构特征是保守的，不同于tRNA^所有供试来自其他PylRS类。这些独特的结构元件包括一个由5个碱基组成的D-loop，以及一个将D-stem与受体stem分开的碱基，这是细菌tRNA中的一种身份元件^所有供试（加斯顿等人，2011a；图3 b)。tRNA的小D-loop^所有供试是形成致密核心所必需的，这是由tRNA结合结构域1、c端尾和形成PylRS核心结合表面的相反原聚体的α6螺旋所识别的(Nozawa等人，2009年)。序列特异性识别tRNA^所有供试PylRS基因的表达受到反密码子两侧的U33和A37核苷酸、G53:C63 t -茎碱基对和G1:C72受体茎碱基对(Ambrogelly等人，2007年)。

tRNA^所有供试被A类和B类ΔNPylRS酶识别

对于tRNA^ΔNPyl在第七目产甲烷菌中，这种古菌谱系的某些成员编码为多重pylT基因组内具有不同序列的基因(Borrel等人，2014)。tRNA的序列^ΔNPyl也有很大差异(图3 c，D)。与tRNA相比^所有供试由PylSc-PylSn类识别，tRNA的D-loop^ΔNPyl缩短到只有3或4个碱基。d -茎和受体茎最多可被2个碱基分开，保守变量环序列CAG与tRNA匹配^所有供试在细菌种类中发现的Desulfitobacterium hafniense．然而，tRNA最显著的特征^ΔNPyl是断了的反密码子梗(图3 c，D)。这是tRNA的特征^ΔNPyl从所有的7级产甲烷菌中，尽管由这种断裂形成的小环的形状因物种而异。的tRNA^ΔNPylA类识别的分子ΔNPylRS含有A37，毗邻CUA反密码子(图3 c)，如tRNA^所有供试的Methanosarcinaceae，而tRNA^ΔNPylB类识别的分子ΔNPylRS含有C37 (邓克尔曼等人，2020年；图3 d)。B类tRNA中的C37A突变^ΔNPylB类ΔNPylRS/tRNA导致更高水平的琥珀密码子抑制^ΔNPyl对(图3 d)。A类tRNA和B类tRNA序列的其他差异^ΔNPyl分子存在于受体茎、t -茎和t -环中。在A类和B类tRNA中也存在序列多样性^ΔNPyl，而是tRNA的二级结构^ΔNPyl分子在每一类内是保守的(图3 c，D)。

调节Pyl的插入

与Sec插入的严格序列限制相反，Pyl插入可能受到Pyl- trna之间竞争的调控^所有供试以及在模棱两可的UAG密码子上的古菌释放因子，因此不需要额外的蛋白质或mRNA基序进行pyl特异性插入(Zhang et al.， 2005)。按照这种竞争模型，如果在pyl编码的UAG密码子上发生早期终止，被截断的蛋白质就会被降解(阿尔克莱瓦等人，2009)。相反，使用Pyl的UAG密码子的非预期读通是由位于紧密下游的UAA或UGA密码子的终止控制的(Zhang et al.， 2005)。对pyl编码基因组的分析揭示了与SECIS元件相似的茎环结构，称为PYLIS元件，在某些pyl编码基因序列中，它位于UAG密码子的下游(Hemmerle等人，2020年)。然而，PYLIS元件并不存在于所有编码Pyl的基因中，Pyl插入也不是必需的(阿尔克莱瓦等人，2009)。不同种的PYLIS元素在序列和结构上也不存在明显的一致性(Ambrogelly等人，2007年)。

