扩大生物质生产的规模产甲烷球菌属maripaludis

介绍

不断扩大的人类文明的全球影响可以通过按比例加速技术进步的转变来解决。利用天然和重组微生物的生物技术进步，如产甲烷古生菌(产甲烷菌)，可以为分散的可持续能源制造提供各种解决方案，例如生物甲烷化过程，该过程利用具有工业相关生长特征和高容量甲烷的产甲烷菌(CH₄)生物合成(Seifert等人，2014；Azim等人，2017；莫尔霍费尔等人，2018；里特曼等人，2018年)。生物CH₄二氧化碳(CO₂)(有限公司₂-BMP)可用于建立CH₄CO₂-中性生物燃料(Porqueras等人，2012年)的后化石燃料时代，如CH₄可纳入现有的天然气储存和运输基础设施(莫尔霍费尔等人，2018)。事实上，产甲烷菌已被用于大规模厌氧消化生产沼气(Guebitz等人，2015)，以及将可再生能源转换和储存为CH₄（Götz等，2016)。

产甲烷菌是古生菌领域(Cavicchioli 2011；Borrel等人，2013)。甲烷生成可能是数十亿年前在热液喷口的原始条件下出现的，是最古老的代谢过程之一(Ueno等人，2006；马丁等人，2008年)。今天，在地球上几乎每一个缺氧环境中都发现了产甲烷菌，它们通过产生CH来负责生物质矿化的最后阶段₄在厌氧条件下(刘和惠特曼，2008；Thauer et al.， 2008；jabolozynski等人，2015)。通过生物合成大约1亿吨的强效温室气体CH₄每年(豪沃思等人，2011年；联合国政府间气候变化专门委员会,2013)，由于产甲烷菌在全球碳循环中的重要作用和生态意义，它们已成为重要的研究课题。

产甲烷球菌属maripaludis是一种在37°C的矿物介质中生长的自养、氢化、产甲烷的嗜甲烷生物(琼斯等人，1983年；Keswani等人，1996年)。米。maripaludis只需要CO₂作为碳源(泽尔纳和温特，1987年)，但它还可以利用醋酸盐进行生物质合成(谢赫和惠特曼，1987年；阿齐姆等人，2018)。在能量生产方面，分子氢(H₂)或甲酸盐用作电子源(谢赫和惠特曼，1988年；科斯塔等人，2013；罗瑟和惠特曼，2019年)。薄s层的描述米。maripaludis（贾雷尔和科瓦尔，1989年；贾雷尔等人，2010年)，这意味着米。maripaludis当它暴露在低渗透压缓冲液中时，可能是一种相当脆弱的生物(琼斯等人，1985年)或使用洗涤剂(琼斯等人，1983年)。然而，细胞结构米。maripaludis允许通过经典分子生物学技术直接操作。

今天,米。maripaludis是专性氢化产甲烷生物中研究最多的模式生物之一(戈亚尔等人，2016年；理查兹等人，2016)。它可以被转换(Tumbula等人，1994年)与不同的穿梭向量(Argyle等人，1996年；萨米恩托等人，2011年；沃尔特斯等人，2011年)，其基因组可由整合质粒编辑(Stathopoulos等人，2001年；利和利，2007年)或通过无标记诱变程序(摩尔和利，2005年)。此外，两种不同的crispr介导的基因组编辑系统已成功建立米。maripaludis（Bao等，2022；Li等，2022)。广泛的分子工具箱已用于产甲烷生物生理的各种研究，如甲基辅酶M还原酶(Lyu等，2018)。此外,米。maripaludisS0001已被代谢改造为生产高价值产品的细胞工厂，如香叶醇(Lyu等，2016)和生物塑料聚合物聚羟基丁酸酯(Thevasundaram等人，2022)。尽管如此，在方法上仍有很大的进步空间米。maripaludis进一步确立为对全球生物技术部门具有可识别影响的模式生物。

一个可复制的管道，以扩大种植米。maripaludis一直是一个缺失的环节，限制了这个有前途的物种的实验室规模的研究课题。尽管各种技术已经被用于栽培米。maripaludis以封闭批处理模式(鲍尔奇等人，1979年；萨米恩托等人，2011年；戈亚尔等人，2015年)，它们都将培养体积限制在毫升范围内，并由于不连续的底物补充而改变生理足迹。然而，已经开发了一种灵活且经济高效的基于甲酸盐的1.5 L封闭批量系统，该系统利用产甲烷菌用于甲酸盐，可以产生足够的生物质用于分析研究，并消除了H₂/公司₂-提供的方法(朗等，2017)。

相比之下，饲料批量培养模式允许连续添加饲料以促进生长，培养体积更大，对条件的控制更复杂。然而，只有少数著名的研究应用了类似于化学抑制剂的系统(Haydock等人，2004年；亨德里克森等人，2007年，2008；科斯塔等人，2013；Müller等，2021)或扩大纯培养(Walters和Chong, 2017)进行生物量生成米。maripaludis。所有这些都集中在其他基本问题上，并没有制定一个详细的管道来持续转移和扩大米。maripaludis文化。尽管几十年前已经开发了10升的更大的种植量(谢赫和惠特曼，1988年)，没有后续研究对其栽培的最佳性能条件进行优化米。maripaludis在工业相关的规模。

由现有厌氧培养产甲烷菌的技术发展而来(Azim等人，2017，2018；Taubner和Rittmann, 2016)这项研究开始完成研究中缺失的章节米。maripaludis通过设计各种栽培方法快速生产生物质的实验方法。

