琼东南盆地含热成因天然气水合物海洋沉积物微生物群落特征
Siwei刘1
__，
山于
Hailin杨
李渊源
海龙路- 1北京大学地球与空间科学学院，中国北京
- 2北京大学地球与空间科学学院北京国际天然气水合物研究中心，中国北京
- 3.国家地质分析研究中心，北京，中国
- 4广州海洋地质调查局，中国广州
生物成因气和热成因气是天然气水合物形成的两大因素。两种来源的甲烷水合物都可能对海洋沉积物的生态特性产生关键影响。然而，关于含热水合物沉积物中微生物多样性的研究还很有限。这项研究调查了原核生物的多样性和分布与垂直分布的产热的气体水合物沉积物的核心与不同的事件从琼东南盆地的Illumina公司测序获得16 s rRNA基因以及分子地球化学技术。在本研究中，我们发现天然气水合物的存在对微生物多样性和群落组成都有重大影响。与无水合物地层相比，含水合物地层中微生物群落的丰度较高，多样性较低。Gammaproteobacteria在所有收集的样品中，放线菌属占细菌类群的主导地位，而古菌群落则沿着沉积物层的垂直剖面急剧变化。地球物理和地球化学参数还确定了厌氧甲烷养菌的显著分层分布。此外，无水合物区还存在大量稀有类群，这些类群可能在深层生物圈中对蛋白质进行发酵分解，并可能对水合物的形成做出反应。
简介
天然气水合物主要存在于相对高压低温条件下的大陆斜坡沉积物中，是由甲烷、乙烷、CO等水分子构成的笼状结构中含有低分子气体的结晶固体2等。(麦克唐纳等，1994年)．天然气水合物是地球上碳的丰富形式(Kvenvolden 1993)和温室气体甲烷最重要的中间汇，甲烷似乎动态地储存在水合物储层中或从水合物储层中释放出来(狄更斯,2001 b；狄更斯,2001；Kvenvolden 2002；Boetius和Wenzhöfer, 2013)．
在自然界中，甲烷气体可由两种主要过程产生，即“生物成因”或“热成因”(Whiticar 1999)．生物甲烷是由微生物群落作为厌氧呼吸的一部分产生的，而热生气体则是由有机物在高温下的热催化降解产生的(Schoell 1988；Wuebbles和Hayhoe, 2002)．甲烷的生物成因形成是由产甲烷古生菌进行的通过三种主要途径:氢营养化、乙酰碎屑化和甲基营养化甲烷生成(刘和惠特曼，2008；Thauer et al.， 2008；Mayumi等人，2016)．在海洋沉积物中，甲烷储层的大部分被微生物消耗通过甲烷(AOM)的厌氧氧化主要伴随硫酸盐的还原，但铁、锰、硝酸盐和亚硝酸盐也可作为AOM过程中的电子受体(巴恩斯和戈德堡，1976年；Raghoebarsing等人，2006；比尔等人，2009年；Ettwig等人，2010年；Yang等，2021)．通常，AOM发生在硫酸盐-甲烷过渡区(SMTZ)，并由微生物群进行，其中古菌厌氧甲烷养菌(ANMEs)与细菌伙伴(巴恩斯和戈德堡，1976年；Boetius等人，2000年；Reeburgh 2007)．
深海沉积物中微生物的结构和分布与水合甲烷的关系已受到世界各国的广泛关注。在含甲烷水合物的海底沉积物中，例如在Cascadia边缘(克雷格等人，1995年；Bidle等人，1999；Lanoil等，2001，2005；Marchesi等人，2001年；米尔斯等人，2003年，2005；Knittel et al.， 2005；Inagaki等人，2006；努努拉等人，2008年)、南开海槽(Reed等人，2002年；Kormas等人，2003年；纽贝里等人，2004年；米尔斯等人，2012；Katayama等人，2016，2022)、东日本海(Yanagawa等人，2014)、安达曼海(布里格斯等，2012)、郁陵盆地(Jeong等人，2010年；Lee et al.， 2013；Ryu等，2013；Cho等人，2017)、北极(Carrier等，2020年)及南海神狐海域(廖等，2009；Lin et al.， 2014；焦等，2015；崔等，2019，2020)．其中一些研究是为了比较有或没有天然气水合物的海洋沉积物中的微生物群落(Inagaki等人，2006；Yanagawa等人，2014；焦等，2015；崔等，2020)．然而，由于生物水合物的广泛分布，以及微生物在甲烷代谢中的重要作用，以往的研究几乎都集中在含有生物甲烷的海洋沉积物上，试图弄清楚富含水合物的沉积物中碳循环的微生物过程(Inagaki等人，2006；Yanagawa等人，2014；焦等，2015)．不可忽视的是，天然气水合物的形成或分解，即使它们不是生物成因产生的，也会改变海底沉积物的地球物理和地球化学性质，并进一步影响其中的微生物群落(Tomaru等人，2004年；Lee et al.， 2008)．此外，较重的碳氢化合物(C2 +)，亦可能影响微生物的分布及代谢潜能(董等，2019，2020)．
到目前为止，尚不清楚热成因天然气水合物相关海洋沉积物中微生物群落的组成和分布特征，以及它们是否也能与含有生物水合物的海洋沉积环境中典型的不含天然气水合物的海洋沉积物相区分。
琼东南盆地(QDNB)是中国南海海相天然气水合物勘探目标之一，在该盆地发现了高饱和天然气水合物(崔等，2019；Wei等，2019；叶等，2019年)．根据碳同位素和水合物相关气体组成的现场分析，已有研究认为热成因气体可能是QDNB水合物的主要来源(Liang等，2019；叶等，2019年；耿等，2021)．本研究旨在表征与热成因天然气水合物相关的海洋沉积物中微生物的丰度和多样性，并确定其群落结构随水合物分布的空间变化规律。因此，我们利用分子、地球化学技术和统计群落分析研究了从QDNB稳定天然气水合物带收集的多层水合物沉积物芯中的微生物群落。我们报告了QDNB岩心含热生水合物海洋沉积物中的微生物群落可以从统计学上与典型沉积物中丰度显著较高而多样性较低的微生物群落进行区分，还发现了古细菌在各种水合物赋存物中的显著分层分布。推测天然气水合物的形成减少了大量进行蛋白质发酵降解代谢的稀有类群。
