宿主相关全基因组分析gydF4y2Ba唾液乳杆菌gydF4y2Ba以及对肝脏抗氧化酶和肠道微生物的影响gydF4y2BaSinocyclocheilus grahamigydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

Sinocyclocheilus grahamigydF4y2Ba，属于鲤科、鲤亚科、鲤属gydF4y2BaSinocyclocheilusgydF4y2Ba它是云南滇池独有的。它被称为“四大名鱼”之一，gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba被捕捞、食用，被认为是一种重要的经济鱼类(gydF4y2BaYin等，2021gydF4y2Ba)．然而，由于栖息地的破坏和外来物种的入侵，gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba1989年被列为二级保护动物，1998年又被列为濒危动物。2007年，为拯救该物种免于灭绝，进行了人工繁殖gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba第一次实现了。经过四代人工选育，培育出优质民族新品种(gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba“河口一号”)于2018年获得认证(gydF4y2BaYin等，2021gydF4y2Ba)．然而，在人工养殖过程中，抗生素通常用于治疗标本中的疾病，包括鳃和皮肤炎症(gydF4y2BaYang等，2007gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在水产养殖中，抗生素常被用作治疗和预防疾病的添加剂，因为它们可以抑制细菌的繁殖(gydF4y2BaVaseeharan和Thaya, 2014gydF4y2Ba)．然而，抗生素的过度使用导致了耐多药病原体的出现，破坏了环境，并对公共安全和健康构成了威胁。先前的研究表明，对多种抗生素具有耐药性的超级细菌可以通过受污染的食物和水在动物和人类之间传播。gydF4y2Ba戴维斯和戴维斯2010gydF4y2Ba)．例如，污染gydF4y2Ba弧菌parahaemolyticusgydF4y2Ba在广东省250份水产品样品中，有95份(38.0%)具有链霉素抗性，其中90.53%的菌株表现出链霉素抗性(gydF4y2Ba谢等，2017gydF4y2Ba)．2020年1月，中国农业农村部发布全面禁止在动物饲料中添加抗生素，以解决与药物残留和抗生素耐药性相关的问题(gydF4y2BaZhou等，2021gydF4y2Ba)．因此，迫切需要挖掘一种安全有效的抗生素替代品，包括益生菌。gydF4y2Ba

人们提出了许多机制来解释益生菌的积极作用，包括刺激免疫系统，帮助宿主抵抗外来有害物质和治病生物的入侵，以及帮助消化(gydF4y2Ba麦克法兰和麦克法兰，1997年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba董等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaSun等，2021年gydF4y2Ba)．例如，蜡样芽孢杆菌NY5可以拮抗gydF4y2Ba链球菌lactisgydF4y2Ba通过调节罗非鱼的特异性和非特异性免疫(gydF4y2BaKe等人，2022gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba乳杆菌gydF4y2BaGG可使环境污染物(土霉素、砷、多氯联苯和毒死蜱)诱导的肠道蠕动障碍正常化gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba影响斑马鱼幼体血清素水平(gydF4y2BaWang等，2022gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba双歧杆菌gydF4y2Ba是否被证明能够缓解两种结肠炎症状gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba通过潜在机制(如增强宿主抗氧化活性、降低髓过氧化物酶活性、活性氧等)进行实验;gydF4y2BaYao等，2021gydF4y2Ba)．此外，与传统抗生素相比，益生菌通过其抗菌、抗氧化、抗炎和免疫调节作用来对抗细菌性疾病和治疗炎症而不增加耐药性(gydF4y2Ba范德霍夫和杨，1998年gydF4y2Ba；gydF4y2BaAbd El-Ghany等人，2022年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYang等，2022gydF4y2Ba)．此外，益生菌作为水补充剂可以通过影响环境中的微生物群落和减少水系统中的代谢废物来改善水质(gydF4y2BaTalpur et al.， 2013gydF4y2Ba)．这些特点导致了益生菌在畜牧业，特别是水产养殖中的广泛使用。在水产养殖中，益生菌可以调节和重建肠道微生态平衡，增强对多种病原体的免疫力，提高饲料能量转化率和生长性能(gydF4y2Ba梅里菲尔德等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaAkhter等人，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaHoseinifar等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaChauhan和Singh, 2019年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba环ø2020gydF4y2Ba)．例如,gydF4y2Ba唾液乳杆菌gydF4y2Ba能抑制生长吗gydF4y2Ba弧菌gydF4y2Ba，以及改善骨化和存活率(gydF4y2BaLjubobratovic等人，2020gydF4y2Ba)．然而，虽然不同来源的益生菌在高等脊椎动物中显示出一致和良好的结果，但对鱼类肠道的影响是可变的。与此同时，使用宿主相关的益生菌作为饲料添加剂对鱼类养殖有积极的影响gydF4y2BaTarkhani et al. (2020)gydF4y2Ba．因此，从宿主肠道中分离出的益生菌比非特异性益生菌具有更大的替代抗生素的潜力。gydF4y2Ba

