原创研究文章

前面。Microbiol。，07 November 2022
第二节脊椎动物消化系统中的微生物
https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1028913

肠道微生物群产生的短链脂肪酸与对氯苯丙氨酸诱导的认知障碍有关

烟波刘 ¹，

甄李 ¹，

天的太阳 ¹，

中国他 ¹，

Hongbing香 ^{1 *}而且

6月熊^{2 *}

¹中国武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉疼痛科
²中国武汉华中科技大学同济医学院附属协和医院肝胆外科中心

神经认知障碍(NCDs)包括影响许多患者的复杂和多因素疾病。5-羟色胺(5-HT)神经元系统在非传染性疾病中起着重要作用。已有研究报道，对氯苯丙氨酸(PCPA)作为一种5-羟色胺清除率对认知功能有负面影响。然而，我们认为PCPA可能通过其他途径导致非传染性疾病。为了探索这种可能性，我们进行了行为测试，以评估ppca治疗小鼠的认知功能，表明认知功能障碍和抑郁样行为的出现。此外，16S rRNA和代谢组学分析表明，生物失调和醋酸盐交替可能与pcpa诱导的非传染性疾病有关。我们的研究结果表明，不仅5-羟色胺耗竭，生物失调和醋酸盐交替也导致了与pcpa相关的非传染性疾病。具体来说，后者通过降低短链脂肪酸水平促进非传染性疾病。总之，这些发现提供了一种对pcpa诱导的非传染性疾病的另一种视角。

简介

神经认知障碍是一组最常见的精神障碍，与阿尔茨海默病(Liu等，2022a)和帕金森氏症(巴巴等人，2022年)．根据《精神障碍诊断和统计手册》第五版，非传染性疾病通常以谵妄开始，随后是主要综合征和轻度非传染性疾病及其病因学亚型，其中潜在的病理是确定的(美国精神病学杂志，2013)．

一些关于非传染性疾病的研究试图概述其潜在机制，关于5-HT神经元和认知之间关系的理论一直是神经科学研究中一些最活跃的争议的核心(美尼斯,1999；Bacqué-Cazenave等，2020；布朗洛等人，2020年；Ni等人，2021年)．鉴于非传染性疾病对个人的负面影响及其与与社会负担有关的其他结果的相关性，这种强调是可以理解的。5-HT神经元在上行网状激活系统中起关键作用;因此，它们与睡眠-觉醒行为的调节有关(麦考密克和巴尔，1997年；蒙蒂2011；伊藤等人，2013)．对氯苯丙氨酸(PCPA)是一种不可逆的色氨酸羟化酶抑制剂，可在药理学上消耗5-羟色胺并导致动物失眠(Mouret等人，1968年；Jouvet 1969；Murray等，2015)．先前的研究报道PCPA会导致失眠(Mouret等人，1968年)和焦虑(Farabollini等人，1988)。目前的研究大多集中在PCPA和随后的非传染性疾病引起的5-羟色胺消耗的影响(Pham等，2017；里加等人，2020年；Ghaheri等人，2022年)．然而，PCPA是否通过其他途径发挥作用尚不清楚。

肠道菌群在许多宿主生理过程和各种疾病的发展中起着至关重要的作用(李等人，2020年；Si等人，2022b；Zhou等，2022a)．许多研究已经确定了肠道菌群与非传染性疾病之间的关系(Arnoriaga-Rodríguez和Fernández-Real, 2019；刘等人，2020；Wang等人，2021年)．例如，一项研究表明，肠道菌群的变化通过肠道衍生的神经递质和微生物代谢物影响血脑屏障，这可能与各种认知障碍有关(Arnoriaga-Rodríguez和Fernández-Real, 2019)．短链脂肪酸(SCFAs)，如醋酸、丙酸和丁酸，是膳食纤维的主要生产者，它是通过胃肠道的糖化发酵产生的。SCFAs通过局部效应、免疫系统和肠-脑信号影响宿主的认知功能(刘等人，2020)．此外，SCFAs可通过调节神经递质发挥作用。在以前的研究中，丙酸诱导酪氨酸羟化酶的基因转录，酪氨酸羟化酶是一种参与儿茶酚胺生物合成的酶(Nankova等，2014；Dalile等人，2019年)，它是中枢神经元系统中的一种神经递质。姚等人(2022)而且Si等人(2022a)证实了PCPA给药与动物生态失调之间的关系。特别是后一项研究表明，pcpa诱导的5-HT耗竭会影响啮齿动物肠道菌群。这些发现表明，肠道菌群及其主要生产者是参与pcpa诱导的非传染性疾病进展的重要因素。