材料与方法
现场描述和样本收集
研究区位于琼东南盆地，琼东南盆地是南海西北陆坡潜在的天然气水合物含油气盆地之一(图1)．沉积物的主要成分是半深海粘土粉砂和粉质粘土(孟等，2021)．与流体运移和天然气水合物沉积有关的地球物理和地质特征，包括泥底辟、底部模拟反射器和气体烟囱，在该地区广泛存在(Zhang等，2019)．根据碳同位素分析，在QDNB的一些地点，热成因气体可能是主要的水合物来源(Huang等，2016；Liang等，2019；Lai等，2022；Ren等人，2022)，低C1/ C2 + (3 - 68)水合物结合气体的数值也表明，热成因气体是QDNB水合物形成的主要驱动力(叶等，2019年)．
图1．南海琼东南盆地(QDNB)位置图红点为取心部位W01。
沉积物岩芯样本来自琼东南地区W01站点，该站点在2019年进行的GMGS6钻井考察中，使用带球阀的压力取心工具(PCTB)在1513.89 m的水深中钻探并取心至海底以下176.7 m (mbsf) (孟等，2021；图1)．W01站点位于深层地下气体烟囱之上，表明沉积物中的上游气体通量(孟等，2021)．根据以往的报道，W01的天然气主要是甲烷，其次是C2-C5气体(Huang等，2016)．
详细的地球化学剖面表明，W01岩心表现出明显的天然气水合物指标，整个岩心的孔隙水硫酸盐被耗尽，表明硫酸盐-甲烷转变深度位于0 mbsf。在W01岩心内，本研究使用的子样品分别采自3个深度层段:2个含天然气水合物层段，分别为4.5 ~ 27.5 mbsf和41 ~ 69 mbsf; 70 ~ 176 mbsf深度层段根据钻井结果确定为无天然气水合物层段。根据Holland等人建立的天然气水合物形态分类方法，在4.5 ~ 27.5 mbsf地层中发现了II型天然气水合物(裂缝充填型天然气水合物呈脉状、块状和结节状形态)，而在41 ~ 69 mbsf地层中发现了I型天然气水合物(浸没型孔隙充填型天然气水合物)。Holland et al.， 2008；孟等，2021)．天然气水合物的赋存情况似乎也受到寄主沉积物成分变化的影响，因此，根据岩性特征，研究层的水合物可进一步分为3个亚型(II-b、I-b和I-a) (Bahk等人，2013)．
在这项研究中，使用50 ml切割端注射器从W01岩心中提取了9个子样品，其中6个样品具有3种水合物类型(I-a、I-b和II-b)， 3个样品位于深层无水合物区。详细的样本信息总结在表1．子样本存储在−20°C的船上，在探险结束时用干冰运输到实验室，并存储在−80°C，直到进一步处理。
表1．QDNB W01核9个回收样品的信息。
地球化学分析
在取芯和加工过程中，温度由内部T/P传感器监测。在船上，采集后立即用pH计对孔隙水进行pH值测量。采用硫酸钡浊度法和折射法分别定量测定孔隙水的硫酸盐和盐度。阴离子(Cl−和Br−)采用离子色谱(Metrohm 790 IC)标准方法定量，分析精密度为2%。沉积物样品的粒度是使用激光衍射粒度分析仪(Mastersizer 3000, Malvern, uk)测定的，如前所述(Luo等，2012)．沉积物总有机碳(TOC)采用国家地质分析研究中心的碳硫测定仪(CS 744系列，Leco)测定。在CS744分析仪的烘箱内，在~ 1100℃下燃烧200-300 mg样品，二氧化碳(CO2)产生的热量由红外单元测量。样品一式两份分析给QA/QC以确保所取样品的均一性和分析精度(Baux等人，2019)．使用x射线荧光(XRF, GeniusIF, Xenemetrix Ltd.)分析沉积物样品的主要元素组成，精度优于8%。的δ13C和δ18如前所述，使用稳定同位素比质谱仪(IRMS, Thermo Delta V)和自动碳酸盐制备设备(GasBench II)测量子样品体碳酸盐相的O值(Liu等，2022)．
DNA提取，PCR扩增，Illumina MiSeq测序
对于扩增子测序，使用FastDNA Spin Kit For Soil (MP Biomedicals)从0.35 g沉积物中提取微生物基因组DNA，按照制造商的说明进行聚合酶链反应(PCR)扩增。定量PCR (qPCR)采用Natarajan et al. modified SDS-based方法(Natarajan等人，2016)．DNA浓度使用NanoDrop™2000分光光度计(赛默飞世尔科学公司，美国)测定。
利用条形码通用引物组Univ519F/Univ802R (补充表2)．PCR反应混合物为稀释后的DNA提取物1 ~ 10ng, 1 × FastPfu缓冲液，每个引物0.4 μmol/l，脱氧核苷酸(dNTPs) 250 μmol/l, FastPfu聚合酶1 μl (TransGen，中国)，最终体积为50 μl的ml - q水。在以下条件下进行热循环:95℃初始变性5分钟，然后94℃20秒，50℃20秒，72℃25秒，最后在72℃延长10分钟，循环29次。阴性(无模板)对照用于排除污染。对于每个样本，根据制造商的说明，使用EZNA凝胶提取试剂盒(Omega Bio-Tek，美国)汇集和纯化来自至少六个独立PCR产物的扩增子，并使用中国上海Majorbio生物伤害科技有限公司的Illumina MiSeq平台(Illumina Inc.，美国)进行高通量测序。