材料与方法

微生物和培养基

产甲烷球菌属maripaludis所有实验均使用S0001。该生物由美国佐治亚大学的威廉·巴尼·惠特曼提供。在所有实验和培养模式中，使用的是含有以下成分的还原液体141培养基(DSMZ 141a)⁻¹): 0.14 g氯化钙₂h·2₂O, KCl 0.34 g, MgCl 4 g₂h·6₂O, 0.25 g NH₄Cl, 18.09 NaCl, 0.14 g K₂HPO₄， 3.45 g MgSO₄h·7₂O, 10 mL改性沃林矿液(100×)， 2 mL (0.1% w/v) Fe(NH)₄）₂(所以₄）₂h·6₂O (0.1% w/v)。将1.5 g硝酸三乙酸溶解于ddH中制备100×改性沃林矿液₂用KOH调节pH至6.5。然后加入以下试剂(L⁻¹): 3克MgSO₄h·7₂O, 0.585 g MnCl₂h·4₂O, 1 g NaCl, 0.18 g CoSO₄h·7₂O, 0.1 g FeSO₄h·7₂O, 0.1 g氯化钙₂h·2₂O, 0.18 g ZnSO₄h·7₂O, 0.02克KAI(SO₄）₂h·12₂O, 0.006 g CuSO₄， 0.01 g H_3.薄_3.， 0.01 g Na₂MoO₄h·2₂O, 0.0003 g Na₂搜索引擎优化_3.h·5₂O, 0.03 g NiCl₂h·6₂O, 0.0004 g NaWO₄h·2₂O.最后，用KOH将pH调整为7.0。铁(NH₄）₂(所以₄）₂h·6₂O溶液的组成如下(L⁻¹): 0.00709 g FeSO₄h·7₂O和0.00337 g (NH₄）₂所以₄。培养基经厌氧灭菌后，加入20 mL L⁻¹0.61 mol L⁻¹)及4毫升⁻¹Na的₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)接种前。以下气体从液化空气公司(液化空气有限公司，Schwechat，奥地利)购买并用于栽培₂/公司₂(4:1混合)，H₂(≥99.999 Vol.-%)和CO₂(≥99.995 Vol. - %)。由于这些气体的可燃性，本研究中的所有实验都在指定的厌氧设施中进行，配备了传感器和气体报警系统，禁止使用明火。

封闭的批处理

0.05 L血清瓶培养

血清瓶(SB)的总容量和培养容量分别为120 mL和50 mL，以下称为0.05 L SB培养物。它们被装入141种培养基(48毫升)，并用丁基橡胶塞子(20毫米;cls - 3409 - 14;Chemglass Life Sciences, Vineland, NJ，美国)和铝卷曲帽(20毫米;Ochs Laborbedarf, Bovenden，德国)。采用抽真空(4×) + H加压(5× 1.0 bar)的方法使瓶进行厌氧₂/公司₂气体混合物(4:1)。高压釜消毒SB，每个重复加1 mL乙酸钠(0.61 mol L)⁻¹)和0.2 mL Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)到接种前的最终容积为49.2 mL。接种用0.8 mL预培养液(1.6% (v/v))在厌氧手套箱(Coy Laboratory Products, Grass Lake, usa)中进行。

0.4 L Schott瓶培养

Schott瓶(SCB, DURAN®压力加GL-45;DWK生命科学，美因茨，德国)的总容量和工作容量分别为1,000 mL和416.67 mL，以下称为0.4 L SCB培养物。它们被141个介质(400毫升)填充，并用丁基橡胶塞子(40毫米;444704, Glasgerätebau Ochs, Bovenden，德国)和PBT螺旋帽(54毫米;DWK生命科学，美因茨，德国)。厌氧消毒后，每个重复添加8.33 mL乙酸钠(0.61 mol L⁻¹)和1.67 mL Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)到接种前的最终体积为410毫升。接种用6.67 mL预培养物[1.6% (v/v)]在厌氧手套箱(Coy Laboratory Products, Grass Lake, usa)中进行。

培养与分析

用于接种，取样和气的厌氧培养米。maripaludis使用以下无菌设备:1 mL, 5 mL和10 mL气密注射器(Injekt®-F, Omnifix®-F, Omnifix®;B. Braun, Melsungen，德国);皮下针(Gr 14, 0.60 × 30 mm, 23 G × 1 1/4”;B. Braun, Melsungen，德国)和孔径0.20 μm的醋酸纤维素过滤器(LLG Labware, Meckenheim，德国)。气体歧管(Taubner和Rittmann, 2016)用于饲养培养。使用数字压力计(LEO1-Ei，−1…3 bar rel, Keller，德国)进行压力测量。用磁性搅拌棒在37°C以不同转速/分钟(rpm)摇动或搅拌血清瓶。培养生长评估通过使用分光光度计Specord 200 Plus (Analytic Jena, Jena, Germany)在578 nm (OD)处进行光密度测量进行₅₇₈)。

实验组:摇动和搅拌

对SB和SCB两种不同的搅拌方法进行了比较——摇和搅拌。震荡封闭批培养由两个设备搅拌到180转/分:一个空气培养箱(ZWYR-2102C;Labwit Scientific, Ashwood, Australia)或轨道激振器(编号3019;Gesellschaft für Labortechnik GmbH, Burgwedel, Germany)，被放置在37°C的气候室(TER, CMESS，维也纳大学)。分别用25 × 6 mm或40 × 8 mm磁搅拌棒将SB和SCB搅拌至1400 rpm (BRAND GMBH + CO.KG, Wertheim，德国)。在密封和灭菌含瓶的厌氧介质之前，将搅拌棒添加到141种介质中，这些介质在搅拌器加热板(2581001;IKA®-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Germany)被放置在37°C的空气培养箱或气候箱中(如上所述)。