基于上述背景，我们对PCPA引起的认知功能障碍进行了广泛的研究。PCPA治疗后，进行行为试验、16S核糖体RNA (16S rRNA)分析、血清5-HT和SCFA水平评估。我们的结果表明，pcpa诱导的非传染性疾病通过SCFAs与生物失调相关。

材料与方法

动物

实验对象为雄性C57BL/6J小鼠，6-8周龄，购自北京维生河实验动物科技有限公司(北京，中国)。他们被保存在标准的住房条件下(23±1℃的室温，55±5%的相对湿度和12/12小时的明暗循环)。同济医学院同济医院动物护理与利用专业委员会批准了本研究(编号:no。TJ0803)。

Para-chlorophenylalanine治疗

对氯苯丙氨酸(C6506, Sigma Co.， Ltd)不溶于PBS、生理盐水或其他运载工具(Murray等，2015)．因此，PCPA小鼠采用PCPA甲酯(C3635, Sigma Co.， Ltd)腹腔注射。PCPA甲酯对5-羟色胺水平的影响已有研究证实(Du Jardin等，2017；Narasingam等，2017)．PCPA组给药剂量为每日300 mg/kg，连续5天(王等人，2020)．PCPA溶于PBS中，对照组接受体积匹配的PBS注射。治疗后，进行行为测试以确定治疗个体的认知功能。

行为测试

采用开放野测试(OFT)、新物体识别测试(NORT)和y迷宫测试(Y-maze)评估认知障碍。行为数据通过智能视频跟踪系统自动分析。

露天试验

如上文所述(Li等，2022b；Yang等，2022)，小鼠饲养在一个灰色聚乙烯盒子的中心，一个开放的野外室(长×宽×高:40 cm × 40 cm × 40 cm)。在300勒克斯的昏暗灯光下自由运动5分钟，分析运动总距离、运动时间和速度。

新型物体识别测试

NORT测试的实现如前所述(Antunes和Biala, 2012；李等人，2021年)．在环境适应阶段(允许小鼠自由探索开阔地带5分钟)结束后，将两个相同的物体放置在开阔地带的两个角落，距离边界各6厘米。第一阶段，让动物进行5分钟的自由探索，记录每个物体周围的总探索时间。在第二阶段，进行了一个类似的实验，不同的是，两个物体中的一个被一个新物体取代，它的大小相同，但外观不同。探索时间记录在小说(NT)和熟悉的物体(FT)周围。识别指数 $＝ \frac{（ NT - 英国《金融时报》）}{（ NT + 英国《金融时报》）}$ ．每次实验结束后，用75%乙醇擦拭仪器以去除异味。

Y-maze

如上文所述(Yang等，2022)， y形迷宫装置由灰色聚乙烯制成，有三臂，每臂成120°角(长×宽×高:30 cm × 8 cm × 15 cm)。这三个手臂是随机分配的:最初的手臂被放置并开始探索(始终打开)，新的手臂(在第一次试验中被阻塞，但在第二次试验中打开)和另一个手臂(始终打开)。在第一阶段，小鼠被关在起始臂(新臂被堵住)，让它们探索10分钟，最终返回笼子。2小时后，进入第二阶段，将小鼠置于同一个起始臂(新臂打开)中，并允许小鼠在迷宫中探索5分钟。我们记录在每个臂中所花费的时间、进入新臂的小鼠数量、小鼠的总数和移动距离，以供分析。