细菌、古细菌16S rRNA基因的定量分析mcrA基因
为了量化沉积物样品中细菌和古菌域以及厌氧甲烷养菌的丰度，使用已发表的特异性引物组(补充表2)．每个反应(20 μl)含有1× KOD SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Co. Ltd)， 5 - 8ng模板DNA，正向和反向引物各0.8 μM。所有qPCR反应均使用CFX Connect实时系统(Bio-Rad, CA，美国)进行。
将已知数量的目的基因片段纯化PCR产物稀释10倍，生成标准曲线。每个反应重复三次。分析了熔化曲线，以检测引物二聚体的存在。实验条件列于补充表2．
序列处理
采用Git for windows 2.28.0、R 4.2.0、Rstudio 1.4.1106、VSEARVH v2.15.2 (埃德加,2010)，以及usearchv10.0.240 (Rognes等人，2016)．其中，原始序列数据首先由FastQC进行检验1处理如下:使用“-fastq_mergepairs”命令连接成对端读并按样例重命名，使用“-fastx_truncate”删除条形码和引物后过滤低质量读(−fastx_filter命令)，使用“-derep_fulllength”命令删除冗余读和单例。此后，使用“-cluster_otus”命令在97%序列识别率下构造操作分类单元(OTUs)。然后将OTUs映射到Silva 123数据库(Quast等人，2012年)，使用VSEARCH中的UCHIME算法从chimera中移除序列(−uchime_ref命令)。根据VSEARCH(−sintax命令)中的sintax算法，在Silva 123数据库中对OTUs进行分类，去除分配给叶绿体和线粒体的OTUs。随后，USEARCH使用“fastx_getseqs”命令获得OTU表。
生物信息学和统计分析
对于alpha和beta多样性，样品在37,320个序列中使用R包纯素(Quast等人，2012年)对应于一个样本中最少的序列数。利用USEARCH的“-alpha_div”命令计算物种丰富度、Chao 1、ACE、Shannon、Simpson、Goods覆盖度等α-多样性指数，用包ggplot2描绘稀疏曲线。基于OTUs构建进化树后，使用-beta_div命令计算Unifrac、Bray_Curtis、Jaccard、manhattan和Euclidean的距离矩阵。采用GraphPad Prism 8.0.2软件绘制原核生物群落差异指数热图，采用ANOSIM软件检测沉积物组间微生物群落差异。
基于加权Unifrac距离和UPGMAs聚类的主成分分析(PCoA)图通过R软件中的vegan包、stats包和ggplot2包显示。使用R包ggvenn构造维恩图。在使用ggplot2包的Volcano图中可以看到显著不同的otu。采用基于t检验(BH-adjusted)的R包图谱，构建了含水沉积物组与游离沉积物组差异丰度微生物类群的热图p在标度归一化后的阶水平上< 0.05)。对过程和剧本的分析主要参考刘永信(Liu等，2021)．
利用PICRUSt(在ehbio在线平台上通过重建未观察状态对群落进行系统发育研究)预测核心W01微生物群的微生物功能谱。2对16S rRNA基因拷贝数变化的OTU表进行归一化，然后基于KEGG正交图谱(KO)和途径对每个样品的功能微生物含量进行归一化。然后使用R包devtools构建热图。
采用距离冗余分析(distance-based redundancy analysis, dbRDA)和R包纯素法判断环境变量对沉积物微生物序的影响。方差膨胀因子分析(VIF)在RDA分析之前进行，以消除环境成分之间的共线性，提高效率。使用R包统计进行约束排序的anova样排列检验。然后使用Windows 5.0的Canoco程序将该绘图可视化。
利用WGCNA包计算R中甲烷养菌与其他微生物类群的共生网络(朗菲尔德和霍瓦特，2008年)．在确定了微生物家族与Pearson的潜在正相关关系后R> 0.8和bh - fdr校正p< 0.001，仅保留甲烷养菌家族及其相关类群，使用Gephi 0.9.5无向网络交互平台和Fruchterman-Reingold布局(巴斯蒂安等人，2009)．
结果
沉积物地球化学条件
为了解微生物群落发生的地球化学条件，对W01岩心沉积物样品进行了总有机碳(TOC)、粒度、主要元素含量、碳酸盐稳定碳氧同位素组成(δ13C碳水化合物和δ18O碳水化合物)．在19、20、42 mbsf采集的前3个沉积物样品中TOC值均大于1%，而其他较深的样品TOC值均低于0.5% (图2一个)．粒度分布结果显示，W01岩芯中存在一层砂层，62和64 mbsf的两份沉积物样品为细砂，平均粒径分别为77.6和80.9 μm，其他沉积物样品为平均粒径较小的粉砂，为7.43 ~ 13.18 μm (表1；图2 b；补充表1)．这两个样品的TOC含量、氯化物、Br浓度、盐度最低，碱度相对较高(补充表1)，此外，在62和64 mbsf的沙质样品中，Fe、Mn、Al和K的浓度较低，而Si和Ti的浓度则较高(图2 e)，表明这两个样本存在地球化学异常。此外，为了确定W01站点甲烷通量的来源，我们检测了沉积物中碳酸盐的碳氧同位素组成，这些同位素组成受到aom驱动碳酸盐百分比的影响。结果表明，δ13C和δ18沉积物中碳酸盐O值(δ13C碳水化合物,δ18O碳水化合物)分别为- 2.50‰至- 1.42‰和- 6.64‰至- 1.05‰(图2 f；补充表1)，表明甲烷的热成因是在深层地下(Whiticar 1999)．
