一种多功能酶组合α-茶头碱和α-茄碱降解一样这种肠道细菌Glutamicibacter halophytocolaS2编码在三糖利用位点上

简介

甾体糖生物碱(SGAs)是天然含氮的特化次生代谢产物，普遍存在于茄科植物中(如马铃薯、番茄、茄子等)(弗里德曼,2006；Ryota等人，2022年)．α-龙葵碱和α-茶头碱是马铃薯块茎中两种主要的SGAs，占总SGAs含量的95% (Ha et al.， 2012)．这两种SGAs由非极性亲脂性类固醇核组成，一端由两个融合的含氮杂环延伸，另一端与极性水溶性碳水化合物组成结合。α-龙葵碱的侧链由太阳三糖((α-l世行[β- (1 - 2)D-Glcp)β- (1 - 3)D-半乳糖吡喃基)，而α-恰aconine的氨基酸则由恰科三糖((α-l世行(α- (1 - 2)l-rhapGlcp1-2)β-D-glucopyranyl) (弗里德曼和麦克唐纳，1997年)．α-龙葵碱和α-查空碱对细菌、真菌、病毒、昆虫、动物和人类有毒，有助于植物保护(Tingey 1984；费厄尔和罗迪克，1993年；Korpan等人，2004年；Yamashoji和Matsuda, 2013；林等，2018)．大量摄入SGAs可引起恶心、发烧、腹泻、头痛及幻觉(Grunenfelder等人，2006)．由于SGAs对人体的潜在毒性，政府已制定指引，限制新马铃薯品种的SGAs含量，以供商业使用(刘等，2020)．收获后，在储存和运输过程中，以及在光、热、切割、切片、发芽和暴露于植物病原体的影响下，糖生物碱含量会增加(邓等人，2020)．目前，降低茄碱含量的主要方法是使用抑芽剂(氯丙磷、CIPC)、转基因和控制贮藏条件。然而，化学和基因改造方法都有明显的不足(史密斯和布赫，2012年；Sawai et al.， 2014)．因此，确定一种更安全的降低马铃薯中茄碱含量的策略至关重要。

α-龙胆碱和α-查空碱经酸水解或酶水解降解(弗里德曼等，1993年；Weltring等人，1997年)．酸水解和两相酸水解等化学反应需要高达85℃的温度，并产生大量的化学废物。此外，由于SGAs选择性和产量较低，化学方法在马铃薯中控制SGAs已被遗弃(李等，2019)．马铃薯提取物和真菌病原菌提取物中的部分酶含有α-茄碱和α-查头碱的降解活性(Weltring等人，1997年；尼科利奇和斯坦科维奇，2005年；达林等人，2017年)，可逐步降解碳水化合物。α-龙葵碱和α-查aconine的完全去糖基化需要多种糖苷水解酶(GHs)的参与。酶被认为是天然产物，发现酶的独特功能非常有利于发展环境友好型和可持续的资源利用(费尔南德斯,2010；Cheng等人，2021)．目前，关于参与α-龙葵碱和α-查头碱降解的微生物以及微生物酶的使用的信息有限。小田等人(2002)发现,Plectosphaerella cucumerina只能产生αl-鼠李糖苷酶，可将α-恰空碱降解为β₁而不能降解α-茄碱。詹森等人(2009)报道了地下水中的微生物可以逐步水解α-茄碱为β-茄碱、γ-茄碱和茄碱，并将α-查空碱降解为β-查空碱、γ-查空碱和茄碱。这些产品的毒性依次降低，但未鉴定出参与该过程的微生物种类。轩尼诗等人(2018)发现,节细菌属而且沙雷氏菌属β-半乳糖苷酶(GalA)、β-葡萄糖苷酶(GluA)和α-鼠李糖苷酶(RhaA)分别属于GH2、GH3和GH78蛋白家族，能有效降解α-茶头碱和α-茄碱。α-查aconine和α-茄碱完全去糖基化的基因簇的酶活性被鉴定(轩尼诗等人，2020年)．然而，没有评估每种酶单独或联合的作用，以确定两种化合物降解所涉及的不同步骤。

我们最近进行了分离和描述Glutamicibacter halophytocolaS2，一种能够完全降解SGAs的细菌一样这种肠胃，可以提高适应度p .这种以含有大量有毒SGAs的土豆为食此外，还鉴定了一个基因簇，由编码RhaA, GluA和GalA的三个基因组成g . halophytocola这些基因在α-茄碱培养基上表达量较高(Wang等，2022)．本研究旨在评价这三个基因编码的酶的作用，无论是单独的酶还是联合的酶，以确定α-查头碱和α-茄碱降解所涉及的不同步骤。本文描述的三种酶在去除有毒糖苷生物碱方面具有潜在的应用价值，有助于我们加深对昆虫肠道微生物解毒机制的认识。