组织样本采集

粪便样本

粪便样本的获取方法参照上文(张等人，2022)．老鼠被关在一个干净的笼子里，笼子底部有无菌纸。在消毒的离心管中排便后立即收集粪便样本。每只老鼠都更换滤纸。然后，将粪便样本储存在- 80°C的冰箱中。然后，粪便样本在OEBiotech有限公司(中国上海)进行16S rRNA基因测序。DNA提取使用DNA提取试剂盒(天根生物技术有限公司，北京)。用通用引物343 F和798 r扩增16S rRNA基因V3-V4(或V4-V5)可变区，纯化产物进行测序。对干净的reads进行引物序列去除和聚类，通过Vsearch软件生成97%相似度的操作分类单元(OTUs)。所有有代表性的读取都通过RDP分类器使用Silva数据库版本123(或Greengens)进行注释和解析(置信阈值为70%)。 All representative reads were annotated and blasted against the Unite database (ITSs rDNA).

血清和海马样本

小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.01 ml/g)麻醉，取眼球取血样。离心后，血清保存在−80°C冰箱中进行生化分析。海马体被仔细地从大脑中分离出来，保存在- 80°C。生化和组织学分析在武汉赛瑞生物科技有限公司完成。

酶联免疫吸附测定

小鼠血清中5-羟色胺(5-HT)含量测定采用相应的ELISA试剂盒(Bio-Swamp Co.， Ltd.)。整个过程是按照制造商的协议进行的。

短链脂肪酸的测定

简单地说，30 mg精确称量的样品在粉碎和均质后用甲醇和l -2-氯苯丙氨酸处理。使用ACQUITY UPLC I-Class系统(Waters Corporation, Milford, CT, USA)和VION IMS QTOF质谱计(Waters Corporation, Milford, CT, USA)测定ESI正离子和ESI负离子模式下的代谢谱。使用Progenesis QI V2.3(非线性，动力学，英国纽卡斯尔)软件对原始LC-MS数据进行处理，以过滤基线、识别峰值、积分、保留时间校正、峰值对齐和归一化。然后用R进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，分析两组间的相关性。

戊巴比妥诱发睡眠试验

根据以往的研究(王等人，2020；Kim等人，2021年)，戊巴比妥钠i.p (25 mg/kg)在末次给药30 min后给药。获得的睡眠状态定义为右侧反射丧失超过1分钟。睡眠开始百分比计算如下:入睡/总数)× 100%

统计分析

所有定量数据用均数±SEM表示，误差条表示SEM。使用SPSS软件25.0版本(SPSS Inc.， Armonk, New York, NY, USA)和GraphPad Prism软件(GraphPad Prism software, Inc.)进行统计分析。行为试验通过单因素或双向方差分析(ANOVA)进行分析，然后事后Bonferroni的测试。P< 0.05为有统计学意义。

结果

对氯苯丙氨酸治疗显著减少小鼠血清5-羟色胺

我们首先比较对照组和PCPA组动物的5-HT水平，以检测PCPA [300 mg/kg，腹腔注射(i.p)]对血液5-HT的消耗作用。比较显示了显著的差异(图1一个)，与先前的研究结果一致(Farabollini等人，1988；Zhou等，2022b)．

图1

图1所示。对氯苯丙氨酸(PCPA)治疗可引起小鼠认知功能障碍和抑郁样行为。(一)浓度。(B)露天试验(OFT)的总旅行距离。(C)花时间在OFT的中心区域。(D)在y迷宫测试的新奇部分花的时间。(E)新物体识别试验(NORT)的识别指标。数据以平均值±SEM表示。＊P< 0.05;＊＊＊＊P< 0.0001;Ns，不显著。

对氯苯丙氨酸处理的小鼠表现出认知行为缺陷

我们在两组之间进行了行为测试，以更好地了解PCPA引起的认知变化。与对照组相比，PCPA组在中心区域停留的时间明显减少(图1 b)．然而，两组之间并无差异(图1 c)．根据y迷宫测试，PCPA组在新手臂上花费的时间比对照组要少(图1 d)．同时，PCPA组的认知指数(RI)明显降低(图1 e)．

对氯苯丙氨酸处理可引起小鼠肠道菌群失调

我们收集两组的新鲜粪便，对粪便菌群进行16S rRNA基因测序，以了解肠道菌群的群落结构和多样性。如图2PD全树指数显示对照组小鼠肠道微生物多样性高于PCPA小鼠(图2一个)．但两组间Chao1指数无差异(图2 b)．对于Beta多样性，主成分分析(PCA)描述了两组肠道菌群内的显著成分差异(图2 c)．