图2．TOC深度剖面(一)，平均粒径(B)细菌和古菌16S rRNA基因丰度和mcrA(C)，的比值mcrA古细菌16S rRNA基因拷贝(D)，主要元素含量浓度(E)碳酸盐的碳、氧同位素组成稳定(F)岩心W01的沉积物样本。无天然气水合物区以阴影区表示。
微生物丰度
细菌、古细菌16S rRNA基因和mcrA通过qPCR估计拷贝数，分别代表细菌、古生菌和厌氧甲烷养菌的丰度。结果表明，细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数在1.14 × 10之间6到9.97 × 107从3.36 × 1063.88×108g副本−1湿重沉淀物(图2 c)．古生菌16S rRNA基因的丰度通常比细菌的丰度高一个数量级，但在一个实例中，最上面的样本为19 mbsf，其中细菌占整个原核生物群落的84%。Pearson的分析表明，细菌和古生菌16S rRNA基因的总丰度在20 mbsf时达到最大值，而在三个最深的无水合物样品中，在71、73和159 mbsf时急剧下降，与TOC呈正相关(r= 0.74,p= 0.024;补充图1)。
的基因拷贝数mcrA在所有采集的沉积物样品中均检测到一种甲烷营养古菌特异性基因，其变异范围为4.16 × 104到4.12 × 105g副本−1湿重沉淀物(图2 c)．甲烷代谢群占各沉积物样品古菌细胞总数的比例，由复制数的比值估计mcrA古细菌16S rRNA基因的差异随深度的增加而降低，分别为0.96和0.02%，而在天然气水合物带以下的3个深层非天然气水合物沉积物样品中则有所增加，从1.27增加到4.79% (图2 d)．
Alpha-diversity分析
九份沉积物样本覆盖了含水合物的浅层至深层无水合物地带(有关详情，表1)用于DNA分离和原核多样性分析。所有沉积物样品的MiSeq测序共获得496,887条高质量序列(中位数为59,094条，范围为37,320 ~ 67,775条)。在97%的序列一致性阈值下，鉴定出5,505个OTUs(中位数= 674个OTUs，范围从182到3,088个OTUs，其中分别包括5,388个细菌OTUs和117个古细菌OTUs (补充表3)．细菌序列总体占优势，细菌OTUs的绝对数量较高，占每个样品总序列的92.2-99.9%。物种稀少曲线在当前测序深度下均趋于平稳(图3一)，表明测序已达到饱和，测序覆盖了所调查W01样品中的所有微生物种。
图3．W01沉积物柱的Alpha和beta多样性。(一)otu水平稀少度(观察物种)曲线。(B)曹国伟1估计丰富性和香农指数。无水合物区用阴影区表示。(C)基于加权Unifrac距离矩阵的主坐标分析(PCoA)显示W01沉积物样品微生物群落结构的变化。每个点代表从一个样本中恢复的整个微生物组合;彼此绘制得越近的样品在微生物组成上越相似。(D)树状图显示基于OTUs的样本的层次聚类。(E)显示不含水合物和含水合物样品之间微生物OTUs重叠程度的维恩图。(F)通过差异丰度分析，与不含水合物的样品相比，含有水合物的OTUs显著富集(红色)和枯竭(蓝色)。富集和耗尽的OTUs代表相对丰度高或低两倍的OTUs (p含水沉积物中均< 0.05)。
W01的微生物多样性呈垂直变化。含水合物沉积物的Chao1多样性相对较低，随着深度的增加，Chao1指数从19 mbsf下降到64 mbsf，而在深层无水合物带采集的3个样品中，Chao1指数从71 mbsf陡增到159 mbsf。在62 mbsf和64 mbsf的两个砂样中计算了最低值。Shannon指数显示了与Chao1估计量相同的趋势(图3 b；补充表4)．此外，Chao 1、Shannon指数、OTU丰富度、Inverse Simpson指数和Ace指数在三个最深的样品中均显著增加，表明W01核无水合物带的原核生物多样性明显较高(补充表5)．
微生物组成及分布
细菌社区
基于16S rRNA基因V4高变区，采用通用16S引物同时针对细菌和古菌，得到微生物群落结构。我们在W01沉积物中发现了高度多样化的细菌群落，多达76门。总体而言，在各深度范围内，恢复序列以Proteobacteria (α-和γ-亚群)、Actinobacterota、JS1 (Atribacteria)、Firmicutes和Bacteroidota为主，占总序列的85.12%。与不含水合物的样品相比，JS1谱系和Aerophobota在含水合物的粉质沉积物中含量较高，而在含水合物的砂质沉积物中含量较低。然而，在无水区，许多类群(如acidobacterta、Chloroflexi、Planctomycetota、Cyanobacteria、Gemmatimonadota和Myxococcota)数量较多，占总数的百分之几(图4一左面板)。此外，62和64 mbsf的砂质水合物相关样品以最低的门品种为特征，以较少的门为主，这与alpha多样性分析的结果一致(图3一左面板,补充表4)．
图4．基于16S rRNA基因标记扩增子的Illumina MiSeq测序，对QDNB W01岩心9个沉积物样品进行微生物群落分析。每个样本中指定类群的百分比用彩色条表示。的分布(一)细菌和古菌群落在门水平上显示。细菌门和所有古菌门均列前20位。相关序列的相对丰度(B)W01岩心沉积物中含有AOM菌群中的甲烷菌、ANME和三角洲变形菌。百分比分别是指每个样品总古菌和细菌序列中甲烷养菌和硫酸盐还原菌序列的丰度。