SB和SCB都在不同的条件下(以不同转速震动或搅拌)进行了测试，重复四次，未接种的对照组处理与其余重复相同。摇晃培养物的搅拌速率为100,150和180转/分钟，而搅拌培养物的搅拌速率为100,500,800,1100,1400转/分钟。压力和外径₅₇₈在喂食前每天定期测量一次，并在37°C下进一步孵育。复制最佳实验组，作为第二个测量时间点，并引入饲料。为了在每个阶段(SB或SCB)内进行优化，使用前一个实验组固定阶段的接种物。当新的一系列实验开始时，第一个接种体是从低温储备接种的预培养中获得的。

低温库存的复苏

从血清和SCB培养中定期生成低温备份。对于SB，将800 μL培养物和600 μL 50% (v/v)厌氧甘油在141培养基中混合在厌氧手套箱中，在液分子氮中速冻，- 70℃保存。对于SCB，将6.67 mL培养物和5 mL厌氧50% (v/v)甘油在141培养基中混合并按上述方法处理。复活后，备份物在冰上慢慢解冻，以2000 g的速度旋转，丢弃上清液，将颗粒状生物质悬浮在0.8 mL或6.67 mL新鲜制备的141培养基中，并分别接种在补充的含有SB或SCB的141培养基中。第一代复活的人没有接受实验，而是被培养通过预培养时以150转/分的转速摇晃。

生物反应器

2.2 L生物反应器设置

产甲烷球菌属maripaludis使用Eppendorf商业系统DASGIP®Bioblock (76DGTBLOCK)培养，配备4× 2.2 L Bioblock搅拌器反应器(Eppendorf AG，汉堡，德国)，工作容积为1.5 L(反应器培养)。温度始终保持在37°C。冷却水供应给废气冷凝器。pH值和氧化还原电位传感器(59903232和105053336，梅特勒托莱多，哥伦布，OH，美国)连接到DASGIP®模块并进行监测通过公司软件。乙酸钠溶液(0.61 mol L⁻¹)和Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)在SCB中制备，通过将它们连接到充满H₂/公司₂(4:1)。溶液被DASGIP®MP4和MP8泵通过聚四氟乙烯管(0.8 mm)补充到反应器容器中。气体流速通常保持在每分钟0.3体积气体/体积液体(vvm)，但也测试了个别实验的替代vvm(0.15至0.6 vvm)。有限公司₂是补充通过DASGIP®MX4/4混合模块(76DGMX44, Eppendorf AG，汉堡，德国)和H₂外部管理通过质量流量控制器SmartTrak®(C100L;Sierra Instruments，蒙特利，CA，美国)。两个不同的气体电路被一个三通接头合并成一个管道，该管道指导H的气体混合₂/公司₂(4:1)通过Millex®-FG过滤器(SLFG05010;MilliporeSigma, Burlington, MA，美国)进入生物反应器容器的流入喷雾器。培养样品使用内置370mm不锈钢管(外径4mm，内径2mm)。硅管(M0740-2445;Eppendorf AG，汉堡，德国)用于完成和连接各种反应堆气体电路，管道和端口。废气管道通过500ml SCB(用于收集冷凝液)，并进一步流向集中废气吸收系统的专用开口。

1.5 L反应器培养:培养和分析

首先，使用不同的缓冲液校准pH和氧化还原探针(pH 7.0/4.1;10000642/10545151;Fisher Scientific, Hampton, NH，美国)和ORP解决方案(240 mV;HI7021L;Hanna Instruments, Woonsocket, RI，美国)。然后将探针插入充满1.434 L 141培养基的搅拌反应器中，不添加醋酸盐，通过高压灭菌对整个反应器装置进行灭菌。然后，这些血管被放置在Bioblock中，所有电路都通过公司软件连接和管理。温度设置为37°C，以600转/分钟的速度搅拌，以0.3 vvm的速度使介质厌氧，流速为20标准升/小时(sL h⁻¹) H₂和5 sL h⁻¹有限公司₂。培养基中加入30 mL乙酸钠(0.61 mol L)⁻¹）通过通过硅橡胶隔片注入6毫升钠₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹）通过MP4泵。最后，作为接种前的最后准备步骤，用NaOH (10 mol L)将pH调至7.00(±0.05)⁻¹）通过通过鼻中隔注射，之后没有自动滴定。外径样品₅₇₈在接种前、接种后和培养生长期间定期收获。接种后，添加0.61 mol L的乙酸钠⁻¹)和Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)以0.5 mL h的速率补充⁻¹0.1 mL h⁻¹，并在稳定增长后手动增加。通过将一根针连接到取样管的硅管上，并用负压在空厌氧SCB的丁基橡胶上进行生物质收集。由于负压，反应器容器中的生物质被引导通过取样硅管和针进入SCB瓶。收集的生物量然后在厌氧手套箱中处理，用于各种目的:计算，接种剂制备，储存的颗粒。

从封闭批次到补料批次培养的接种体制备是本研究的一个中心主题，并对各种程序进行了测试，稍后进行讨论。这里只描述已建立的可重复的方法。来自SCB或1.5 L反应器培养物的指数相和固定相生物质(400 mL)通过在2500到4000克之间的离心浓缩，主要是在室温(RT)下以3000克离心15分钟，使用750 mL瓶和贺利氏4KR混合器(75004461，赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)的LH 4000摆动转子(75006475)。然后，从400 mL发酵剂中提取的颗粒状生物质悬浮在30 mL新鲜的141培养基中，不添加乙酸盐，收集到如上所述的50 mL注射器中，最后注入反应器。