图2

图2。对氯苯丙氨酸(PCPA)治疗诱导小鼠肠道菌群变化。(一)α-多样性Chao1指数。(B)α-多样性PD全树指数。(C)主成分分析(PCA)箱线图。(D, E)线性判别分析效应量分析。(F)种g_Parabacteroides的相对丰度。(G)种类g_Lactobacillus的相对丰度。(H)菌种g_escherichia -志贺氏菌的相对丰度。(我)肠杆菌科的相对丰度。(J)消化性链球菌科的相对丰度。(K)肠球菌科的相对丰度。(L-N)KEGG分析。数据以平均值±SEM表示。＊P< 0.05;＊P< 0.01;^＊＊＊＊P< 0.0001;Ns，不显著。

此外，通过差异丰度分析对与pcpa相关的细菌类群进行了评价。基于线性判别分析效应量(LEfSe)分析，识别出19个判别特征(图2 d, E)．接下来，对PCPA组和对照组粪便菌群相对丰度的变化进行统计分析。结果表明，两组粪便样品中55种细菌在所有门水平上存在差异:纲、目、科、属和种(图2外:我，补充图1- - - - - -3.)。的相对丰度克雷伯氏菌，Escherichia-Shigella，Family_XIII_AD3011_group，超声心动图- 009，脱磷孤菌属，肠球菌,[真细菌]_coprostanoligenes_group与对照组相比，PCPA小鼠的水平显著升高。相比之下，的相对丰度Rikenella, Lachnospiraceae_UCG-006, Rikenellaceae_RC9_gut_group，白杆菌，Paenochrobactrum,Peptococcus与对照组相比，PCPA小鼠体内的补充图2)．

此外，利用KEGG通路数据库确定功能组成的变化。在Level 1中，我们观察到PCPA组较高的丰度差异与代谢、人类疾病等相关，(图2 j)．在水平2时，对照组中与循环系统、信号分子和相互作用、细胞群落真核生物和物质依赖相关的序列比例升高(补充图3)．在水平3时，PCPA组中4种KEGG通路显著富集，包括苯丙类生物合成、莨菪烷、哌啶、吡啶生物碱生物合成、内吞作用和异喹啉生物碱生物合成(图2 k，补充图4)．

对氯苯丙氨酸治疗降低了血液和海马中的乙酸

由于许多研究人员关注短链脂肪酸与非传染性疾病之间的关系(Van De Wouw等人，2018；Dalile等人，2019年；考尔等人，2020年)，我们试图通过考虑SCFAs的中介作用来打开这个黑箱。我们进行LC-MS分析来量化短链脂肪酸的水平。与对照组相比，PCPA组大鼠血液和海马内乙酸浓度显著降低(图3 a, B)．而血清中异戊酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸的含量与海马间差异不显著(p < 0.05)。图3个氯)．为了清楚地展示我们的结果，我们进行了OPLS-DA分析(图3 m, N)．

图3

图3。血液和海马中的短链脂肪酸(SCFAs)水平。(1)两组大鼠海马及血液中短链脂肪酸水平的比较。(M, N)OPLS-DA阴谋。数据以平均值±SEM表示。＊P< 0.05;**P< 0.01;Ns，不显著。

短链脂肪酸水平与生物失调和神经认知障碍的相关性

此外，我们进行了Spearman的等级相关分析，以测试行为测试和SCFAs丰度之间的相关性，以促进我们对非传染性疾病和肠道菌群(图4 b, C)．结果表明，PCPA组海马区乙酸水平与开阔场试验的识别指数相关。此外，我们对微生物群定植的属水平细菌群落进行了冗余分析(RDA)。如图4一， RDA结果显示，在第一和第二RDA坐标轴上，分别有21.97%和33.95%的方差被解释。

图4

图4。短链脂肪酸(SCFAs)水平与生物失调和认知障碍的相关性。(一)短链脂肪酸与肠道菌群的相关性。(B)SCFAs与对氯苯丙氨酸(PCPA)组行为试验修正的热图。(C)SCFAs与对照组行为测试的修正热图。