古细菌社区
本研究在Core W01样品中共发现了11个古菌门，其中Bathyarchaeota、Thaumarchaeota、Woesearchaeota、Odinarchaeota、Thermoplasmatota和Euryarchaeota占古菌总序列的93.18%。值得注意的是，沿着W01核心的垂直剖面，古生菌成分发生了急剧的变化。与II-b型天然气水合物相关的富有机质沉积层(19和20 mbsf)古菌相对丰度较高，以Bathyarchaeota为主，分别占各样品古菌序列的72.4和55.8%。相比之下，I型含气水合物沉积物(42 ~ 64 mbsf)中古菌群较少。在与I-a型天然气水合物相关的砂样中，古菌丰度最低(小于0.3%)，而在深层无水合物区(71、73和159 mbsf)中，古菌群落的丰度在1%左右，以Thaumarchaeota为主，平均相对丰度为78.98% (图4一右面板)。
厌氧氧化菌
甲烷营养群落的生态位分布与核心W01一致。产甲烷菌和ANMEs古菌序列分别占W01沉积物古菌序列总数的3.08和0.60%。除62 mbsf和64 mbsf的两个砂样中未恢复甲烷营养相关序列外，在整个采样深度均检测到产甲烷生物相关序列，古菌相对丰度为2 ~ 30%。19和20 mbsf的产甲烷菌以Methanofastidiosales，占古菌reads的1.83%。产甲烷菌相对丰度达到峰值的42和49 mbsf的样品中含有甲烷菌Methanocellaceae而且Methanomassiliicoccaceae分别占每个样品中古菌总序列的10%和30%。Methanobacteriaceae而且Methanomicrobiales仅在深层无水合物带中发现，而Methanothermobacteriaceae而且Methanomassiliicoccaceae在含水合物层和不含水合物层(图4 b左面板)。
W01沉积物中的ANME组仅在含水合物的前3个沉积物样品中检出，19和20 mbsf的样品仅由ANME-1b组成，分别占样品古菌reads的0.66和0.03%。样本42含有最高丰度的ANME组，有24.35%的古生菌reads，包括ANME-1b, ANME-2c和ANME-2cMethanoperedenaceae(ANME-2d;图4 b中间面板)。而δ-proteobacterial硫酸盐还原细菌仅存在于低丰度的无水合物带(图4 b右侧面板)，表明anme和它们潜在的硫酸盐还原伙伴之间没有生态位重叠，我们推测这些沉积物中的一些硫酸盐还原过程与有机物的氧化分解耦合。
Beta-diversity分析
采用主坐标分析(PCoA)和层次聚类分析分析了W01沉积物样品群落结构的变化。前两个PCoA轴解释了63.8%的变异。基于加权Unifrac距离的PCoA图上沿轴1划分的含水合物带和无水合物带的沉积物样本(图3 c)．此外，基于Bray-Curtis分析，含水合物和不含水合物的沉积物样品分别聚类在UPGMA树上。这些结果表明，含水合物和不含水合物的沉积物中含有不同的微生物群落(图3 d)．值得注意的是，根据有限样本的ANOSIM测试(补充图2E)．
在本研究的类群集中，原核生物群落由为数不多的丰富类群和大量的稀有类群组成，OTUs数量最多的前3个类群占全部类群的45.61%(数据未显示)。通过维恩图显示常见和唯一的OTU数字，直观地描述样本组之间的相似性和重叠。结果表明，无水沉积物样品中存在大量独特的OTUs，占总OTUs的69.70%，占总序列的10.03% (图3 e；补充图2D)．此外，这两组之间的OTUs差异在火山图中进一步可见。与不含水合物沉积物相比，含水合物沉积物OTUs增强60个(1.09%)，减少1242个(22.56%)。在耗尽的OTUs中，稀有类群1237个(86.67%)(丰度低于0.1%)，说明无水合物样品中的稀有类群是造成两组间显著差异的主要原因(图3 f)．这一结论进一步得到了微生物阶数分析的证实，差异显著(p< 0.05)，未培养者除外Thermoleophilia，含水沉积物72个差异丰度目中71个已枯竭(补充图3)．这72个序列占总序列的9.85%，平均丰度仅为0.14%。这些差异表明W01岩心天然气水合物的形成可能通过减少深海稀有类群的数量和丰度来调节微生物的分类类群。
进一步利用序列数据进行PICRUSt分析，预测每个样品中微生物的功能多样性。根据功能注释和丰度对KEGG直系同源物(KO)前20个组绘制热图，并根据功能相对丰度对各组进行聚类。从热图中可以看出，W01 Core中微生物群落的功能潜力随深度的不同而不同，特别是不含水合物的样品在“Arginine and脯氨酸代谢”和“肽酶”等蛋白质代谢途径中KO丰度较高(图5)．
图5．通过与微生物组相关的代谢功能预测创建的前20个最丰富的KEGG(3级)代谢通路的热图剖面。
形成微生物类群分布的环境驱动因素
为了确定沉积物性质对微生物群落组成的影响，采用距离冗余分析(dbRDA)分析了沉积物性质变量，其中深度、TOC和Ti浓度是影响微生物群落组成的最大环境输入因素(图6)．与沉积物所有变量相关的第一个dbRDA轴解释了总变化的41.14%，并将顶部和底部沉积物样本分开，第二个dbRDA轴解释了拟合变化的19.81%。dbRDA分析显示JS1谱系丰富，Oceanospirillales而且Bathyarchaeia与TOC和Mn浓度有关，且Christensenellales，Thermomicrobiales,细菌性的均与深度和Ti浓度呈正相关(图6)．