近年来，越来越多的证据表明，肠道菌群在维持健康和控制疾病方面起着关键作用，调节宿主的许多重要生理功能(gydF4y2BaTran等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaTang等，2021gydF4y2Ba)．乳酸菌(LAB)及其代谢衍生物可以改善肠道菌群，增强宿主对外界有害物质和致病菌的免疫力(gydF4y2BaWang等，2021gydF4y2Ba)．例如，饲养鲫鱼gydF4y2BaLactococcus lactisgydF4y2Ba是否有效治疗肠道炎症和黏膜屏障功能损害引起的gydF4y2Ba气单胞菌属hydrophilagydF4y2Ba（gydF4y2Ba董等，2018gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba乳杆菌gydF4y2Ba恢复了全氟丁烷磺酸暴露下斑马鱼幼体的生长gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba其抗氧化特性，重塑肠道菌群，并促进胆汁酸的产生(gydF4y2BaSun等，2021年gydF4y2Ba)．以往的研究表明，肠道微生物和抗氧化系统对动物体内有害物质具有协同作用(gydF4y2Ba内山等人，2022gydF4y2Ba)．有趣的是，据报道，LAB参与激活动物的抗氧化系统，促进它们对外部变化的适应(gydF4y2BaHan等，2022gydF4y2Ba)．然而，对LAB的影响gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba未报告。这项研究是首次调查肠道微生物的变化gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba饲喂与宿主相关的LAB后。gydF4y2Ba

唾液乳杆菌gydF4y2Ba，是一种宿主相关的细菌，以前从肠道分离gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba（gydF4y2BaXin等，2022gydF4y2Ba)．我们分离得到了5种潜在的益生菌gydF4y2Ba抗菌活性高gydF4y2Ba(例如,两个gydF4y2Ba枯草芽孢杆菌gydF4y2Ba,两个gydF4y2Ba乳酸菌的缘故gydF4y2Ba和一个gydF4y2Bal .唾液链球菌)gydF4y2Ba从内心深处gydF4y2Ba格雷厄姆。gydF4y2Ba特别是细菌素gydF4y2BaLSP01gydF4y2Ba所产生的gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba01的抑菌活性最佳gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba通过干扰细胞活动和诱导孔洞形成抑制病原体的生长gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba细胞。因此，在本研究中，gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba用01来探索益生菌的潜力。对该菌株进行全基因组测序，在遗传水平上评价其安全性和潜在特性。此外，效果gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba牛肝脏和肠道微生物群抗氧化能力的研究gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba采用饲养实验进行评价。结果，gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba被证实是一种安全有效的潜在益生菌，可以增加抗氧化能力，改善肠道菌群gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba．gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

菌株和培养条件gydF4y2Ba

唾液乳杆菌gydF4y2BaS01是一种宿主相关的潜在益生菌，从肠道分离gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba(人工养殖)，云南学院饲料抗生素替代技术工程研究中心(gydF4y2BaXin等，2022gydF4y2Ba)．作为常规使用，菌株在MRS肉汤中37°C传代培养24小时。gydF4y2Ba

全基因组测序gydF4y2Ba

的全部基因组DNAgydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba采用十二烷基硫酸钠(SDS)法结合纯化柱提取S01。使用ONT PromethION测序仪(Oxford Nanopore Technologies, Oxford, UK)对总基因组DNA进行测序。对于过滤，从原始读取中丢弃低质量和短长度的读取。读取数据使用Unicycler V0.4.9软件(gydF4y2Ba维克等人，2017年gydF4y2Ba)．的组装基因组的注释gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01采用Prokka V1.12软件(gydF4y2BaSeemann 2014gydF4y2Ba)．利用RepeatMasker V4.1.0软件预测小鼠基因组重复序列gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01。假基因的预测gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01使用Pseudofinder软件进行。采用MinCED V0.4.2软件对大鼠染色体上的聚类规则间隔回文重复序列(CRISPRs)序列进行预测gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01。基因组中的基因组岛gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01用IslandViewer 4 (gydF4y2Bahttp://www.pathogenomics.sfu.ca/islandviewer/gydF4y2Ba)．基因组中的前体细胞gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01用PhiSpy (gydF4y2Bahttps://github.com/linsalrob/PhiSpygydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