讨论

基于5-羟色胺耗竭的作用，PCPA注射液在过去几十年里长期诱导动物失眠模型(Prospero-García等，1993；Shi等人，2019；杜等人，2020年)．然而，血清素水平的下降也会导致认知能力下降。先前的研究表明，血清素能神经元在认知中起着主要作用(孙等人，2021年；Shine等人，2022年)．5-HT神经元系统的交替对非传染性疾病有显著影响。尽管与非传染性疾病有关的机制尚不清楚，但在各种疾病中已经观察到大脑中多个5-HT通路的功能障碍(厄普顿等，2008年)．在小鼠中给药PCPA会导致血清素消耗，这与行为缺陷有关。此外，最近关于肠道菌群与认知(包括与年龄相关的非传染性疾病)之间关系的研究，可以通过肠道菌群移植逆转。同样，在其他疾病中也观察到这种关系(Boehme等人，2021年；Qian等人，2022年；Thu Thuy Nguyen和Endres, 2022年)．

本文旨在阐明PCPA治疗与非传染性疾病之间的时间关系。因此，PCPA能显著降低小鼠血清5-HT水平。因此，PCPA组在y迷宫新臂的行走时间明显缩短，在NORT的识别指数降低，提示发生了非传染性疾病，这与PCPA诱导小鼠非传染性疾病的研究结果一致(Ngoupaye等人，2020年；Li等，2022a)．有趣的是，在经过pcpa处理的小鼠中，在OFT中心区域停留的时间减少显示了类似抑郁的行为。同时，PCPA组和对照组的肠道菌群组成存在差异，提示PCPA诱导的非传染性疾病也与菌群失调有关。产生醋酸的细菌的相对丰度显著降低，如乳酸菌而且ParabacteroidesPCPA组无明显差异。

此外，在PCPA治疗后，我们观察到，与对照组小鼠相比，血液和海马中的乙酸水平明显降低。越来越多的证据表明，醋酸盐消耗在各种非传染性疾病中起着至关重要的作用。例如,郑等人(2021)观察到醋酸酯作为肠道菌群代谢物膳食纤维的主要产物，可通过调节海马突触素(SYP)来保护非传染性疾病。因此，Spearman的等级相关分析确定了行为测试结果与SCFAs之间的相关性。PCPA组的NORT识别指数与乙酸的相关性显著。OFT显示的抑郁样行为也与醋酸盐水平下降相关(尽管不显著)。此外，根据RDA，乙酸和戊酸的水平与肠道菌群有关。因此，我们推测PCPA治疗引起的小鼠认知功能障碍和抑郁样行为可能与生物失调和SCFAs有关。

线性判别分析效应量分析显示两组间有19个显著差异的特征(PCPA, 11;8)。这一推理使我们获得了与pcpa相关的非传染性疾病与生物失调呈正相关的专业知识。曲等人(2022)观察到含有脂多糖的类群，如变形菌门，Gammaproteobacteria，肠杆菌科,Escherichia-Shigella，与非传染性疾病呈正相关。脂多糖(LPS)是g菌产生的一种内毒素，此前已被证实与肠道炎症细胞因子(高等人，2022；Nguyen等人，2022年)．相反，他们还确定产生scfa的细菌普氏菌在非传染性疾病患者中显著下降。令人惊讶的是，上述含有lps的细菌在PCPA组的11个特征中排名前3普氏菌对照组也进行观察。

的报告支持了这些发现Ngoupaye等人(2020年)而且里加等人(2020年)pcpa治疗的小鼠表现出类似抑郁的行为。在上述研究中，作者报道了抗抑郁药可以降低PCPA对非传染性疾病的影响。然而，这种可逆的效应是不完全的。上文提到的抗抑郁药Vortioxetine作为5-HT受体激动剂，对行为缺陷有部分影响。然而，急性给药(0.1 mg/kg)并不能改善小鼠的自发变化。虽然高剂量的涡替西汀(3.0 mg/kg)提高了性能，但自发交替反应的总次数并没有改善。我们的发现可以从另一个角度来解释。正如假设的那样，结果描述了对pcpa诱导抑郁的概念理解也与肠道菌群和醋酸盐有关。因此，尽管我们没有找到支持这种关系的有力证据，但要得出生物失调不会在这一过程中发挥巨大作用的结论还为时过早。