图6．不同环境参数对微生物群落的影响及共现网络分析。基于环境变量拟合微生物分类组成的距离冗余分析(dbRDA)图(一)还有厌氧甲烷养菌(B)在订单层面。绿色圆点代表QDNB沉积物中9个检测到的沉积物样品;环境参数和微生物类群分别用红色箭头和蓝色箭头表示。(C)岩心W01中甲烷营养古菌与其他类群关系的微生物科共现模式连接节点的边表示显著的强正相关(p< 0.001,r> 0.8)。节点被分配到不同谱系的相应顺序着色，节点大小反映了每个微生物家族的相对丰度。
通过使用dbRDA，我们进一步确定了哪一组变量能更好地解释ANME和甲烷菌群相对丰度的变化。在本例中，甲烷代谢古菌组成与环境数据之间的相关性有70.37%是由两个轴解释的，证明了结果的可靠性。TOC和Mn浓度是主要的预测变量，显示出强烈的生态位偏好(图6 b)．ANME基团均位于dbRDA图的右下象限，与Mn浓度、TOC具有较强的相关性。Methanobacteriales与平均粒径呈最高正相关，Methanofastidiosales与高水平的TOC有关，Methanocellales与Mn浓度呈较强的正相关Methanomicrobiales而且Methanomassiliicoccales与深度密切相关(图6 b)．
共现网络分析表明，产甲烷和ANME家族与其他相应的类群形成单独的聚类，没有共同的节点(图6 c)，进一步证实了Core W01中甲烷代谢古菌的生态位分离。其中，ANME家族与高度丰富的细菌目呈显著正相关Burkholderiales，Rhodobacterales而且噬纤维菌目；Methanofastidiosales显著正相关，主要与Bathyarchaeia细菌和古菌域的低丰度科;Methanobacteriaceae与?显著正相关细菌性的，叶绿体，Kiloniellales而且Oscillopirales（图6 c)．甲烷菌/ANMEs与其他微生物类群之间的生态相互作用与深海沉积物中甲烷养菌与一些异养微生物物种之间的代谢相互作用是一致的通过厌氧食物链。
讨论
在存在水合物的海洋沉积物中，相当一部分甲烷是产热的。除了QDNB之外，在许多地区还发现了含有热生烃的天然气水合物，包括墨西哥湾(Sassen和MacDonald, 1994；Sassen等人，2004年)、里海(Diaconescu等人，2001)、黑海(伍德赛德等人，2003年；Mazzini等人，2004年)及日本海(Matsumoto等人，2005年)．在大多数地区，热成因天然气水合物更可能存在于约1,000-2,000兆立方英尺(甚至更深)的深层沉积物中，远低于甲烷水合物稳定带(Lu等人，2007)．预计，随着钻得更深，将会发现更多的生热复杂天然气水合物。热生水合物系统中微生物分布、细胞丰度和沉积物地球化学以及物理特征之间的关系尚未得到充分研究。我们的研究利用来自QDNB地区的沉积物核心样本，描述了该环境系统的微生物生物地理学特征。
W01岩心古菌相对丰度较高
在本研究中，qPCR结果显示，除了最浅的19 mbsf样本外，古生菌16S rRNA基因的丰度一般是细菌的10倍，但我们使用通用引物组的测序结果显示细菌序列占压倒性优势。精确量化海洋环境中某一微生物群的细胞数量在方法上具有挑战性(莫罗诺等人，2014)，并没有公认的方法来量化海洋沉积物中的细菌和古细菌，不同的技术对相同的样本产生的结果非常矛盾(Lloyd等人，2013a)．根据Lipp et al.，这与我们的qPCR结果一致，古生菌在海洋系统中比细菌更丰富(利普等人，2008年)，以往对海洋水合物丰富环境的研究，由于检测技术的限制，可能低估了古细菌的生物量(利普等人，2008年；努努拉等人，2008年；叶等，2009)．我们推测两种方法的不一致可能是由于PCR引物不同或DNA提取试剂盒未完全裂解古菌细胞所致。尽管我们采用的引物对扩增子测序被报道对古生菌和细菌的分类多样性有较高的预测覆盖率(Klindworth等人，2012；Starnawski等人，2017)，似乎我们的引物集与核心W01中大多数古菌的16S rRNA基因序列匹配不佳。在未来的研究中，使用古菌特异性引物进行序列扩增可能有助于生成最具信息的古菌图谱，并进一步证实我们在QDNB区域的观察结果。商业DNA提取试剂盒被认为能产生更好的可比性结果，特别是在不同个体之间，由于过程标准化(Natarajan等人，2016)，但来自W01沉积物样本的古菌细胞可能不能完全溶解，因为某些古菌细胞对试剂盒中对细菌细胞有效的溶解方案具有抗性，这是由于不同寻常的细胞壁结构(Roopnarain等人，2017)．结果表明，我们所采用的手工SDS-Based DNA提取方法用于qPCR模板制备，可以获得更大量的古菌基因组DNA，并具有更好的细胞裂解效率。据预测，古生菌能更好地适应极低能量的环境，比如存在于深层生物圈中的环境，而细菌则在更动态的环境中茁壮成长(范林丁,2007号)．然而，由于深层地下的生命周期和群落更替时间较长，具有较高丰度的古生菌不一定支配生物地球化学过程(利普等人，2008年)．
海洋水合物系统的潜在微生物指示物