Pyl系统高度集中在有限数量的细菌物种和产甲烷古菌门的成员中Halobacteriota而且Thermoplasmatota，它们是姊妹团体(Zhang等，2022)。因此，该领域的当前状态支持了Pyl被添加到共同祖先的遗传密码的想法Halobacteriota而且Thermoplasmatota为了更好地在极端环境中生存，只会在后来的进化史中消失(Brugère等，2018)。特别是，许多编码pyl的古生菌是栖息在缺氧环境中的甲基营养产甲烷菌。在这种情况下，拥有Pyl机械是必要的，以产生甲胺甲基转移酶，一种酶，产生甲胺甲烷发生(Ambrogelly等人，2007年)。随后，Pyl系统可能是通过7级产甲烷菌的横向基因转移(LGT)引入细菌的Methanomassiliicoccus谱系与细菌的进化关系比Methanosarcinaceae（Borrel等人，2014)。在这种情况下，LGT发生在7级产甲烷菌NTD消失之前。古生菌中Pyl系统的进一步讨论可以在以前的综述中找到(Krzycki 2013；Wan et al.， 2014；鲍曼等人，2018；Brugère等，2018；Tharp等人，2018)。

依赖trna的氨基酸生物合成

蛋白质基因序列的忠实翻译依赖于通过正确的氨基酸氨基酰化到其同源tRNA上成功创建氨基酰基tRNA (aa-tRNAs)。aa-tRNA产生的最直接途径是同源tRNA被其指定的aaRS (图4一)。然而，古生菌并不为全套20种典型氨基酸编码特定的aars，因此通过依赖trna的氨基酸生物合成间接生成aa- trna (Wilcox和Nirenberg, 1968)。与Sec生物合成类似，特定的tRNA异受体被非同源的aaRS误酰化，误酰化的aa-tRNA通过tRNA依赖酶(Sheppard等人，2008b)。在古生菌中，20种典型氨基酸中的3种可以以这种依赖trna的方式合成:半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn;图4 b- - - - - -D)。对于这三种氨基酸，依赖trna的生物合成通过复合物的形成进行——转硫体用于Cys，转酰胺体用于Gln和Asn (Mukai等，2021)。在这些情况下，复合物的形成可以防止误酰化的aa-tRNA在细胞内自由存在并被延伸因子识别，防止误掺入，同时还可以有效地在酶之间穿梭中间体。这些间接生物合成途径与Sec生物合成途径之间的相似性表明PSTK:SepSecS:tRNA的可能性^{证券交易委员会}复杂(Mukai等，2021)。然而，作为tRNA^{证券交易委员会}被EFSec识别，而不是一般的延伸因子，即使没有复杂的形成，Sec生物合成途径也能防止误译，这为进一步研究Sec生物合成途径提供了依据。

半胱氨酸的生物合成

在大多数生物体中，Cys的翻译通过涉及Cys特异性tRNA异受体(tRNA)氨基酰化的典型途径发生^半胱氨酸)通过半胱氨酸- trna合成酶(CysRS)。然而，某些细菌、I类产甲烷菌和Asgardarchaeota缺乏或不需要编码CysRS的基因(Sauerwald等人，2005年；Mukai等，2021)。在这些古菌谱系中，Cys是在tRNA上生物合成的^半胱氨酸，形成Cys-tRNA^半胱氨酸通过类似于Sec生物合成的途径(图1，4 b)。首先,tRNA^半胱氨酸与Sep byO-phosphoseryl-tRNA合成酶(SepRS)产生Sep-tRNA^半胱氨酸，再由Sep-tRNA:Cys-tRNA合成酶(SepCysS)转化为Cys-tRNA^半胱氨酸（图4 b)。用于掺入蛋白质，Cys-tRNA^半胱氨酸通过古菌伸长因子1α (EF-1α)传递到核糖体，并插入到Cys密码子上。