1.5 L反应器培养搅拌坡道和实验组

生物反应器培养米。maripaludis研究人员经历了四种不同的搅拌斜坡剖面:“保守”和“渐进”的逐步和持续增加rpm的变化。连续方法定义为从接种时间点开始不断增加转速，其加速速率不同:72小时后保守变化和渐进变化分别达到600/ 1200 rpm和108小时后1200 / 1600 rpm。相比之下，当搅拌保持在恒定速率时，阶梯式斜坡剖面额外引入了短暂的稳态。接种18 h后，保守变异保持在100 rpm, 69 h后达到1200 rpm;接种6 h后，渐进变异设置为100,74 h后达到最终稳定状态1500 rpm。上述坡道的其他变化已经进行了测试，但由于缺乏对培养生长的积极影响，这里没有报道。

为了组织本研究中的实验，为每个生物反应器副本分配了一个三位数ID (x.y.z)。数字x定义了阶段，描述了生物反应器实验，从“适应”轮开始(从SCB第一次接种到1.5 L反应器培养物中)，再从停滞的反应器培养物进一步转移到新的反应器培养物中，直到最终的生物质收获。第二个数字y描述了从本研究中生物反应器实验开始的连续生物反应器运行，第三个数字描述了Eppendorf生物块上的反应器复制编号。

22 L生物反应器设置

产甲烷球菌属maripaludis在定制的22 L Biostat®C15-3反应器系统(bbi-biotech GmbH, Sautorius集团，德国柏林)中培养，工作容量为15 L(反应器培养)。Rushton涡轮机安装在距离中央搅拌轴底部25、50和80厘米处。温度始终保持在37°C通过温度计和冷却水被供应到废气冷凝器。一个pH传感器(104054479，梅特勒托莱多，哥伦布，OH，美国)连接到控制单元，一个氧化还原电位传感器(59904198，梅特勒托莱多，哥伦布，OH，美国)由一个多参数变送器(M300，梅特勒托莱多，哥伦布，OH，美国)外部操作。乙酸钠溶液(0.61 mol L⁻¹)和Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)在SCB中制备，通过将它们连接到充满H₂/公司₂(4:1)。溶液通过外部泵(0106141DA0, Watson Marlow pumps, Falmouth, Cornwall, uk)的聚四氟乙烯管(0.8 mm)补充到反应器容器中。气体流速维持在0.3 vvm，因为两者的CO₂和H₂外部管理通过质量流量控制器SmartTrak®。两个不同的气体电路被一个三通接头合并成一个管道，该管道指导H的气体混合₂/公司₂(4:1)通过过滤器进入生物反应器容器的流入喷雾器。对于培养物的采样，使用连接到SV-25采样阀的硅胶管。

15l反应器培养:培养和分析

首先，校准pH值和氧化还原探针，如上所述。将探针插入其端口，容器中装满14.490 L未补充的141培养基，并进行灭菌循环。此外，蒸汽发生器Veit 2365/2 (Veit GmbH, Landsberg am Lech, Germany)用于取样和收集阀以及双机械密封的灭菌。温度设置为37℃，以600转/分钟的速度搅拌，培养基在0.3 vvm下进行厌氧处理，流速为20 sL h⁻¹H₂和5 sL h⁻¹有限公司₂直到pH值和氧化还原值保持稳定(约15-20分钟)。培养基中加入300 mL醋酸钠(0.61 mol L)⁻¹)，再加入60毫升钠₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹）通过通过硅橡胶隔片注射。最后，作为接种前的最后准备步骤，用NaOH (10 mol L)将pH调至7.00(±0.05)⁻¹）通过通过鼻中隔注射，之后没有自动滴定。来自1.5 L反应器培养物固定相的生物质(3×400 mL)在室温(RT)下以3000 g离心15分钟，使用750 mL瓶和贺利氏4KR多混合器(75004461，赛默飞世尔科学公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)的LH 4000摆动转子(75006475)。然后将颗粒状生物质悬浮在30 mL新鲜的未补充的141培养基中，收集到如上所述的50 mL注射器(3×50 mL)中，最后注入反应器。外径样品₅₇₈在接种前、接种后和培养生长期间定期收获。接种后，添加0.61 mol L的乙酸钠⁻¹)和Na₂S·9 h₂O (0.5 mol L⁻¹)以5 mL h的速率补充⁻¹1.2 mL h⁻¹，并在稳定增长后手动增加。进行了生物质收获通过收集和排水阀。

最好的管道

最好的管道结合了最成功的试验组从每种栽培模式，以持续扩大米。maripaludis移栽栽培:通过移栽积极生长的培养物进行的栽培不同于每一种培养模式的优化，接种体都是从停滞培养中产生的，因为完整的管道接种体是从处于指数阶段的培养中制备的。唯一的例外是从1.5 L反应器培养物转移到15 L反应器培养物，其中接种物也处于固定阶段。

计算

公式1采用线性模型(Taubner等人，2018；Mauerhofer等人，2021)计算比生长率(μ_l)米。maripaludis由于仅在1.5 L反应器培养中记录了指数增长，其中将指数公式(μ)应用于馈电批量实验(公式2)。随后，线性和指数生成时间(GT_l/GT)由线性μ_l和指数μ，分别根据公式3和公式4。此外，底物(H₂/公司₂)消费量被确定通过SB和SCB的压力测量(Taubner和Rittmann, 2016)。