材料与方法

菌株和培养条件

常规在液体或固体(1.5%琼脂)溶菌肉汤(LB)培养基中25°C (g . halophytocolaS2)或37°C(大肠杆菌克隆和表达)。必要时，在培养基中添加100 μg/mL氨苄青霉素。

基因克隆及重组蛋白的制备

基因组DNAg . halophytocola采用冻融法提取S2Zheng等(2017)．引物设计用于靶向完整的基因序列，没有任何预测的信号肽(表1)．三个基因被扩增g . halophytocola采用Q5高保真DNA聚合酶(NEB，美国)和相应的正向和反向引物，通过聚合酶链反应(PCR)检测S2基因组DNA。PCR产物使用E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit (Omega, USA)进行纯化。质粒pET15b (Novagen, USA)含有氨苄西林选择性标记和n端HIS标记，经修饰后用作克隆和异源表达载体(轩尼诗等人，2020年)．质粒提取使用质粒Mini试剂盒I (Omega)进行。三个基因构建被克隆到濒死经历I位点pET15b载体(Novagen)。消化产物用凝胶提取试剂盒(Omega)回收。采用One Step Cloning Kit (Vazyme, China)进行重组。

向量结构被转换成大肠杆菌TOP10, 37孵育一夜^°C在LB琼脂上加氨苄西林(100 μg/mL)。重组菌落从平板上摘取，在37℃添加适当抗生素的LB肉汤中培养^°C夜间伴有颤抖。重组质粒使用Plasmid Mini kit I (Omega)进行纯化，并在生产重组酶前进行DNA测序验证。

在酶的生产中，重组质粒(pET15b-000599/000600/000601)转化为活性质粒大肠杆菌BL21(DE3)-LysS, 37℃孵育过夜^°C在LB琼脂上用氨苄西林(100 μg/mL)和氯霉素(30 μg/mL)接种。从盘子中挑选单个菌落，在37岁时进行栽培^°C在20毫升LB肉汤中摇晃，并加入适当的抗生素(Mikkel等人，2018)．异丙基-β-D当光密度为600 nm (OD)时，加入终浓度为0.5 mM的-硫半乳糖yranoside (IPTG)₆₀₀)为0.3 ~ 0.6,16时继续诱导培养^°离心收集细胞，重悬于0.5 mL裂解液[50 mM . C]中N——(2-hydroxyethyl)哌嗪-N '-乙烷磺酸(HEPES)， pH 7.5, 300 mM NaCl, 2 mM二硫苏糖醇(DTT)， 1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)， 1 mM DNAse]。超声破碎细胞，4°C下18000 rpm离心30 min后收集上清液。随后，缓慢加入3ml平衡镍珠(Sigma-Aldrich)^°C使蛋白质样品完全结合。然后，加入15 mL溶液A (50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl)进行第一次洗涤，然后加入20 mL溶液B (50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 50 mM咪唑)进行第二次洗涤。最后加入10 mL C溶液(50 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 200 mM咪唑)进行洗脱，收集洗脱液。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对洗脱液中的蛋白质进行分析。

酶反应和活性可视化

筛选重组酶对4-硝基苯α-的活性l-rhamnopyranoside (pNP)糖苷，包括pNP -α-l-rhamnopyranoside,pNP -β-D-galactopyranoside,pNP -β-D-吡喃葡萄糖苷(Yuanye, China)和对抗马铃薯SGAs α-chaconine和α-龙茄碱(Extrasynthese, France)。用于检测酶活性对1mmp将5 μL 5 mg/mL重组酶加入95 μL HEPES缓冲液(pH 7.5)中，25℃孵育1 h，在405 nm处用EPOCH微板光谱仪(轩尼诗等人，2020年)．1单位(U)酶活性定义为每毫克重组酶在100 μL含1mm的50 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)中在405 nm / min时吸光度值的0.01变化pNP苷。对于每个样本，活性分别测量三次(李等，2019)．