SepRS以α形式存在₄每个SepRS单体包含一个n端扩展域、一个催化域、一个插入域和一个c端反密码子结合域(福永和横山，2007年)。SepRS对氨基酸Sep和GCA反密码子具有特异性。甲基化的G37、G1-C72碱基对和U73鉴别器碱基是tRNA上的身份元素^半胱氨酸用于SepRS绑定(福永和横山，2007年)。SepRS还可阻止EF-1α与Sep-tRNA结合^半胱氨酸以及错将Sep at Cys密码子合并。这是通过SepRS插入域阻断EF-1α结合位点来实现的。此外，凝胶过滤色谱实验表明，在I类产甲烷菌中，SepRS、SepCysS和SepCysE形成SepRS:SepCysE:SepCysS复合物(刘等，2014；Mukai等，2017)。有人提出SepCysE首先促进SepRS和SepCysS之间的相互作用，形成用于识别tRNA的复合物^半胱氨酸（刘等，2014)。一旦tRNA^半胱氨酸与tRNA的CCA尾部的SepRS:SepCysE:SepCysS复合物结合^半胱氨酸Sep被SepRS氨基酰化，然后转移到SepCysS的催化位点进行Sep到Cys的转化(刘等，2014)。SepRS:SepCysE:SepCysS复合物释放Cys-tRNA^半胱氨酸转换完成后(刘等，2014；图4 b)。然而，Asgardarchaeota中依赖trna的Cys生物合成机制略有不同，因为它们的SepCysE蛋白缺乏与SepRS结合所需的n端螺旋(Mukai等，2021)。这表明在这些生物体中，SepRS与SepCysS:SepCysE复合物是分开的。

SepCysS结合是通过识别tRNA上的U73而发生的^半胱氨酸而SepCysE的CTD结合tRNA^半胱氨酸以非具体的方式(陈等，2017)。通过形成这个复合物，Sep-tRNA^半胱氨酸绕过释放到溶液中和被EF-1α结合的风险。SepCysE的NTD同源物也存在于其他古生菌基因组中，要么是SepCysS的一个附加结构域，要么是SepCysS基因上游的一个分裂基因，这可能表明I类、II类和III类产甲烷菌之间发生了LGT事件Lokiarchaeota（Mukai等，2017)。虽然还没有发现古生菌编码两个SepRS副本，但它对tRNA具有很高的特异性^半胱氨酸，有些古生菌含有两份较为模糊的SepCysS基因(Mukai等，2017)。这两个SepCysS基因副本可以属于同一个分支，也可以属于不同的分支，但两个基因产生的SepCysS酶具有相同的功能(Mukai等，2017)。SepCysS的复制可能会增强trna依赖的Cys在应激环境条件下的生物合成。

虽然并非所有产甲烷菌都缺乏CysRS，并且需要依赖trna的Cys生物合成途径，但除了Methanobrevibacter而且Methanosphaera（刘等，2014)。结构分析也支持SepRS和SepCysS先于trna独立的Cys生物合成途径进化(Zhang et al.， 2012)。因此，trna依赖策略被认为是Cys生物合成的祖先模式。然而，一旦不依赖trna的Cys生物合成在细菌中进化，LGT将细菌CysRS引入II类和III类产甲烷菌，导致它们失去仅在I类产甲烷菌中发现的SepCysE (O'Donoghue等人，2005年；福永和横山，2007年；刘等，2014)。自从Sep-tRNA^半胱氨酸在高温下容易水解，因此辅助蛋白将有利于维持Cys-tRNA^半胱氨酸生物合成，导致SepCysE与SepRS和SepCysS共同进化，以克服I类产甲烷菌所居住的极端条件(刘等，2014)。