结果

在这项研究中米。maripaludis在0.05 L血清和0.4 L SCB培养物中培养4000 h，在1.5 L反应器培养物中培养3000 h，并首次在不锈钢反应器系统中培养15 L。在这里，广泛的比较(线性和指数)μ， GT和基板消耗的各种搅拌和进料技术在封闭批处理模式中被提出。此外，还详细讨论了加料间歇反应器系统中可重复转移和优化的生物质生成，并将其应用于放大管道。

0.05 L SB培养

通过摇动或用磁搅拌棒搅拌SB。100转/分(100/sha，图1)的增长率最低(图1一个)和基板消耗量(图1 b)。移栽后(100/sha.2)，在相同条件下进行栽培，可使其适应并提高GT_l(shaker.2表1)。通过搅拌(100/str)以100 rpm的速度搅拌比在相同速度下摇晃更有效。在500 rpm (500/str)搅拌时，与适应100/sha的增长相似。2种培养基的底物消耗量最高(图1 b)。以500 rpm的转速搅拌，每天两次(500/str/2×)，在最大OD最高的地方观察到SB生长最好₅₇₈1.29 (表1)比其他实验组早6天左右到达。

0.4 L SCB培养

用磁性搅拌棒搅拌或摇晃搅拌SCB。搅拌培养通常提供最慢的生长曲线，因为实验组在100 (100/str)、500 (500/str)和1100 rpm (1100 /str)的搅拌速度下，OD曲线仍处于底部₅₇₈比较(图2一个)。然而，以800 rpm (800/str)搅拌的培养物显示出强烈的生长改善，是第二好的实验组。它们也提供了最大的OD值₅₇₈在158小时的最短测量时间内(表1)。此外，还测试了最大转速为1,400 rpm的搅拌速度。四次重复培养均达到最大OD值₅₇₈96小时后，为0.169 (表1)。对于高搅拌强度下低效率生长的可能解释将在后面讨论。

100 (100/ / / / /) rpm和180 (180/ / / / / / /)rpm下的震荡培养效果优于大多数搅拌组，因为100/ / / / rpm组的OD值最高₅₇₈， 180/sha组GT最低_l约3.06小时(表1)。将100/sha培养物进行两次投喂(100/sha/2×)可显著提高生长，使达到最大培养生长的时间缩短1天，并降低GT_l超过(表1)。SCB的底物消耗(图2 b)显示非常不同的模式(图2 b)，并没有观察到搅拌培养和摇晃培养之间的明显区别。100/sha和100/sha/2×组聚集在50%以下，100/sha和500/str聚集在60%左右，180/sha和800/str聚集在90%以下。1,100/str组的样品在培养生长的前半段表现出不同程度的低底物消耗，但在指数生长后期达到可重复的高值。

1.5 L反应器培养物

第一阶段测试了接种的各种转移程序米。maripaludis从封闭间歇培养到生物反应器容器。最初不成功的尝试依赖于直接从SB中注射50 mL培养接种剂(一开始未冲洗，后来也旋转并重新悬浮在新鲜的141培养基中)，通常在低H下生长到低光密度₂/公司₂压力，由于错误的假设顶空压力是一个基本的适应因素。第一次成功的增长是由9^th尝试(图3 e)，其中搅拌是根据培养生长情况手动调整的。从这个单一反应器中获得的生物量在生长的固定阶段持续转移，并进一步进行了4个成功的实验(图3(A-D中的蓝色图)用于定义4种不同的搅拌剖面-连续和逐步增加rpm的保守变化和渐进变化。在第一阶段结束时，进行了几次不成功的恢复储存的反应堆生物量的尝试(数据未提供)。

阶段2采用4,000 g较温和的离心(表2)，从而提高了适应阶段的存活率，其中4个重复中有3个(图3 e)比第一阶段早48小时退出滞后阶段。此外，对这些重复进行预先编程的搅拌斜坡剖面(红色虚线，图3 e)。然后在固定阶段进一步转移生物量，以重现逐步斜坡剖面(图3 c，D)。在这一阶段，逐步保守的斜坡剖面被认为是最有希望的，因为阶段1和2的所有3个重复都完美对齐，并产生了高外径₅₇₈峰值超过2.5 (图3 d)。

在第3阶段，SCB接种量首次呈指数增长(表2)在适应阶段使用。四个反应堆经受了第二阶段的搅拌斜坡(图3 e)，并完美地排列在一起，几乎达到了生长曲线的真正指数几何形状，几乎与阶段2的最佳运行相匹配。这次运行实际上是下面讨论的研究中提出的最佳管道的最后阶段。此外,米。maripaludis作为固定接种物转移，以进一步重现持续的搅拌坡道(图3一，B)，在这两种情况下，它们都比阶段1的单个重复生长得更好。

阶段4-7的主要目标是优化生长米。maripaludis在保守的阶梯式斜坡下激荡。根据第三阶段适应轮的设置，适应轮在周末进行了无人监督(这里没有显示)。图3 e)。所得生物量用于单次接种(N= 1)，进行1个或2个生物重复(n≤2)，再现了逐步保守斜坡。第4阶段与第1阶段和第2阶段各自的实验组设置相同。在第5阶段，搅拌斜坡增加到最大水平1600 rpm和H₂/公司₂Mix以从0.3 vvm增加到2.4 vvm的速率供应。第6阶段具有相同的实验设置，另外从指数阶段(OD₅₇₈= 1.3)。然而，第五及第六阶段(图3 f)无法维持较好的增长米。maripaludis比第一阶段，第二阶段，第四阶段。