使用几个功能数据库对预测的基因序列进行比较，包括Cluster of Orthologous Groups (COG;gydF4y2BaTatusov等人，2000年gydF4y2Ba)、京都基因与基因组百科全书(KEGG;gydF4y2BaKanehisa等人，2004年gydF4y2Ba)， Swiss-Prot和RefSeq，使用BLASTgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(2.5.0gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)．获得基因功能标注结果，然后进行基因功能标注分析，如COG和KEGG代谢途径富集分析和基因本体(GO)功能富集分析。最后，用antiSMASH (v5.2.0)分析二次代谢基因簇，用BAGEL4 (gydF4y2Ba布林等，2019年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

使用综合抗生素耐药性数据库(CARD) (gydF4y2Ba麦克阿瑟等人，2013年gydF4y2Ba)．CARD数据库被构建为抗生素耐药性本体论(ARO)分类单元，用于关联抗生素模块及其靶标、基因变异等信息。gydF4y2Ba

抗生素敏感性gydF4y2Ba

根据临床和实验室标准协会(CLSI;gydF4y2BaKeter等人，2022年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01在MRS肉汤中培养24 h，测定所选菌株对抗生素(四环素、红霉素、青霉素、氨苄西林和氯霉素)的敏感性。实验独立地重复了三次。gydF4y2Ba

耐受肠胃疾病gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba采用人工模拟胃肠液模型，遵循先前报道的方法，进行了微小的修改(gydF4y2Ba李等，2020年gydF4y2Ba)．将10 g/l胃蛋白酶(Solarbio, Beijing, China)加入16.4 ml 0.1 mol/l无菌HCL中，经0.22 μm孔膜过滤，用1 mol/l无菌NaOH调节pH为2.0、3.0、4.0制备模拟胃液。通过添加10.0 g/l胰蛋白酶(Solarbio, Beijing, China)和6.8 g KH制备模拟肠液gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba至500ml无菌ddHgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.用1 mol/l NaOH将pH调至pH 6.8，通过孔隙为0.22 μm的膜过滤。一毫升gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01(大约10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)混悬液分别接种于pH为2.0、3.0、4.0的5 ml模拟胃液中，37℃孵育3 h。一毫升gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01(大约10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)混悬液接种于5 ml模拟肠液中4 h。然后将菌液在MRS琼脂上培养24 h，测定所选菌株对模拟胃肠液的耐受能力:存活率(%)= lgn1 / lg N2 × 100%，其中N2为所选菌株在0 h时的总活菌数，N1为不同时间暴露于模拟胃肠液后的总活菌数。gydF4y2Ba

鱼类养殖与实验方法gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba实验所用标本由云南昆明益良健之源食品有限公司捐赠。经过一周的隔离，共有60人健康、无损伤、无畸形gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba将长8.0±1.5 mm的鱼种随机分配到6个连续通气的300 l水族箱中，水族箱配有温度和供氧控制装置。gydF4y2Ba

试验分为2组:对照组(n = 3,10 /缸)，饲喂基础饲料(中国昆明Satura)，命名为LSC;处理组(n = 3,10 /缸)，饲喂在基础饲粮中添加gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba(大约1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU / g)。所有样品(60个)均进行了处理。gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba将S01接种于税率为1%的MRS肉汤中，37℃孵育24 h。4 000 × g离心培养10 min，弃上清，PBS重悬细胞球。gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba将S01与饲粮混合均质，采用震荡造粒机(中国广州大乡)125 μm目制粒。最后将混合饲料在通风室中室温干燥。用于板涂层检查的干燥颗粒。gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01(约1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU/g)用活菌测定。每天喂食两次，每次喂食量为体重的3%，连续喂食28天。光暗循环比为14 h: 10 h，每天监测所有水质标准，包括温度(18±0.5°C)、pH(8.0±0.5)和DO(8.5±0.12 ppm)。每天更换一半的水，以确保鱼的最佳生长条件。实验动物按照《实验动物护理和使用指南》的建议进行处理。实验方案经昆明理工大学科研伦理委员会批准。gydF4y2Ba