谷氨酰胺生物合成

所有已知的古菌和大多数细菌谱系都缺乏谷氨酰胺- trna合成酶(GlnRS)编码基因。因此，Gln是在其tRNA等受体tRNA上生物合成的^Gln，在Cys生物合成观察到的两步过程中(Sheppard等人，2008b；图4 b，C)。tRNA^Gln是首先与谷氨酸(Glu)通过非区分谷氨酰- trna合成酶(ND-GluRS)氨基酰化产生Glu- trna^Gln（图4 c)。此时，Glu-tRNA^Gln转化为Gln-tRNA^Gln通过glutamyl-tRNA^Glnamidotransferase (Glu-AdT;Wilcox和Nirenberg, 1968；Lapointe等人，1986年；Schön等，1988)。在古生菌中，异源二聚体GatDE起Glu-AdT的作用(Tumbula等人，2000年)。在生物合成过程中，ND-GluRS和GatDE形成tRNA独立复合体，即古生菌特异性传酰胺体(ND-GluRS:GatDE)，在不需要结合tRNA的表面形成相互作用(Rampias等人，2010)。GatDE增加了ND-GluRS对tRNA的亲和力^Gln通过启动区分tRNA所需的反应^Gln和tRNA^Glu通过GatDE与tRNA的D-loop和A1:U72碱基对相互作用^Gln（Oshikane等人，2006；Rampias等人，2010)。一旦传酰胺酶体结合tRNA^Gln，形成ND-GluRS:GatDE:tRNA^Gln， ND-GluRS氨基酰化tRNA的3 '端^Gln（图4 c)。氨基酰化后，ND-GluRS解结合，生成GatDE:Glu-tRNA^Gln，发生构象变化，使tRNA的谷氨酸化端翻转^Gln进入GatE的催化位点，Glu转酰胺化为Gln (Rampias等人，2010)。由于ND-GluRS和GatDE结合tRNA受体茎的小槽，因此ND-GluRS在氨酰化后必须解结合，因此ND-GluRS阻止tRNA的3 '端进入GatDE的催化口袋(Rampias等人，2010)。也有人提出Gln-tRNA^Gln可以在不形成传氨基酶体的情况下进行生物合成，尽管这种Gln生物合成方法效率较低，因为ND-GluRS辨别tRNA的能力降低了^Glu（Rampias等人，2010)。在这种情况下，ND-GluRS氨基酰化tRNA^Gln释放Glu-tRNA^Gln．游离的Glu-tRNA^Gln然后经GatDE转酰胺化(Rampias等人，2010)。

在所有古细菌物种中缺乏编码GlnRS的基因是一种异常，因为三个结构域之间的aaRS基因普遍存在LGT (沃斯等人，2000年)。这被假设是tRNA之间许多差异的结果^Gln阻止真核生物和细菌的GlnRS识别(Tumbula等人，2000年)。事实上，古细菌tRNA^Gln与细菌tRNA不同^Gln超过一半的单位元素。值得一提的是，古细菌tRNA^Gln含有A73鉴别碱基，而细菌tRNA^Gln含有G73鉴别碱基和真核tRNA^Gln使用U73 (马克和格罗斯让，2002年)。与真核tRNA中高度保守的G1:C72碱基对和G12:C23碱基对相反^Gln，古菌tRNA^Gln拥有A1:U72和C12:G23 (马克和格罗斯让，2002年；马利克等人，2005年)。古生菌tRNA独特身份元素的另一种解释^Gln是为了适应trna依赖的Gln生物合成路线。

天冬酰胺生物合成

大多数古生菌和细菌不编码天冬酰胺- trna合成酶(AsnRS)，因此这些古生菌和细菌谱系也通过转酰胺化和形成转酰胺酶体来生物合成Asn，其过程与依赖trna的Gln生物合成(Sheppard等人，2008b；图4 c，D)。非鉴别天冬酰胺-tRNA合成酶(ND-AspRS)首先氨基酰化天冬酰胺-tRNA (tRNA)^Asn)与天冬氨酸(Asp)和Asp- trna结合^Asn氨基转移酶(Asp-AdT)转换Asp-tRNA^Asn对Asn-tRNA^Asn（Curnow等人，1996年；Becker et al.， 1997)。在古生菌中，异三聚体酶GatCAB专门作为Asp-AdT，而在细菌中，GatCAB同时作为Glu-AdT和Asp-AdT (Sheppard等人，2008a，b)。此外，古生菌和细菌的asn -传氨基酶体的结构不同，因为古生菌传氨基酶体中缺乏GAD结构域，导致Asn-tRNA的释放较慢^Asn（铃木等人，2015)。与Gln生物合成相反，Asn生物合成形成了传酰胺体(ND-AspRS:tRNA)^Asn:GatCAB)依赖于tRNA^Asn结合并在整个连续反应中保持稳定(Bailly et al.， 2007)。这种复杂的功能保护Asn-tRNA^Asn并阻止Asp-tRNA^Asn不被古细菌EF-1α识别为中间体被保存在传酰胺体中直到Asn-tRNA^Asn产生(Bailly et al.， 2007；Huot等人，2007年；刘等，2014)。两种传酰胺酶体之间的差异可能是由于它们的识别位点不同。ND-GluRS和Glu-AdT都结合了小槽，因此不能同时与tRNA相互作用。然而，ND-AspRS与GatCAB相反，结合tRNA主槽，依靠tRNA进行接触(Arnez和Moras, 1997；Bailly et al.， 2007)。