最后，本研究的最佳运行是在第7阶段(图3 d)时，阶段1、2和4的设置与指数生长的接种物结合繁殖，这导致了最高的OD记录₅₇₈值米。maripaludis的3.38 (表3)。在第一阶段相同的栽培条件下也达到了这个值(图3 d)，但大约48小时后。在逐步保守搅拌坡道(反应器id 2.21.3/2.21.4, 4.27.2/4.27.3/4.27.4)下，μ和GT的最高记录值为~0.16 h⁻¹和~ 4.3 h，分别测量(表3)。

扩大管道

产甲烷球菌属maripaludis接种0.05 L SB培养物，转入0.4 L SCB培养物，最后转入1.5 L反应器培养物(图4)。放大管道的每个阶段都利用了一些最好的实验组，这些实验组一直培养到指数阶段，然后进一步转移。SB培养物以500转/分钟的速度搅拌，并加入气体底物(H₂/公司₂)，每天一次，每次2个酒吧。四胞胎达到了平均外径₅₇₈90 h后增加0.6524，转入0.4 L培养。SCB以180转/分钟的转速摇晃，每天两次以1巴的速度加H₂/公司₂。69小时后(159小时时间点)达到OD₅₇₈但在78小时(168小时时间点)后转移到1.5 L培养。四重复生物反应器培养物的生长曲线代表第3阶段的适应轮(图3 e)，并且在研究的那个阶段是最成功的。OD呈指数增长₅₇₈约48小时后(216小时时间点)达到0.6,OD达到峰值₅₇₈在92小时(260小时时间点)后达到2.3。

15l反应器培养物

第一次米。maripaludis在工作容积为15l的22 L不锈钢生物反应器中培养(图5 b)。在放大实验中，首先在SCB中制备0.4 L预培养液，以800转/分钟的转速搅拌，以1 bar H每天喂料两次₂/公司₂（图5)。OD₅₇₈在49小时后达到0.6 (图5一个)。在生物质收获和浓缩后，单个1.5 L反应器培养物接种并进行适应循环设置。这种培养在OD时达到指数级增长₅₇₈约44小时(93小时时间点)后，OD达到峰值₅₇₈64 h (113 h时间点)后添加2.4，并进一步培养至固定期。在外径75小时(124小时时间点)后₅₇₈2.1,米。maripaludis收获并接种到15 L反应器培养物中。在那里，OD呈指数增长₅₇₈约25 h (149 h时间点)后达到0.6,OD时生长最大₅₇₈在61 h (185 h时间点)后达到1.7，在OD为188 h后完成完整的管道₅₇₈1.66。15 L反应器培养产物为5.57±0.39 g L⁻¹湿生物质。

讨论与结论

微生物生物技术部门内已建立的大规模工艺对医学、营养和研究至关重要，但由异养细菌和真核细胞工厂主导，这些工厂具有高碳足迹、电力需求和对宝贵资源的影响(帕特尔等，2020年)。相比之下，野生型和生物工程古菌被严重忽视，迄今为止，只有嗜盐菌被用于商业产品的生物合成(Pfeifer等人，2021)。然而，对高价值生物制品的需求以及停止对自然资源的巨大开发和破坏的迫切需要要求全球工业立即进行生物转型。收集具有遗传控制能力的自养型、氢化型和产甲烷型古菌的代谢潜能(Lyu和Whitman, 2019年)可能是一个好的开始。

产甲烷古菌与生物工艺发展的相关性

在古生菌中，产甲烷菌因其生产CH的生物技术潜力而继续受到关注₄及其他有价值的生物制品(Pfeifer等人，2021)。有文献记载的某些产甲烷菌的生理特征，如高μ (Rittmann等人，2015年；Azim等人，2017)，可承受较高的气体及静水压力(ver Eecke et al.， 2013；Taubner等人，2018；Pappenreiter等人，2019)和抗剪切力(Seifert等人，2014；Azim等人，2017)显然使它们成为具有生物技术应用的细胞工厂的有吸引力的候选者。为CH的发展₄生产生物过程从H₂/公司₂，体积或比CH₄生产力和转换效率被定义为关键参数(莫尔霍费尔等人，2018；里特曼等人，2018年)。

然而，并不是所有的产甲烷菌，都可以作为纯培养物，在生物反应器中容易生长。本研究及以往有关产甲烷菌规模扩大的研究(莫尔霍费尔等人，2018)的研究表明，生物工艺的发展应集中于检查培养方法的类型(例如，封闭批处理、补料批处理和连续培养)和生物反应器的类型(例如，搅拌槽反应器、泡柱和滴床)，这些都是为最终生产工艺所设想的。此外，确定和优化结垢标准、培养基、饲料来源、质量和数量、接种物的储存和制备以及下游加工操作的类型也非常重要。例如，一些产甲烷菌生长在廉价的最小培养基中(Taubner和Rittmann, 2016；莫尔霍费尔等人，2018)，可在标准搅拌槽生物反应器中培养(Seifert等人，2014；Azim等人，2017；里特曼等人，2018年)。

已用于扩大CH的产甲烷菌₄或生物质生产在生物反应器Methanothermobacter marburgensis和米。maripaludis,分别。为米。marburgensis，成功扩大至B-TRL≥5 (Pfeifer等人，2021)、成长和CH₄加料批量生产和连续培养生产已经过彻底检查(Seifert等人，2014；Azim等人，2017；里特曼等人，2018年)。然而，管道用于快速生产高浓度的生物质米。maripaludis分批补料栽培模式至今仍未出现。