为了测试酶对SGAs底物的活性，重组酶样品用50 mM HEPES稀释至5 mg/mL。对α-龙葵碱，在含100 μg/mL α-龙葵碱的HEPES缓冲液(pH 7.5)中分别加入重组酶(RhaA单独、GluA单独、GalA单独、RhaA + GluA、RhaA + GalA、GluA + GalA、RhaA + GluA + GalA)各5 μL，使反应总体积为100 μL, 25℃孵育1 h。对照反应为含100 μg/mL α-龙葵碱的50 mM HEPES缓冲液100 μL。共设8个处理，每个处理3个重复。对α-查aconine，在含100 μg/mL α-查aconine的95 μL或90 μL HEPES缓冲液(pH 7.5)中加入5 μL重组酶(RhaA单独、GluA单独、RhaA + GluA)， 25℃孵育1 h。对照反应为含100 μg/mL α-查aconine的50 mM HEPES缓冲液100 μL。因此，共设4个处理，每个处理3个重复。

样品在配备Shim-pack XR-ODS III色谱柱的液相色谱质谱(LCMS)-8040系统(岛津)上进行分析。以0.3 mL/min的流速，取每个样品10 μL注入ODS柱(ID 2.0 mm × 75 mm长，直径1.6 μm;Shim-pack)。流动相由溶剂A(0.05%甲酸水溶液)和溶剂B(乙腈)组成，采用梯度模式进行分离。采用负电喷雾电离模式检测α-茄碱m/z 868.05， β₁-茄碱m/z 706.4， β₂-茄碱m/z 722.4， γ-茄碱m/z 560.4， α-查康碱m/z 852.10， β-查康碱m/z 706.4， γ-查康碱m/z 560.4，茄碱m/z 396.90) (詹森等人，2009年；Wang等，2022)．由内标产生的具有特定质量电荷比的离子(母离子)被选择并破碎以获得其子离子。用特定的子离子生成相应化合物的色谱图。得到了内标物的峰面积和各自目标化合物的峰面积。每种化合物的浓度通过比较其峰面积与其各自内标物的峰面积(Wang等，2022)．采用标准曲线法测定α-龙葵碱和α-茶头碱的含量。

统计分析

所有分析均使用数据处理系统(DPS)软件版本14.0 (唐锋，2012)．用Student 's比较两组间的差异t以及,P< 0.05为差异显著。两组以上的差异通过重复测量的单向分析与邓肯的多重比较，与P< 0.05为差异显著。使用GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA, USA)绘制统计数据。数据以三个独立实验的均值±标准差(SD)表示。

结果

克隆了3个糖苷水解酶基因，并纯化了重组酶

为了检查酶编码基因的功能，三个基因-GE000599，GE000600,GE000601-被克隆到大肠杆菌从基因组中g . halophytocolaS2。这些基因的长度分别为2487、2340和2526 bp (图1一个)．纯化的重组蛋白RhaA、GluA和GalA分别用10% SDS-PAGE进行分析，其大小分别约为93、87和95 kDa (图1 b)．

3种酶均表现出不同的底物水解活性

纯化的3个ga降解基因表达的重组酶用各种酶进行检测pnp -糖苷，包括α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶的底物，以确定这三种酶的活性(图2)．RhaA和GluA均表现出水解活性pNP -α-l-rhamnopyranoside,pNP -β-D吡喃葡萄糖苷,pNP -β-D-galactopyranoside。RhaA表现出较高的水解活性pNP -α-l-rhamnopyranoside和pNP -β-D-吡喃葡萄糖苷，但对水解活性弱pNP -β-D-半乳糖皮甙，而GluA表现出较高的水解活性pNP -β-D吡喃葡萄糖苷和pNP -β-D-半乳糖皮甙，但对水解活性较弱pNP -α-l-rhamnopyranoside。GalA对这两种酶均有水解活性pNP -β-D吡喃葡萄糖苷和pNP -β-D-半乳糖吡喃苷，但水解活性对pNP -β-D-半乳糖吡喃苷的活性较强pNP -β-D吡喃葡萄糖苷。这些结果表明，纯化的酶具有较高的水解活性，但没有明显的特异性。

3种酶均能单独或联合降解α-查头碱和α-茄碱

通过LC-MS分析，从α-查空碱和α-茄碱中分离出3个单糖，得到中间化合物β-查空碱、γ-查空碱、β₁-茄碱和γ-茄碱(图3，4)．与对照相比，α-茄碱、β₁-茄碱、α-查空碱和β-查空碱在加入RhaA后显著降低(α-茄碱:F= 62.40,P< 0.05;β₁茄碱:F= 20.47,P< 0.05;α-chaconine:F= 547.09,P< 0.05;β-chaconine:F= 577.05,P< 0.05)， γ-茄碱、γ-查空碱和茄碱的峰面积显著增加(γ-茄碱:F= 104.79,P< 0.05;α-solanine-solanidine:F= 128.04,P< 0.05;γ-chaconine:F= 38.70,P< 0.05;α-chaconine-solanidine:F= 143.95,P< 0.05) (图3一，4)．这是因为RhaA对α-具有较高的水解活性l-鼠李糖吡喃苷和β-D-吡喃葡萄糖苷，但对β-的水解活性较低D-半乳糖吡喃苷，导致γ-茄碱的部分积累。然而，茄碱的生产结果表明，单独添加RhaA可以去除α-茶头碱和α-茄碱中的三种低聚糖。