除了类似抑郁的行为，PCPA还会促进非传染性疾病，包括学习和短期记忆损伤。Hritcu L.等人(2007)而且特谢拉等人(2018)发现PCPA治疗显著降低y迷宫的自发交替百分比，与我们的研究结果一致。虽然5-HT受体激动剂对pcpa处理的小鼠的影响尚不清楚，但大脑中SCFA产生细菌和SCFA水平的减少反过来可能导致非传染性疾病(Liu等，2022b)．因此，我们有理由相信微生物群依赖于pcpa引发的非传染性疾病。然而，先前的研究表明，生物失调和SCFA水平也可能与PCPA引起的失眠有关(王等人，2020；Si等人，2022a)．在我们的研究中，pcpa治疗的小鼠没有失眠。在本研究中，我们选择PCPA甲酯作为5-羟色胺的消耗剂。与PCPA的不溶性相比，PCPA甲酯在PBS和生理盐水中都非常溶解(Murray等，2015；Du Jardin等，2017)，直接影响药物的吸收率。PCPA甲酯溶液比PCPA悬浮液更容易被啮齿动物吸收，导致PCPA甲酯的快速消除。在以往的研究中(Murray等，2015)，以800 mg/kg下的PCPA甲酯诱导失眠动物模型，无证据表明300 mg/kg下的PCPA甲酯也能引起失眠。因此，由于PCPA甲酯的快速吸收和消除，我们认为小鼠在低剂量的PCPA甲酯作用下不会出现失眠。由此推断，本研究中生物失调和SCFA水平可能与PCPA致失眠无关(补充图5)．

我们的研究有其优势，包括对ppca处理小鼠的表现变化的独特视角。这是第一次证明SCFAs和主要醋酸酯对这种疾病的影响。然而，我们的研究也有一定的局限性，可以改进。首先，需要进一步研究将直接醋酸酯应用于PCPA处理的小鼠是否可以改善PCPA诱导的非传染性疾病。第二，海马体中醋酸盐水平的变化与肠通透性有关，或仅与肠屏障的增加有关。因此，需要进一步的实证研究。

结论

在本文中，我们进行了多项研究，以确定与小鼠生物失调相关的pcpa诱导的非传染性疾病的潜在机制。我们的研究结果表明，PCPA治疗生物失调的促进作用可能导致海马区乙酸盐浓度降低，与非传染性疾病相关。虽然由于PCPA的不良作用尚未应用于临床实践，但本研究的发现为PCPA和基于PCPA的动物模型的认知障碍提供了新的视角。

数据可用性声明

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。有关储存库的名称及登记编号载列如下:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, SUB11975467。

道德声明

动物实验由同济医学院同济医院动物护理与使用专业委员会(同济医学院同济医院动物护理与使用专业委员会(同济医学院同济医院动物护理与使用专业委员会)审核通过。TJ0803)。

作者的贡献

所有列出的作者都对这本书做出了实质性的、直接的和智力上的贡献，并批准它出版。

资金

本研究得到国家自然科学基金项目(no . 81873467和81670240)的资助。

利益冲突

作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或金融关系的情况下进行的。

出版商的注意

本文中表达的所有主张仅代表作者的观点，并不代表其附属组织的观点，也不代表出版商、编辑和审稿人的观点。任何可能在本文中进行评估的产品，或可能由其制造商做出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充材料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2022.1028913/full#supplementary-material

参考文献

美国精神病学杂志(2013)。精神障碍诊断和统计手册:Dsm-5™(第5版)。尾声25:191。doi: 10.1176 / appi.books.9780890425596

CrossRef全文|谷歌学者

Antunes, M.和Biala, G.(2012)。新型物体识别记忆:神经生物学、测试过程及其修正。Cogn。的过程。13日,93 - 110。doi: 10.1007 / s10339 - 011 - 0430 - z