在含水合物的海洋沉积物中，微生物群落组成与天然气水合物的发生和深度之间的关系较早地得到了证实(Lanoil等，2001；Inagaki等人，2006)．同样，在本研究的W01 Core中，含热生水合物沉积物与不含热生水合物沉积物之间的微生物群落结构存在显著差异。在天然气水合物勘探中，长期以来一直在寻找可作为补充指示物的微生物类群。在核心W01中，值得注意的是JS1谱系和Aerophobetes(Aerophobota phylum)在含水合物的粉质沉积物中含量高于不含水合物的沉积物，而在含水合物的砂质沉积物中含量较低。JS1是海底沉积物中普遍存在的细菌群，在一些含有天然气水合物的严格缺氧富有机质沉积物中经常被发现占主导地位，或与水合物的存在显著相关，表明具有含水合物的栖息地偏好(Reed等人，2002年；Inagaki等人，2006；努努拉等人，2008年；Jeong等人，2010年；Lee et al.， 2013；Ryu等，2013；Yanagawa等人，2014；Katayama等人，2016；Cho等人，2017)．最近的一项基因组研究表明，JS1具有使用多种底物进行发酵的潜力，以及与氢或甲酸酯清除产甲烷菌相结合的合成乙酸氧化(李等人，2018)．Aerophobota是一个新定义的细菌门，广泛分布在深海沉积物中(Chaumeil等人，2019年)．虽然一些先前的研究已经表明，糖化和发酵代谢的证据，至少在一些成员Aerophobetes，对该分类单元的多样性和代谢能力仍知之甚少(王等，2007；Rinke等人，2013；王等，2016)．Aerophobetes在含天然气水合物的沉积物岩心中发现了相对于南海无水合物沉积物丰度较高的天然气水合物(崔等，2019，2020)及在某些寒冷的渗水环境(王等，2016；Huang等，2019)．研究发现，含水合物沉积物的颗粒大小、沉积物成分和孔隙度(卢等，2011；Kumari等人，2021年)．在深度为62和64 mbsf时，沉积物中Fe、Mn、Ca、Al和K元素显著减少，Si和Ti显著增加。这些主要元素含量的异常表明这两种砂样的古气候和矿物学成分存在显著差异，其主要成分可能是石英或硅酸盐(Wei et al.， 2003；冯·埃纳滕等人，2016)．微生物的活动也可能与这些元素的变化有关。dbRDA显示Mn、Ca和Ti含量对某些微生物群有显著影响，虽然原因尚不清楚，但我们推测沉积物中锰含量等具有电价变化的元素可能反映了当地环境的氧化还原变化(英格拉姆等人，2016)．
值得注意的是，这两种具有水合物栖息地偏好的细菌谱系之间的相关性仅在粉质样品中被检测到，这表明微生物指数在应用于不同岩性的沉积物时存在局限性。
此外，我们的结果表明，在W01核心中，包括厌氧甲烷营养类群在内的古菌群落沿离散层急剧迁移，而细菌沿这些层的变化相当温和。值得注意的是，在62和64 mbsf的含砂水合物样品中微生物多样性最低，在该层中仅发现了4种古细菌OTUs，丰度较低(数据未显示)。海底微生物群落的垂直分层分布已在多项研究中得到报道，强调了环境特征(包括物理和化学因素)对微生物种群的重要性(Reed等人，2006年；Wilms等人，2006；Li et al.， 2008；Pachiadaki等人，2011)．特别是，Mills等研究表明，在墨西哥湾水合物生态系统中，沉积物带水合物和内部水合物之间的古菌群落存在显著差异，而细菌则无法区分，这表明古菌可能对环境波动的耐受性较差，而对特定的环境情况更具有特化能力(米尔斯等人，2005年)．古菌群落与天然气水合物动态的一致性和垂直变化表明，古菌群落可能对天然气水合物的赋存有反应，对岩性和水合物形态更为敏感。微生物，特别是厌氧甲烷养菌，根据以前未知的地球化学变量，表现出独特的分布。因此，可以进一步研究与含水合物海洋沉积物有关的古菌成员的存在情况，为深海沉积物中热成因水合物的潜在位置、聚集和形态寻找微生物指标。
W01芯中的甲烷养菌
在W01岩芯沉积物样品中，产甲烷菌只存在于少量含甲烷的海洋沉积物中，表明产甲烷作用的贡献微不足道。共发现5目甲烷菌，约占原核生物的0.03%。其中,Methanobacteriales，Methanomicrobiales,Methanocellales是能够减少CO的氢营养体2使用H2作为产生甲烷的电子供体(刘和惠特曼，2008)．Methanofastidiosa而且Methanomassiliicoccales据报道，这两种新型产甲烷菌由一种H2依赖甲基化途径，根据最近的基因组和转录组证据(Zhang等，2020)．由此可见，W01岩心生物成因甲烷的主要生成途径为加氢和甲基化甲烷。此外，ANMEs组，包括ANME-1b, ANME-2c，和Methanoperedenaceae(ANME-2d)在最上面的三个样品中检测到，其中没有发现硫酸盐还原德尔塔变形杆菌伙伴的16S rRNA基因片段。ANME-1b亚群是ANME聚类的主要组成部分，占ANME序列的50%。正如之前的研究所提到的，ANME-1可能独立于细菌的关联，我们的研究结果支持了上述观察。主要是基于观察sulfate-depleted ANME-1更普遍的产甲烷区域的沉积物,几项研究已经表明,ANMEs尤其是ANME-1,也许能产生甲烷,主要是(劳埃德等人，2011；Yanagawa等人，2011；贾格斯玛等人，2012；伯特伦等人，2013)．然而,吉永等人(2014)指出，由于AOM的返碳通量，SMTZ可能延伸到产甲烷带，在硫酸盐枯竭条件下，ANME可能实际进行AOM (吉永等人，2014)．我们没能放大mcrA尽管先前的研究报告了许多不同引物集的尝试，但仍将基因用作厌氧甲烷养菌的标记。我们推测其原因可能是在提取的PCR模板中来自甲烷养菌的基因组DNA所占的百分比很低，也可能是该菌的组织mcrA在W01位点的甲烷养菌与其他位点略有不同。