扩大培养的机会产甲烷球菌属maripaludis

本研究提供了各种栽培技术的综合比较米。maripaludis。通过对已建立的厌氧方法的优化，一个广泛的实验室规模的手册的实验方法，以快速生物量生成已开发。日常培养米。maripaludis几十年来主要依靠密闭分批瓶，36年来最高培养量从0.2 L增加到0.23 L (鲍尔奇等人，1979年；戈亚尔等人，2015年)。在0.4 L SCB培养物中添加气态H₂/公司₂基材正在报道，这是同样可访问的，可靠的和可复制的。结合磁性搅拌器的另一种搅拌方法，SCB培养可以更快、更经济地产生生物质，这足以进行分子分析，而不需要复杂的培养设备。这种方法受到灵活的封闭批处理系统的启发，该系统是为培养体积为1.5 L的甲酸产甲烷菌开发的(朗等，2017)。然而，这里的栽培米。maripaludis在升范围内依赖于气体H₂/公司₂基材补充和更复杂的进料批量设备。

在恒化器容器中，米。maripaludis已经生长了1.3 L的体积，达到峰值OD₆₆₀约为1.7，最高报告μ为0.24 h⁻¹（Haydock等人，2004年)，最近已几乎复制(Müller等，2021)。这个系统是为研究营养限制而建立的(亨德里克森等人，2007年，2008；科斯塔等人，2013)，其中明显米。maripaludis菌株(S2, S52)已在各种介质(矿物McN，添加或不添加醋酸盐，但也定义了复合物McA和McCas)的低光密度下培养，并且它们的OD已在不同波长(600或660)下测量，因此由于Lambert-Beer定律，使直接比较复杂化。在一个3 L反应器中使用2 L培养株S2，在改良的富含McCas培养基中培养，补充cas氨基酸，获得了最高的报道OD₆₀₀约2.7及3至4小时的加倍次数(Walters和Chong, 2017)。此处，加倍时间为4 ~ 5小时，OD最高₅₇₈在气态H上生长的菌株S0001的平均浓度达到3.4₂/公司₂底物在还原的141介质中，补充醋酸盐。此外，首次报道的栽培米。maripaludis在一个22升不锈钢生物反应器中，在15升的工作容量中，为野生型和重组产甲烷细胞工厂在工业相关规模的生物技术进步中应用提供了新的机会。

0.05 L SB培养

在实验室规模，封闭批量培养模式通常是日常选择的方法，因为它是稳健的，易于处理，并允许同时分析不同的实验组。米。maripaludis因此，在本研究启动前，仅在作者组的SB中培养。然而，产生的生物量很少足以用于生理过程的分析测量或扩大生物过程的发展。这里是0.05 L SB培养米。maripaludis作为一个稳定的实验平台，对不同的搅拌工艺进行了测试和比较。SB不是在水浴中进行双向摇动，而是在轨道振动器上进行摇动，或者在空气孵化器和气候室中进行磁搅拌。一般来说，震动是更可行的方法，因为长时间占用4个(或5个零控制)磁搅拌板可能会有问题。然而，考虑到在最高可能的震动强度下表面积位移的几何形状(~180 rpm，这里仅针对SCB进行测试)，这种培养模式可能已经达到了在本研究中进行的实验中将含碳气相转移到液相的效率极限。

相比之下，通过数字搅拌板搅拌磁性搅拌棒可以获得更好的分辨率(1 rpm)和更宽的范围(0 - 1400)，因此可以进一步增加顶空气体基板的涡流表面积。因此，在扩大到0.4 L SCB培养之前，搅拌已经成为更有利的搅拌方法。有趣的是，观察到对各自条件的适应，因为将100/sha组置于相同的条件下(100/sha.2)导致生长改善，其表现优于100/str组，并与500/str组(图1)。这可能是由于长期接触定期喂养、培养和采样间隔的积极影响。煽动SB文化米。maripaludis(500/str/2×)的OD值最高₅₇₈在每天两次喂食时间点后(表1)。然而，尚不清楚是更大的摇晃(180转/分)还是搅拌(800-900转/分)对SB培养更有利米。maripaludis结合两次或更多的气体间隔。

0.4 L SCB培养

SCB培养米。maripaludis在研究过程中逐渐成为最有利的封闭间歇培养技术，因为它们证明了与SB一样的可重复性，而且它们产生了足够的生物量用于培养转移到进料间歇反应器。此外，放大后的低温储备的可再生再生被证明是有效的接种预培养物，在以150转/分钟的转速摇培养24小时后，预培养物已经显示出生长(数据未显示)。然而，SCB培养有两个缺点。SB可以承受高达5bar的相对压力(6bar绝对压力)，而SCB只能承受1.5 bar的相对压力(2.5 bar绝对压力)。因此，SCB培养的进一步优化必须包括两次或三次投料时间点，或者在最好的情况下依赖于自动压力测量和投料系统。

第二个缺点涉及技术安全问题。单个SCB培养物的重量约为1公斤。在激振器上放置4个(或5个，包括零控制)，在最大搅拌水平约180转时，如果支架安装不稳定，可能会损坏仪器甚至人员。因此，尽管事实是米。maripaludis在以180转/分的转速摇晃时生长最好(图2)，在本研究的后期阶段，搅拌(500和800 rpm;图4，5)是选择的方法，因为以800转/分的速度搅拌培养物的表现略差于以180转/分的速度摇晃培养物(图2)。与SB培养相同，将饲料增加到每天两次，可以促进生长，降低GT_lSCB培养以100转/分(100/sha和100/sha/2×;表1)。

让米。maripaludis以1100和1400转/分钟的转速搅拌导致生长严重迟缓。然而，在类似条件下，结合预适应和持续向增加搅拌的转移，极μ是可能的。在这种情况下，有趣的是观察到以1100转/秒(1100 /秒)搅拌的SCB培养物的生长曲线只能与接种后113小时左右以500转/秒(500/秒)搅拌的SCB的生长效率相匹配(图2一个)，但在耗用基板方面(图2 b)， 1100个/str重复与180个/sha和800个/str生长最成功组的结果相匹配。因此，尽管需要预适应，且未适应培养物的生物量生成速率明显较低，但在较高转速下搅拌显然可以更好地将气体底物转移到介质中，并在密度较低的培养物中提高甲烷生成速率。

1.5 L反应器培养物

封闭批条件的优化主要是由于需要产生足够的生物量接种到生物反应器容器中，因为最初的生物反应器接种未能成功地利用0.05 L SB培养生物量(结果中未显示)。由于磁搅拌棒模拟了生物反应器容器中拉什顿叶轮的机械压力，搅拌0.4 L SCB培养物后来被确定为最有前途的预培养物。然而，在阶段4-7的无监督适应轮中，以150转/分钟转速摇晃的SCB培养物的接种物也在生物反应器培养中成功生长(数据未显示)。

在这个项目的关键阶段，软收获程序被证明是在补料批量模式下可重复生长的最重要方面。在第1阶段，接种物收获量为10,000 g (表2)，导致所有测试斜坡的滞后期延长及线性增长缓慢(图3一- - - - - -E)。将g力降低到4000(阶段2)，进一步降低到3000(从阶段3开始)，并重现阶段1的实验，极大地改善了培养生长，这可以从较高的起始OD中看出₅₇₈，由于细胞存活率提高，以及生长曲线改善和峰值最大值(图3一，B，D)。

的成长米。maripaludis在1.5 L反应器培养物中，由于在第3阶段的适应轮中首次使用了指数阶段的接种物，从而进一步改善了(图3 e)。在最成功的逐步保守斜坡剖面(图3 d)，繁殖了几次(第1、2、4和7阶段)，其中生长最好的是在第7阶段，第一次使用指数接种量。然而，在第5阶段和第6阶段，分别将指数生长后期和早期的生物量置于替代的逐步保守斜坡剖面中(图3 f)，没有补偿转速超过1200转的增加。将转速提高到尽可能高的水平是为了使气态H的溶解度更好₂/公司₂底物进入液相但显然有一个上限米。maripaludis这种说法得到了有关其相当脆弱的细胞结构的报告的支持。结合SCB数据，本研究的结果显示约900 rpm(±100)。然而，在指数生长中使用接种物有可能提高其培养性能米。maripaludis暴露于连续和逐步渐进的斜坡剖面，因为这些条件只测试了固定阶段的接种物。原因是本项目所有1.5 L反应器培养实验均在单个反应器单元上进行，有4个重复容器，这意味着接种体需要在前一轮培养结束后才能产生。

尽管事实上，封闭批次的培养时间已经大大减少和喂批次培养米。maripaludis已经超过了最高的OD₅₇₈价值观方面，还有很多可以进一步提高的地方。对于1.5 L反应器培养的最佳搅拌斜坡曲线，似乎持续的渐进增加支持在24小时后最快地退出滞后期，并保持指数增长直到48小时，此时rpm增加到800以上就变得太紧张了米。maripaludis并标志着固定阶段的开始(图3一)。因此，在800 - 1000 rpm结束时，以指数接种为连续渐进的斜坡可能比循序渐进的保守斜坡更有利。第二代批量培养，已经适应了更高的搅拌，甚至可以承受转移到600-800的持续搅拌的培养中，或者转移到400-600的开始搅拌的培养中(持续24小时)，然后持续增加(超过12-24小时)至800 - 1000转。

扩大管道

拟议的规模管道米。maripaludis不一定包括每个阶段表现最好的实验组，而是灵活组合培养方法。如前所述，在封闭批处理模式下的大强度(≥500 rpm)搅拌可能需要预先适应的峰值性能米。maripaludis，这将是应用项目的情况，旨在提高古生菌细胞工厂的生产力。另一方面，用于基础研究的生物质生成可以很容易地采用这里提出的实验装置(图4)。根据设备的可用性，研究人员可以在封闭批量模式下重组栽培技术，在进料批量模式下长时间连续转移时重组搅拌坡道。

此外，首次报道了15l反应器培养米。maripaludis将支持将生物甲烷化过程扩大到与工业相关的规模。下一步将需要在指数生长中使用接种物，并比较不同的搅拌斜坡剖面。

综上所述，本研究为自养型氢化甲烷菌的培养提供了多种技术的综合手册米。maripaludis。对现有方法的优化和新策略的发展也可以适用于其他自养生物。就封闭批处理模式而言，增加进料时间点的数量，并在中等高强度(800-1,000 rpm)下测试搅拌，将很容易确定峰值性能的条件。单阶段补料分批栽培米。maripaludis将需要额外的实验来确定最佳的培养条件，并可以进一步推进到连续培养。在15 L反应器培养中培养可再生的生长通常遵循1.5 L反应器培养的实验方法，通过测试最有利的搅拌斜坡剖面和在指数生长中应用接种物。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

作者的贡献

惠普和SK-MRR公司构想并设计了这项研究，并撰写了手稿。HP、AR、LP和DN进行了研究。HP, AR和LP分析了数据。HP、BR和SK-MRR贡献了新的方法或模型。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

利益冲突

AR、BR和SK-MRR声明，由于在Arkeon GmbH工作，他们存在相互竞争的商业和财务利益。

其余作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

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参考书目