取样分析gydF4y2Ba

饲养实验结束，禁食24 h后，分别从对照组和实验组中随机选取3尾鱼，采集组织样本。的肝gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba经解剖收集，然后在预冷均质介质(0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA-NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0.01 M蔗糖，pH 7.4)。gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba尸体解剖收集肝标本，在预冷冻均质培养基(0.01 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA-Na)中研磨gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 0.01 M蔗糖，pH 7.4)，离心(4000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置10分钟)。收集所得的上清液并在−80°C保存，以便后续分析肝脏抗氧化酶活性。采集同一鱼的肠道样本，放置在Eppendorf管中，并在−80°C下存储。gydF4y2Ba

肝脏抗氧化酶活性测定gydF4y2Ba

上清液用酶-底物孵育，用UV-8000ST分光光度计(上海源熙仪器有限公司)在指定波长下读取。酶活性测定分为3个重复。过氧化氢酶(CAT;E.C.1.11.1.6)、超氧化物歧化酶(SOD;E.C.1.15.1.1)和过氧化物酶(POD;测定E.C.1.11.1.7)活性和丙二醛(MDA)水平。商业检测试剂盒购买自南京建成生物工程研究所(南京，中国)，并根据试剂盒说明测定所有酶活性。使用CAT活性测定试剂盒(CAT活性测定试剂盒)测定CAT活性。不。A007-1-1)。 CAT can catalyze the decomposition of hydrogen peroxide, and ammonium molybdate can quickly prevent the decomposition of hydrogen peroxide. The remaining hydrogen peroxide can quickly combine with ammonium molybdate to form a pale-yellow complex that can be measured at 405 nm. SOD activity was measured using a total superoxide dismutase (T-SOD) detection kit at 550 nm (hydroxylamine method; cat. no. A001-1-2). The change in POD activity was measured using a peroxidase assay kit at 420 nm (cat. no. A084-1-1). The MDA levels were measured using the Malondialdehyde Assay Kit at 532 nm (TBA method) (cat. no. A003-1-1).

肠道菌群分析gydF4y2Ba

鱼肠样本送往上海迈约贝生物制药科技有限公司进行测序。测序引物为引物338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和引物806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，用于扩增16S rRNA基因V3-V4区。序列分析采用QIIME 1.7和FLASH 1.2。使用QIIME 1.7从原始读取中去除低质量片段，使用FLASH 1.2完成读合并。基于相似度大于97%的阈值，使用usparse对操作分类单元(OTUs)进行聚类。采用RDP分类器算法将97%相似度的OTU代表序列与SILVA数据库进行分类分析。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

经多次比较验证的肠道微生物数据(gydF4y2Ba奈特等人，2018gydF4y2Ba)．学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba-检验(双尾检验)用于鉴定两组在门和属水平上的显著差异。Benjamini-Hochberg (BH)对数据的多重测试调整。gydF4y2Ba

所有实验均重复3次，结果以均数±标准差(SD)表示。独立样本gydF4y2BatgydF4y2Ba-test(双尾检验)用于评估组间方差。采用单因素方差分析+最小显著性差异(LSD)法进行多组显著性分析。gydF4y2BapgydF4y2Ba-值<0.05为显著性。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

草拟基因组测序、组装和绘图gydF4y2Ba

整合预测基因组信息注释绘制的基因组圈图如图所示gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba．最里面的圆圈显示了基因组的编码区(CDS)和非编码RNA区(rRNA和tRNA)。全基因组测序结果显示gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01为1737623 bp, GC含量为33.09%。基因组中共发现编码DNA序列(CDSs) 1753个，rRNA操纵子22个(其中23S rRNA 7个，16S rRNA 7个，5S rRNA 8个)，转移RNA (tRNA)基因78个gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01。此外，预测了1个CRISPR序列和4个基因岛。gydF4y2Ba

染色体上的cdsgydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba使用COG数据库对S01进行标注，结果见gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba．通过COG数据库，将105个基因注释为21个功能类别。主要的cog是翻译/核糖体结构和生物发生(167)，氨基酸运输和代谢(106)，碳水化合物运输和代谢(88)，复制/重组/修复(78)，以及细胞壁/膜/包膜生物发生(72)。此外，GO分析显示470个基因被归类为生物过程，991个基因被归类为细胞成分，1037个基因与分子功能相关(gydF4y2Ba图S1gydF4y2Ba)．KEGG代谢途径分析涉及的一千九十个基因被分为五大类:代谢类(866)，其次是遗传信息处理(183)，环境信息处理(112)，有机系统(15)和细胞过程(14;gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