加入GluA后，α-茄碱的峰面积、β₁-龙葵碱、γ-龙葵碱、α-查空碱和γ-查空碱均显著降低(α-龙葵碱:F= 63.47,P< 0.05;β₁茄碱:F= 21.8,P< 0.05;γ茄碱:F= 24.52,P< 0.05;α-chaconine:F= 289.06,P< 0.05;γ-chaconine:F= 167.84,P< 0.05)，而茄碱显著升高(F= 272.46;P< 0.05) (图3 b，4 b)．这些结果表明，单独添加GluA也能去除α-茶头碱和α-龙葵碱中的三种寡糖。单独加入GalA可产生大量的β中间体₁茄碱(F= 1304.30,P< 0.05) (图3 c)．GalA对β-具有较高的水解活性D-吡喃葡萄糖苷，因此它不能水解α-l-鼠李糖吡喃苷，导致β的积累₁茄碱。茄碱的峰面积显著减小(F= 61.35,P< 0.05)，说明GalA可降解茄碱。

随着RhaA和GluA的加入，α-茄碱的峰面积、β₁-茄碱、α-查空碱、β-查空碱和γ-查空碱均显著降低(α-茄碱:F= 63.50,P< 0.05;β₁茄碱:F= 19.62,P< 0.05;α-chaconine:F= 553.784,P< 0.05;β-chaconine:F= 1310.155,P< 0.05;γ-chaconine:F= 555.149,P< 0.05)， γ-茄碱和茄碱的峰面积显著增加(γ-茄碱:F= 36.90,P< 0.05;α-solanine-solanidine:F= 56.132,P< 0.05;α-chaconine-solanidine:F= 31.443,P< 0.05) (图3 d，4摄氏度)．这是因为RhaA对α-具有较高的水解活性l-鼠李糖吡喃苷和β-D-吡喃葡萄糖苷，但对β-的水解活性较低D-半乳糖吡喃苷，导致γ-茄碱的部分积累。

随着RhaA和GalA的加入，α-茄碱和β的峰面积增加₁-龙葵碱显著降低(α-龙葵碱:F= 55.30,P< 0.05;β₁茄碱:F= 20.52,P< 0.05)，而茄碱显著升高(F= 152.01,P< 0.05) (图3 e)．添加GluA和GalA后，α-龙葵碱和γ-龙葵碱的峰面积显著减小(α-龙葵碱:F= 63.40,P< 0.05;γ茄碱:F= 28.62,P< 0.05)，而茄碱显著升高(F= 287.40,P< 0.05) (图3 f)．当这三种酶(RhaA, GluA和GalA)加在一起时，α-茄碱，β₁-茄碱、γ-茄碱均下降(α-茄碱:F= 63.664,P< 0.05;β₁茄碱:F= 21.121,P< 0.05;γ茄碱:F= 54.952,P< 0.05)，最终产物茄碱的峰面积显著增大(F= 219.54,P< 0.05) (图3 g)．

讨论

酶采是一种很有前途的方法来弥补现有催化剂的不足(内斯特等人，2011年)，而微生物资源的开发是该方法的重要策略(爱,2009年；辛格等人，2019年；Cheng等人，2022)．α-l-Rhamnosidase,β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶是三种常见的糖苷水解酶，分别属于GH78、GH2和GH3糖苷水解酶家族(Dong等，2021；Cheng等人，2022)．这三种酶可以从各种来源获得，如微生物、植物和动物。然而，根据它们的来源，它们的酶的性质明显不同，这取决于它们的来源(Finocchiaro等人，1980年；Cheng等人，2021)．与其他可用的来源相比，微生物具有许多优点，包括易于处理，更高的繁殖率和高产量。最近，这些酶已从广泛的微生物中分离和纯化出来(Panesar等人，2010；Emanuelle等人，2022；Kim等人，2022年)．在我们之前的研究中，我们首先发现了一个编码α-的基因簇l-rhamnosidase,β-D-半乳糖苷酶和β-D中葡糖苷酶g . halophytocolaS2 (Wang等，2022)．在目前的研究中，有三个基因(GE000599，GE000600,GE000601)在前人研究的基础上克隆并表达重组蛋白，证实了这3种酶的多功能活性。