tRNA的系统发育分析^Asn显示了tRNA之间的分裂^Asn古生菌、细菌和真核生物的序列不是很严格(Sheppard和Söll, 2008)。此外，古生菌tRNA^Asn具有G73鉴别基和GUU反密码子，它们是细菌AsnRS识别所需的身份元素(Giegé等，1998；Sheppard和Söll, 2008)。这些身份元素的存在支持了LGT的可能性，导致某些古菌种编码AsnRS并失去依赖trna的Asn生物合成系统。

对于Gln和Asn的间接生物合成，比较系统发育分析表明GatDE和GatCAB都存在于LUCA中，尽管GatDE现在只在古细菌中发现(Sheppard和Söll, 2008)。古菌GatDE对古菌Glu-tRNA碱基的特异性^Gln表明两者共同进化，导致古生菌tRNA的巨大分歧^Gln从其细菌和真核同源物和缺乏GlnRS到古菌的LGT。相比之下，古细菌GatCAB进化出对抗Glu-tRNA的选择^Gln而不是识别Asp-tRNA^Asn，导致tRNA之间的特征保守^Asn以及AsnRS对古生菌LGT的可能性(Namgoong等，2007)。也有可能LUCA的亚群只编码GatCAB，而其他亚群同时编码GatCAB和GatDE。在这种情况下，细菌从只含有GatCAB的亚群进化而来，而古生菌则从同时含有AdTs的亚群进化而来(Sheppard和Söll, 2008)。

一个生物体内的多个遗传编码系统

古生菌是第一个被发现的包含多种遗传密码系统的生命领域(Mukai等，2017)。由于许多古菌物种生活在极端条件下，这是它们生存和克服各种环境挑战的策略，包括高温、高盐浓度和缺氧条件(Reed等，2013)。在这些古生菌中，与氨基酸生物合成或氨基酰化相关的tRNA等受体和酶在结构和序列上通常与典型的古生菌tRNA和aars不同(Mukai等，2017；Sun等，2021年；Zhang等，2022)。由于这些古菌谱系中有许多属于最近发现的或有特征的系统发育类群(Mukai等，2017；Sun等，2021年；Zhang等，2022)，进一步研究这些古细菌及其所拥有的不同编码系统，将有助于揭示不同遗传密码氨基酸的进化史和它们的生物合成策略。

Sec和Pyl编码系统同时出现

最近发现的Asgardarchaeota谱系，CandidatusSifarchaeia，是第一个被确认编码所有必要的非产甲烷古生菌所有供试基因(Sun等，2021年)。这可能是由于Sifarchaeia编码含有pyl的甲胺甲基转移酶，参与产甲烷样途径，这在其他Asgardarchaeota基因组中未见。的组织所有供试Sifarchaeia的基因也是独一无二的，如pylTS编码在一个单独的集群从pylBCD，不同于不间断pylTSBCD在大多数古细菌基因组中可见的簇(加斯顿等人，2011a)。然而，tRNA^所有供试由Sifarchaeia编码的是不寻常的，因为它包含GC尾(Sun等，2021年)，与古菌tRNA区分开来^所有供试含有CCA尾的同源体(Tharp等人，2018)。此外，与其他编码pyl的古菌相比，Sifarchaeia使用UAG密码子作为真正的终止信号的频率要高得多(Zhang et al.， 2005)。UAG终止密码子的高使用引入了Sifarchaeia如何区分Pyl插入或终止的问题，因为还没有发现任何信号或因素以Sec插入的方式调节Pyl插入(Sun等，2021年)。一种假设是，Pyl生物合成可能只有在甲胺存在时才活跃。