益生菌性状的基因组特征gydF4y2Ba

研究了以下益生菌特征的基因:对应激条件的耐受性，帮助粘附和定殖，抗氧化应激免疫，以及DNA和蛋白质的保护性修复。基因组分析检测到21个编码蛋白质的基因，这些蛋白质可能与消化酶、胆盐和酸性环境的耐受性有关。此外，与对抗氧化应激的免疫反应、蛋白质和DNA分子修复保护相关的基因也存在于基因组中(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

抗菌物质生产的基因组特征gydF4y2Ba

预测了与抗菌物质合成相关的三个基因簇gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01基因组(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．antiSMASH数据库预测基因组中存在一个聚酮合成酶(T3PKS)合成基因簇。基于BAGEL4平台，结果显示该基因组包含两个细菌素合成基因簇，与预测一致:以肠溶素A为核心基因，包括一个免疫基因和多个转运蛋白基因，以sakacin_G_skgA1 (II类细菌素)为核心基因，包括一个细菌素免疫蛋白基因和一个复制起始蛋白基因。gydF4y2Ba

抗性基因型和表型gydF4y2Ba

抗生素耐药基因的预测结果见gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba．的身份gydF4y2Ba春节(左)gydF4y2Ba而且gydF4y2BaErmCgydF4y2Ba分别为98.03和93.85%;的身份gydF4y2Ba对克罗霉素耐药的大肠埃希菌EF-Tu突变体gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba对利福平耐药的金黄色葡萄球菌rpoB突变体gydF4y2Ba分别为73.03和72.14%;其他耐药基因的同源性均小于70%。gydF4y2Ba

抗生素敏感性试验显示，唾液乳杆菌S01具有良好的抗生素敏感性(gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01对部分抗生素(青霉素、氨苄西林、氯霉素)敏感;gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01对四环素中度敏感。gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01例对红霉素耐药。gydF4y2Ba

在模拟胃肠条件下存活gydF4y2Ba

模拟肠、胃液耐受gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01在pH 2.0, 3.0和4.0时显示在gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba．结果表明，在模拟胃液处理下，所选菌株的存活率在较低pH值下逐渐下降，但在所有pH条件下均保持较高的存活率(> 79.84%)。在模拟肠液处理下，该菌株的存活率为94.04%，表明该菌株对肠道环境适应良好。gydF4y2Ba

肝脏抗氧化酶活性改变gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba补充gydF4y2Ba

如gydF4y2Ba表5gydF4y2Ba、试验组肝脏SOD、CAT和POD水平gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01显著高于对照组(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。与对照组相比，LSM的SOD、CAT和POD酶活性分别显著提高至25.87±2.21 U/g(1.5倍)、124.15±3.91 U/g(1.8倍)和577.67±40.22 U/g(2.0倍)。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。与对照组相比，LSM组MDA水平显著降低43.04% (gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba

的影响gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba鱼类肠道菌群研究gydF4y2Ba

从6个肠道细菌样本的原始序列中剔除低质量reads后gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba，共获得563372条高质量reads。然后根据97%的16S rRNA序列相似性将这些OTUs聚为572个OTUs。gydF4y2Ba

采用Alpha多样性指数评价实验组和对照组肠道菌群的丰富度和多样性，如图所示gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba．反映群落丰富度的指数(Chao1和Ace)和反映群落多样性的指数(Shannon和Simpson)在两组间存在一定差异。gydF4y2Ba

采用主成分分析(PCoA)和非度量多维尺度分析(NMDS)对样本的beta多样性进行分析。PCoA和NMDS结果显示，6个样本被清晰地分为两个聚类，与分组(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)．模型的可靠性由应力值体现，NMDS中应力值为0.0。这些结果表明，虽然补充细菌没有改变肠道菌群的丰富度，但与对照组相比，群落数据发生了显著变化。在门水平上，两组肠道微生物主要由变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门组成，其中(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)．Benjamini-Hochberg (BH)法对肠道微生物数据的多重检测调整。修正后的gydF4y2BapgydF4y2Ba-所有门级别的值为0.4206。在对照组中，变形菌门(Proteobacteria)是最占优势的细菌门，占所有OTUs的93.86%，其次是厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(actinobacterta)和拟杆菌门(Bacteroidota)，分别占3.91、1.55和0.56%。与对照组相比，实验组优势菌比例的顺序没有变化。但实验组中Proteobacteria比例下降至对照组的63.78%，占比59.86%，Firmicutes比例上升至对照组的8.1倍，占比31.64%。与对照组相比，放线菌门(Actinobacteriota)和拟杆菌门(Bacteroidota门)的比例均有不同程度的增加，分别占细菌菌群的3.95%和3.82%。gydF4y2Ba