在此基础上总结了α-龙葵碱和α-茶头碱的降解过程詹森等人(2009)α-茄碱降解的主要途径g . halophytocolaS2可以总结为(图5一个,对吧)。α-茄碱降解的第一步g . halophytocolaS2是去除侧链上的β-葡萄糖生成β₁茄碱。在这一步中，RhaA、GluA和GalA都可以参与，但RhaA和GluA是关键酶。第二步，去除α-鼠李糖得到γ-茄碱。RhaA和GluA都可以参与这一步骤，但RhaA是关键酶。最后一步是去除β-半乳糖得到茄碱。RhaA, GluA和GalA都可以参与这一步骤，但GluA和GalA是关键酶。少量的β₂-本研究中一些处理产生的茄碱(图3 a, D)表明α-茄碱的分解可能存在二级降解途径g . halophytocolaS2 (图5一个(左)。该次级途径包括第一步从α-茄碱侧链上去除α-鼠李糖，然后在第二步去除β-葡萄糖生成γ-茄碱。此外，研究了α-查空碱的降解途径g . halophytocolaS2也可以进行总结，并且与许多报告一致(图5 b；弗里德曼等，1993年；小田等，2002年；Koffi等人，2017)．然而，本研究发现，单独的RhaA和GluA也可以降解α-恰空氨酸，即第一步是去除α-恰空氨酸侧链上的鼠李糖来生成β₁-鼠李糖，第二步去除另一个鼠李糖得到β₂-chaconine。RhaA和GluA都可以参与这两个步骤，其中RhaA是关键酶。因为β的m/z₁-恰空碱和β₂-chaconine成分相同，LC-MS分析均称为β-chaconine。在该途径的最后一步，RhaA和GluA也可以参与β-葡萄糖的去除，但GluA是关键酶。

马铃薯病原真菌产生的粗蛋白质提取物赤霉菌属pulicaris能降解α-茶头碱和α-茄碱，但具有菌株特异性。例如，菌株R-7843只能降解α-查aconine，而菌株R-6380只能降解α-茄碱(Weltring等人，1997年)．Hennessy et al. (2020)发现该基因编码的三种酶的酶活性聚集在一起节细菌属sp. S41参与了α-茶头碱和α-茄碱的完全去糖基化，但各酶的具体功能和降解途径尚不清楚。本文研究了这三种酶的多功能活性和特异性降解途径g . halophytocolaS2。阐明了α-茶头碱和α-茄碱的分子降解机理g . halophytocolaS2在内脏p .这种．此外，本研究中仅发现RhaA和GluA可降解α-龙葵碱和α-恰空碱，此前未见报道。因此,g . halophytocola具有去除马铃薯食品中α-茶头碱和α-茄碱的潜力，具有降解活性高、绿色环保的优点，应用前景十分广阔。该菌株产生的多功能酶具有较高的糖苷水解酶活性和清晰的序列信息，为生产茄碱提供了一种有效且环保的方法。它可以减少酸/碱、有害有机试剂和原料的消耗，具有很大的发展潜力。进一步的工作将在两种重组酶RhaA和GluA的产品研究上进行。此外，下一步将通过计算分析预测酶的潜在催化残留和底物的结合机制，并在分子水平上了解酶对底物的催化作用。这将为今后通过蛋白质工程改善酶的性质奠定理论基础。

结论

产生的三种酶g . halophytocolaS2具有多种功能，能有效降解α-茄碱和α-茶头碱g . halophytocolaS2。本研究不仅阐明了的分子机制g . halophytocolaS2对α-茄碱和α-查头碱的降解，同时也确定了三种去糖基化酶降解α-茄碱和α-查头碱的具体步骤。这些发现有助于理解昆虫肠道微生物的解毒机制。同时，这3种多功能酶具有较高的糖苷水解活性和清晰的基因序列信息，在马铃薯等茄科食用植物中去除有毒SGAs方面也具有应用潜力。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, CP102487。

作者的贡献

GX和BC构思了这个想法，编辑了手稿，并对工作的概念做出了实质性的贡献。WW和GD分别进行基因克隆和蛋白表达纯化。WW、GY、KZ进行酶活测定和SGAs降解活性测定。WW进行了统计分析并撰写了原稿。所有作者均已阅读并批准稿件内容，并对文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

资金

国家自然科学基金项目(No . 32060616和31760519)和中国烟草总公司科技重大专项项目(No . 31760519)资助。110202101049 (LS-09)]。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

参考文献