稀有类群发挥了重要作用
尽管事实上，微生物群落通常包含大量的稀有类群，这些类群构成了观察到的成员的大多数，但尚不清楚这种微生物“稀有生物圈”在群落动态中发挥什么作用。先前的研究表明，大多数环境元条形码研究的测序深度不够，而由低丰度序列(如单基因、双基因和三基因)代表的OTUs/类群可能在突出社区中的稀有谱系方面具有价值和信息(詹等，2014)．稀有微生物类群可能有助于丰富多样的营养循环，作为一个蓄水池，可以迅速响应环境变化，并在各种环境中促进群落稳定(谢德等人，2014)．在这项研究中，通过每个样品平均测序深度为1000万reads的高分辨率序列数据集，获得了海底微生物种群的独特结构视角。我们的结果显示，大量的微生物OTUs(5,505个OTUs中的5,436个)单独占序列的比例不到0.1%，突出了群落的整体多样性。令人惊讶的是，在TOC < 1%的深层无水合物沉积物中，发现了由大量稀有类群组成的显著的高微生物多样性，说明天然气水合物的存在可能对海洋沉积物中的微生物群落具有选择作用。
在甲烷生成带以下，食物链从发酵开始，相当简短(帕克斯等人，2000年)．根据Lomstein et al. (2012)，深层沉积物中有效有机质大多为微生物坏死性物质。由于细胞主要由蛋白质组成(按重量计算)，大多数可发酵坏死团以蛋白质和氨基酸的形式存在(Lomstein et al.， 2012)．研究表明，蛋白质降解似乎是某些地下微生物(Lloyd等人，2013b)和肽酶在类似环境下比其他酶更活跃(Coolen和Overmann, 2000；雅各布森·迈耶斯等人，2014)．我们对W01沉积物样品中微生物群落的预测功能剖面的结果表明，与含有水合物的沉积物相比，深层无水合物沉积物样品中肽酶的合成以及精氨酸和脯氨酸的代谢明显更丰富，这表明蛋白质的发酵分解是支持深层生物圈的关键策略，并且可以被天然气水合物的形成所抑制。
结论
本研究采用原核16S rRNA基因高通量测序，结合分子和地球化学分析，研究了多层热生水合物QDNB W01核心的微生物特征。根据我们的研究结果，得出以下结论:
1.在W01核心中，古菌细胞的丰度是细菌的十倍。
2.发现了与热成因天然气水合物存在相关的独特微生物丰度和多样性。
3.所有样品的细菌类群以Gammaproteobacteria和放线菌。“Atribacteria”门JS1和Aerophobota在含粉质水合物沉积物中富集，而在含砂沉积物中富集较少;而古菌群落在整个沉积物层的垂直剖面上发生了巨大的变化，厌氧甲烷养菌的空间异质性也被确定。
4.深层无水合物沉积物中含有大量独特的稀有微生物群，这些微生物群被认为可以进行蛋白质降解，并可能对水合物的形成做出反应。
5.微生物类群的分布与水合物的存在、产状及沉积相等环境参数有关。
我们的研究为热成因天然气水合物相关微生物种类的分布提供了新的视角，并为甲烷储层在地球上的生态作用提供了新的见解。
数据可用性声明
本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号可在以下网址找到:http://gsa.big.ac.cn/index.jsp, PRJCA011124。
作者的贡献
SY设计了这项研究，进行了实验，帮助分析，并与所有其他作者协商撰写了手稿。SL进行了系统发育和统计分析，并修改了这篇手稿。XL进行了核酸提取实验和定量PCR实验，并对本稿件进行了修改。HY, YL, XX做地球化学实验。YF收集并运送了样品，并提供了孔隙水参数。HL修改了这份手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。
资金
本工作由中国地质调查局资助(批准号DD20221703)。
致谢
我们非常感谢GMGS6钻井考察队的船员和科学家们在沉积物样本收集和分析方面的支持。我们也感谢广州海洋地质调查局的科学家测量孔隙水参数并提供这些未发表的数据。
利益冲突
作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。
出版商的注意
本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。
补充材料
本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2022.1032851/full#supplementary-material
脚注
1.＾http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
2.＾http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/PiCrust.html
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关键词:微生物多样性，热成因气，天然气水合物，Illumina测序，海洋沉积物，南海
引用:刘松，于松，陆霞，杨红，李勇，徐旭，陆红，方勇(2022)南海琼东南盆地含热成因天然气水合物海相沉积物微生物群落特征。前面。Microbiol．13:1032851。doi: 10.3389 / fmicb.2022.1032851
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