在属水平上，我们绘制了前10个优势细菌属(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)．Benjamini-Hochberg (BH)法对肠道微生物数据的多重检测调整。修正后的gydF4y2BapgydF4y2Ba前10个优势菌属的-值为0.4269。其中，占的比例gydF4y2Ba气单胞菌属gydF4y2Ba在对照组和实验组之间有所不同。比例从58.23到6.72%不等。其余9个属在对照组与实验组之间差异不显著。gydF4y2Ba洋葱gydF4y2Ba-gydF4y2BaCaballeroniagydF4y2Ba-gydF4y2BaParaburkholderiagydF4y2Ba，gydF4y2BaBlautiagydF4y2Ba，gydF4y2BaRalstoniagydF4y2Ba，gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba,gydF4y2BaSubdoligranulumgydF4y2Ba增加了10.75-、6.30-、12.32-、4.72-、6.45倍gydF4y2BaCandidatusgydF4y2Ba＿gydF4y2BaBacilloplasmagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba不动杆菌gydF4y2Ba从可以忽略不计的增加到2.82和2.68%。其中，微生物区系比例未分类gydF4y2Ba肠杆菌科gydF4y2Ba而且gydF4y2BaGammaproteobacteriagydF4y2Ba从25.74%和2.10%下降到可以忽略不计的数量。这些结果表明，处理后用gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01，肠道菌群中优势菌比例降低，整体菌群多样性增加。gydF4y2Ba

肠道细菌属与肝脏抗氧化酶的关系gydF4y2Ba

为了确定在宿主体内观察到的参与抗氧化能力的肠道细菌属，我们对肠道细菌属与肝脏抗氧化酶活性进行了相关性分析(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)．gydF4y2BaShewanellagydF4y2Ba而且gydF4y2Baunclassified_f__EnterobacteriaceaegydF4y2Ba与肝组织MDA含量呈正相关。gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba，gydF4y2BaBurkholderia-Caballeronia-ParaburkholderiagydF4y2Ba，gydF4y2BaRalstoniagydF4y2Ba，gydF4y2Ba瘤胃球菌属gydF4y2Ba，gydF4y2BaRikenellaceae_RC9_gut_groupgydF4y2Ba，gydF4y2Ba不动杆菌gydF4y2Ba，gydF4y2BaFaecalibacteriumgydF4y2Ba,gydF4y2BaEubacterium_hallii_groupgydF4y2Ba与肝脏中CAT含量呈正相关。gydF4y2BaBurkholderia-Caballeronia-ParaburkholderiagydF4y2Ba而且gydF4y2BaRalstoniagydF4y2Ba与肝组织MDA含量呈负相关。gydF4y2Ba气单胞菌属gydF4y2Ba而且gydF4y2BaShewanellagydF4y2Ba与肝脏中CAT含量呈负相关。gydF4y2BaUnclassified_f__EnterobacteriaceaegydF4y2Ba而且gydF4y2Baunclassified_c__GammaproteobacteriagydF4y2Ba与肝脏中POD含量呈负相关。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

微生态制剂可提高宿主的免疫力，并具有其他有益特性，如无耐药性，无毒副作用(gydF4y2BaMingmongkolchai和Panbangred, 2018gydF4y2Ba)．目前，益生菌微生态制剂已广泛应用于水产养殖(gydF4y2BaGopi等人，2022gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhu等，2022gydF4y2Ba)．然而，微生态制剂中使用的益生菌的选择没有标准。据报道，从宿主中分离出的与宿主相关的益生菌可能具有最有益的效果(gydF4y2BaGiri等人，2014gydF4y2Ba；gydF4y2Ba郝等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba沙里夫扎曼等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba左等，2019gydF4y2Ba)．在这项研究中，gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01，最初从肠道分离gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba，被用作饲料添加剂gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba．根据我们之前的研究，细菌素是由gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01对12种常见病原体(鱼源和食物源;gydF4y2BaXin等，2022gydF4y2Ba)．抗smash次生代谢产物基因簇预测结果和BAGEL4细菌素合成基因簇预测结果也证实了这一现象。在antiSMASH数据库中鉴定了合成的T3PKS基因簇。该基因簇表达的T3PKS可辅助多酮类化合物的生成。多酮类物质具有广泛的抗菌、抗癌、抗氧化、抗寄生虫和抗炎活性(gydF4y2Ba班加等人，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba毛等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba帕蒂尔等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba沃格尔等人，2008年gydF4y2Ba)．在BAGEL4数据库中检测到Enterolysin_A和sakacin_G_skgA1两个细菌素基因簇。肠溶素_a基因簇编码一种能降解细胞壁的细菌素，一种III类细菌素(gydF4y2Ba多斯桑托斯等，2021年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba尼尔森等人，2003年gydF4y2Ba)．sakacin_G_skgA1基因簇编码的sakacin G细菌素可裂解敏感细胞，导致酶和DNA的泄漏，从而诱导细菌凋亡(gydF4y2Ba托多罗夫等人，2011年gydF4y2Ba)．此外，生化实验和基因组分析表明，唾液乳杆菌S01具有良好的抗生素敏感性。因此,gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01在水产养殖病原菌控制方面具有很大的应用潜力。gydF4y2Ba