除了完整的Pyl机制，典型的Sec生物合成机制也存在于Sifarchaeia中，编码三种硒蛋白(图5；Sun等，2021年)。值得注意的是,tRNA^{证券交易委员会}在这些生物中有一个6 bp的D-stem，这是真核生物和细菌tRNA的共同特征^{证券交易委员会}，以及区分tRNA的其他插入和删除^{证券交易委员会}Sifarchaeia的典型古菌tRNA^{证券交易委员会}（santesmass等人，2017)。Lokiarchaeota在同一门中发现的，也编码这三个相同的硒蛋白，尽管它包含古生菌tRNA的典型7 bp d -干^{证券交易委员会}（Mariotti等人，2016；Sun等，2021年)。

虽然Sifarchaeia是Asgardarchaeota中唯一拥有完整Pyl机器的血统，pylT也发现于其他的Asgardarchaeota，包括Lokiarchaeota而且Thorarchaeota门(图5；Sun等，2021年)。目前的研究表明，Sec和Pyl系统在Asgardarcheota的最后一个共同祖先中共存，Pyl编码在其他Asgardarcheota谱系中通过进化而丢失，而Sec编码得以保留。唯一已知的对Sec和Pyl同时编码的谱系是细菌谱系脱硫杆菌和甲基化甲烷菌Ca。Bathyarchaeota (Borrel等人，2014；Guo等，2022)。这三种世系都在缺氧的海洋沉积物中发现。在这样的环境中，这三种谱系的存在表明，硒蛋白的合成可能有助于通过能量守恒和保护氧化应激在恶劣条件下生存(Sun等，2021年)。

Pyl和trna依赖性Cys生物合成的共现

某种古菌，如产甲烷菌的菌株m . shengliensis使用三甲胺作为甲烷前体，同时具有Pyl和trna依赖的Cys生物合成系统(图5；Mukai等，2017)。Pyl和间接Cys生物合成系统共存可能是由于含有Pyl的酶用于甲胺代谢需要铁硫(Fe-S)蛋白进行厌氧甲烷生成(Rother和Krzycki, 2010)。在这种情况下，使用SepCysS(一种Fe-S蛋白)可能比CysRS(非Fe-S蛋白)对含pyl的酶提供额外的优势(刘等，2016)。

利用Pyl和trna依赖的Cys生物合成系统的古生菌谱系大多生活在缺氧条件下，这是另一种极端环境。例如，PylRS和SepRS在某些亚群中同时出现Archaeoglobus以及在温泉宏基因组中发现的陆生杂Crenarchaeota组(TMCG)的产甲烷菌(图5；Mukai等，2017)。在这种情况下，由于Sep在高温下的稳定性，TMCG的古菌可能更倾向于间接的Cys生物合成途径(牧野等人，2016)。对深海生态系统宏基因组的分析还揭示了另外三种具有SepRS和PylRS (Mukai等，2017)。在这种情况下，对这三种古细菌物种的系统发育分析揭示了Pyl编码系统在不同域分布背后的进化过程。这三个物种的PylRS序列划分了细菌PylRS分支，支持了细菌和古生菌Pyl系统存在LGT的观点。

Sec和trna依赖性Cys生物合成的共同发生

某些I类产甲烷菌，包括m . jannaschii，编码依赖于Sec和trna的Cys生物合成系统(图5)。此外，I类产甲烷菌以外的一些sec编码古生菌也产生SepCysE，包括Lokiarchaeota（图5；Mukai等，2017)。在这两个古菌群中同时存在这两种遗传密码系统，表明古菌的出现先于I类产甲烷菌的分化Lokiarchaeota．尽管SepCysS对tRNA的U73决定因素具有特异性^半胱氨酸，也发现它能结合Sep-tRNA^{证券交易委员会}在没有SepCysE的情况下使用G73 (袁等，2010a)。一个Archaeoglobi具有tRNA依赖的Cys生物合成成分的物种(sepr和SepCysS)具有发散的sec编码系统，该系统具有防止tRNA歧义的系统(图5)。这Archaeoglobi物种的PSTK和SelB融合在一个单一的开放阅读框中，类似于在Ca。Bathyarchaeota，除SepCysE外，还包含所有依赖trna的Cys生物合成机制(图5；Mukai等，2017)。在没有SepCysE的情况下，这种PSTK-SelB融合被建议用于防止Sep-tRNA的意外识别^{证券交易委员会}SepCysS。这一假设不适用于Sifarchaeia谱系，该谱系也编码SepRS和SepCysS，但缺乏SepCysE (图5；Sun等，2021年)。在这个谱系中，PSTK和SelB没有融合在一起，这表明Sec和Cys系统之间存在替代作用和潜在的重叠。Sifarchaeia中可能存在的Sec/Cys交叉对话类似于细菌和真核生物如何将Cys和Sec误结合。这表明真核生物的Sec编码系统可能是从Sifarchaeia谱系(图拉诺夫等人，2009年；徐等，2010)。

同时出现两个不同的PylRS和tRNA^所有供试双

尽管大多数古生菌只编码一个PylRS和tRNA^所有供试对，两个截然不同且相互正交的PylRS/tRNA^所有供试在产甲烷的物种中，已确定对共存m . luminyensisB10和极度嗜盐的古菌甲烷菌Candidatus嗜热卤甲烷菌HMET1 (图5；Zhang等，2022)。系统发育重建表明所有供试而且pylT基因在这两个物种中是独立发生的。此外，Pyl生物合成基因pylB，pylC,pylD也出现了两次m . luminyensisB10基因组，而只有pylB在HMET1中重复。

通过对HMET1中PylRS系统的深入分析，揭示了它们的相互正交性(Zhang等，2022)。这两种酶都属于ΔPylSn类，并共享53%的序列。与PylRS1相比，PylRS2的motif 2环短了一个氨基酸。这一微小差异足以区分两种tRNA^所有供试．具有完整motif 2环序列的PylRS1可识别tRNA^所有供试1、tRNA^所有供试含有G73鉴别基的等受体(pylTG)，而PylRS2可以识别tRNA^所有供试2、tRNA^所有供试与非规范A73鉴别器基(pylTA；Guo等，2022)。的变量循环中还有额外的碱基替换pylTAtRNA的相互正交性(Zhang等，2022)。从目前的研究来看，这两个正交PylRS系统在HMET1中共存的意义尚未确定，尽管有人认为它们可能各自处于不同的环境控制下或具有不同的氨基酸特异性。

在地中海盐水湖1号古菌SCGC-AAA382A20 (MSBL1)谱系(图5；Guo等，2022)。然而,只有pylTA在MSBL1基因组中被发现，而pylTG缺席(Guo等，2022)。此外，在MSBL1中发现了编码SepRS的基因，尽管还没有发现依赖trna的Cys生物合成的其他成分(图5；Mukai等，2017)。由于MSBL1是一个未培养的古菌谱系，其基因组目前仍不完整(Mwirichia等人，2016)，因此进一步描述MSBL1基因组可能揭示这些遗传密码系统中缺失的部分。

多个依赖trna的氨基酸生物合成系统的共存

由于所有已知的古菌都间接生物合成Gln，许多古菌也间接生物合成Asn，多种依赖trna的氨基酸生物合成途径共同存在是常见的。已知缺乏编码AsnRS基因并同时进行trna依赖的Gln和Asn生物合成的古细菌物种包括Aeropyrum pernix，Archaeoglobus fulgidus，Halobacterium salinarum，Methanothermobacter thermoautotrophicum，m . jannaschii，m . mazei，二硫化叶菌物种(图5；Tumbula等人，2000年)。此外，物种m . thermoautotrophicum而且答:fulgidus也含有trna依赖的Cys生物合成的机制，和m . jannaschii包含Sec和trna依赖的Cys生物合成机制，导致多达四种独特的遗传密码系统(图5；Sauerwald等人，2005年；福永和横山，2007年)。三种不同的trna依赖的氨基酸生物合成途径在一个单一的生物体中共存可能是由于这三种系统都被认为存在于LUCA中这一事实。

前景

这些不同的古细菌遗传密码系统已经存在了十多年，如果不是更长的时间。然而，其中一些编码系统的生物合成和调控所涉及的确切机制尚未阐明(袁等，2010b；Mukai等，2021)。古菌域是最后一个被确认的生命域，因此由于技术和生物信息学的进步，新的古菌物种仍在被发现(Tahon等人，2021年)。发现和鉴定古细菌谱系最广泛使用的方法仍然是通过扩增通用16S rRNA基因(贝克等人，2020年)。在这些研究中使用的非特异性引物通常不能针对古细菌基因组的多样性(贝克等人，2006年)。相反，像基因组恢复和重建这样的方法，通过宏基因组组装和装箱，暴露了被忽视的古菌基因组(贝克等人，2020年)。此外，单细胞基因组测序已被用于获取未培养的古菌谱系的遗传信息(Rinke等人，2013)。单细胞基因组学在分析复杂古菌种群的多样性方面也很有用，因为可以从单个细胞的基因组中观察到精细尺度的异质性，这是其他基因组技术所丢失的，来自多个细胞或菌株的复合数据(Blainey 2013)。这些新策略导致了古菌系统发育树的扩展，持续的数据挖掘将导致持续的增长，以填补目前关于古菌翻译的知识空白。

此外，研究古细菌中独特的遗传密码系统有助于遗传密码扩展的应用，利用这些生物中自然的停止密码子重新编码。由于Pyl系统在原核生物和真核生物中与内源性aaRS/tRNA对的自然正交性，已经很容易适应不同密码子的非规范氨基酸(ncAAs)的掺入，tRNA的反密码子独立识别^所有供试，以及PylRS活性位点接受非天然底物的能力(邓克尔曼等人，2020年)。通过引入突变进一步增加不同类PylRS和tRNA之间的正交性^所有供试Pyl系统可用于将多个ncAAs合并到同一肽中。当HMET1 PylRS1/tRNA^所有供试1和PylRS2/tRNA^所有供试2同时用于将两种不同的ncAAs合并到单个蛋白质中(Zhang等，2022)。

更深入地了解古菌基因组也有助于阐明古菌、细菌和真核生物之间的进化关系。古生菌的机制和过程的复杂性与真核生物(Gribaldo和Brochier-Armanet, 2006)。古菌谱系的分析Lokiarchaeota及其Sec机制通过展示古生菌和真核生物两个领域的特征，有助于说明古生菌和真核生物之间的过渡(Mariotti等人，2016)。随着越来越多的古菌基因组被分析，并与细菌和真核生物的基因组进行比较，进化树中的空白将被填补。

最终，对古生菌的专门研究才刚刚开始，还有很多有待探索的地方。特别是，该领域的生物承受各种极端条件的能力尚未得到充分解释，尽管将其与细菌或真核生物中这些系统的更好理解机制进行比较可能有助于理解古菌途径。分析这三个领域的生物之间的差异可能会启发通过借用天然古菌机制来设计细菌和真核生物的增强特性的策略。就像它们所居住的环境一样，古生菌具有多种多样的应用，为未来的发现和创新提供了丰富的潜力。

作者的贡献

KM、CZC、NK撰写了手稿。NK将手稿概念化。DS编辑了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

这项工作得到了国家普通医学科学研究所(R35GM122560-05S1给DS)和能源部基础能源科学办公室(DE-FG0298ER2031给DS)的资助。CZC拥有加拿大自然科学与工程研究委员会(NSERC)的博士后奖学金，KM拥有耶鲁大学耶鲁学院院长研究奖学金。

致谢

我们感谢奥斯卡·巴尔加斯-罗德里格斯的批判性讨论。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

参考文献