唾液l .gydF4y2Ba具有良好的抗酸和胆盐能力，通过改变共生LAB和其他细菌的比例来调节肠道微生态平衡，并降低肠道pH值(gydF4y2BaChaves等人，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaMessaoudi等人，2013gydF4y2Ba)．与此同时,gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba具有免疫调节、抗炎及抗感染的特性(gydF4y2Ba兰加等人，2012年gydF4y2Ba)，还能刺激Caco-2细胞抑制IL-8的产生，促进肠道上皮细胞的恢复(gydF4y2Ba阿瑞巴斯等人，2012gydF4y2Ba)．容忍gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba在酸性条件下对其在肠道的定殖起着关键作用，从而确保其益生菌的潜力。本研究的结果gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba在模拟胃肠液环境下的实验证明了这一点gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01能够耐受低pH和蛋白酶的极端条件。同时，在基因组中发现了与益生菌潜能相关的基因，如环境抗性、粘附能力、DNA和蛋白质的保护性修复以及抗氧化免疫。此外，先前的研究表明，动物的抗氧化能力很重要，因为身体倾向于通过正常的细胞代谢以及对环境变化和饮食等因素的反应产生活性氧(ROS)。gydF4y2BaSagada等人，2021年gydF4y2Ba)．肝脏抗氧化能力(如SOD、CAT、POD)是验证鱼类健康状况和营养状况的一种方式，可以调节ROS等氧化剂和抗氧化剂之间的平衡，避免氧化应激(gydF4y2BaBirben等人，2012gydF4y2Ba)．此外，MDA是脂质过氧化的重要产物，MDA的水平是衡量氧化损伤程度的指标(gydF4y2BaSilambarasan等人，2019gydF4y2Ba)．在本研究中，饮食中补充gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01显著提高了抗氧化酶(SOD、CAT和POD)活性gydF4y2Ba美国格雷厄姆gydF4y2Ba．同时，丙二醛水平的显著降低也证实了益生菌诱导的抗氧化酶活性增强了氧化损伤的修复。因此,gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01能够进入肠道，增强宿主免疫力，这是益生菌发挥有益作用的必要条件。gydF4y2Ba

肠道是生物体中最密集的微生物群的家园，并在许多生理功能中发挥重要作用，如宿主代谢和营养(gydF4y2Ba德维拉德等人，2007年gydF4y2Ba)．肠道微生物多样性越高，宿主对病原体的耐受性就越高(gydF4y2Ba哈里森等人，2019年gydF4y2Ba)．在本研究中，小鼠肠道微生物组的Shannon、Chao1和Ace指数gydF4y2Ba美国格雷厄姆gydF4y2Ba在饮食中添加了gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba，表明gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba可以促进宿主肠道微生物的多样性和丰富度，与其他LAB作为膳食补充剂对宿主肠道菌群的改变一致(gydF4y2BaLjubobratovic等人，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaLukic等人，2020年gydF4y2Ba)．此外，先前的研究报告称，肠道菌群的变化可能是导致宿主免疫力变化的原因之一(gydF4y2BaMessaoudi等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaChaves等人，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaFoysal和Gupta, 2022年gydF4y2Ba)．在本研究中，分析肠道菌群中特定菌群的变化很重要。在门水平上，我们发现在饲粮中添加蛋白质后，最优势的变形菌门的丰度下降gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba．水生动物肠道中变形杆菌比例的升高增加了由细菌感染引起的风险gydF4y2Ba中华绒螯蟹gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba方面对虾gydF4y2Ba（gydF4y2Ba丁等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba王等，2019gydF4y2Ba)．饲喂后厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度均有不同程度提高gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba与对照组比较。厚壁菌门可促进纤维分解，使寄主从纤维饲料中获得营养(gydF4y2Ba布鲁克·詹妮弗等人，2009年gydF4y2Ba)．拟杆菌门的主要作用是降解碳水化合物(gydF4y2Ba斯宾塞等人，2006gydF4y2Ba)，而动物肠道中拟杆菌门与厚壁菌门的比例反映了生物体吸收营养物质的能力。此外，主要细菌(包括gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2Ba，gydF4y2Ba乳酸菌gydF4y2Ba,gydF4y2BaLactococcusgydF4y2Ba)可以将碳水化合物转化为乳酸，创造酸性环境，从而抑制病原体，保护肠道(gydF4y2BaMessaoudi等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaChaves等人，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaFoysal和Gupta, 2022年gydF4y2Ba)．放线菌可以产生多种化合物，包括抗生素、酶、酶抑制剂、信号分子和免疫调节剂(gydF4y2Ba乌尔-哈桑和惠灵顿，2009年gydF4y2Ba)．因此，鱼肠道中较高丰度的放线菌可以改善食物消化和生长性能gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba．此外，潜在病原体的丰富gydF4y2Ba气单胞菌属gydF4y2Ba在肠道里gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba却发现潜在有益微生物的丰度降低了gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba增加，饲喂后用gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01补充剂。gydF4y2Ba气单胞菌属gydF4y2Ba是一种在鱼类中发现的常见人畜共患病原体，可引起全身性败血症和局部感染(gydF4y2BaPereira等人，2022gydF4y2Ba)．相反，gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba是健康的重要指标，具有营养、抗肿瘤、抗衰老等潜能，在调节肠道菌群平衡和促进肠道正常发育方面发挥重要作用(gydF4y2Ba迪皮耶罗等人，2020年gydF4y2Ba)．不幸的是,纠正gydF4y2BapgydF4y2Ba-值表示肠道微生物结果假阳性的一定概率。此外，相关分析表明gydF4y2Ba气单胞菌属gydF4y2Ba与抗氧化能力负相关gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba,而gydF4y2Ba双歧杆菌属gydF4y2Ba与抗氧化能力呈正相关。较高水平的肝脏抗氧化酶活性和某些肠道微生物的变化表明gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01补充剂可通过增强免疫力来降低患病几率gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba防止外界有害物质的侵入。基于全基因组数据gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01和肠道菌群的生物信息学分析gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba的机制gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01促进宿主健康已被阐明。这些结果表明gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2Ba可作为潜在的益生菌和抗菌食品添加剂，取代水产养殖中的化学药物和抗生素，促进宿主健康，促进绿色水产养殖实践的发展。然而，本研究仍有一些不足之处，但也有值得考虑的地方。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究的结果表明，其抗菌活性gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01，之前从肠道中分离出来gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba（gydF4y2BaXin等，2022gydF4y2Ba)，可能源于细菌产生的抗菌物质，如T3PKS、Enterolysin_A和sakacin_G。生物。同时,gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01表现出较好的抗生素敏感性。潜在益生菌的相关功能和遗传学分析表明gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01能够应对自然环境的压力，这可能有助于其在肠道的定殖。而且，饮食中还要补充gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01显著改变了大鼠肠道微生物多样性和肝脏抗氧化酶活性gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba．使用gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01作为饲粮添加剂显著降低了小鼠肠道中潜在病原体的丰度，增加了潜在有益微生物的丰度gydF4y2Ba美国grahamigydF4y2Ba．此外，还发现补剂可提高肝脏中抗氧化酶的活性，减少宿主氧化损伤的发生。综上所述，本研究为的应用提供了理论和实验依据gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01作为水产养殖中潜在的益生菌。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号可在以下网址找到:gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba、CP097639、SRR19351072、SRR19351073、SRR19351074、SRR19351075、SRR19351076、SRR19351077。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

W-GX、X-DL和Y-CL对细菌进行了培养和基因组分析，并进行了饲养gydF4y2BaSinocyclocheilus grahamigydF4y2Ba以及它的生理生化测定，他们也写了论文。W-GX、Y-HJ和M-YX贡献了新的试剂或分析工具。Q-LZ和FW对稿件进行了评审和修改。L-BL设计了研究，提供了试剂和分析方法，并撰写和修改了论文。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究由云南省重大科技计划项目(批准号:)资助。202202 ag050008)。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2022.1014970/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

补充图s1 |gydF4y2Ba基因本体(GO)富集分析结果直方图gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01基因组。gydF4y2Ba

补充图s2 |gydF4y2Ba京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果的直方图gydF4y2Ba唾液l .gydF4y2BaS01基因组。gydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba