EnvZ/OmpR双组分体系对粘菌素抗性的生长、毒力和胁迫耐受性的贡献gydF4y2Ba气单胞菌属hydrophilagydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

气单胞菌属hydrophilagydF4y2Ba它是一种机会性水生病原体，可引起水生和陆生物种的各种疾病，因其高致病性而引起广泛关注。它会引起动物严重疾病(gydF4y2Ba辛格等人，2011年gydF4y2Ba；gydF4y2BaIgbinosa等人，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba刘等，2019gydF4y2Ba)和人类(gydF4y2BaZhang et al.， 2012gydF4y2Ba；gydF4y2Ba文图拉等人，2015gydF4y2Ba)，是最常见的病原体之一，对公众健康构成严重威胁。生存和对恶劣环境的适应可以增强或抑制某些特征的表达(gydF4y2Ba蔡等人，1997gydF4y2Ba；gydF4y2Ba不懂礼貌的人,2006gydF4y2Ba；gydF4y2Ba麦克马洪等人，2007年gydF4y2Ba)，促进gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba在不同的环境中。环境因素，如温度、营养、盐度、渗透胁迫、pH值和葡萄糖都有影响gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba以类似的方式(gydF4y2Ba皮亚内蒂等人，2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaJahid等，2013gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaCasabianca等，2015gydF4y2Ba)，防控难度较大。此外，由于出现耐药菌株，控制疾病爆发变得越来越困难gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba（gydF4y2BaVivekanandhan等人，2002年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba马等人，2018gydF4y2Ba)．因此，有必要多了解一下gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba寻找新的有效的控制和治疗方法。gydF4y2Ba

双组分系统(TCS)是细菌为应对各种环境压力而进化出的一种防御机制。TCS由一个传感器激酶和反应调节器组成，用于感知环境压力、转导信号和介导基因表达，这使得细菌在不同的环境压力下表现出较高的生存能力和增殖能力，这是其致病性的关键(gydF4y2Ba蔡和Inouye, 2002gydF4y2Ba；gydF4y2BaKrell等人，2010年gydF4y2Ba)．近年来，一些tcs的功能得到了研究。例如，在gydF4y2Ba弧菌parahaemolyticusgydF4y2Ba， PhoR负责细菌的运动和鞭毛的组装(gydF4y2BaZhang等，2020bgydF4y2Ba)，而Lux系统对于控制细菌生物膜的形成至关重要(gydF4y2Ba刘等，2021bgydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba爱德华菌属piscicida,gydF4y2BaEsrA/EsrB参与毒力基因表达的调控(gydF4y2BaYin等人，2020agydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba；gydF4y2BaShao等，2021gydF4y2Ba)．此外，其他一些tcs在形态分化中也起着至关重要的作用(gydF4y2Ba李等，2020年gydF4y2Ba)、抗生素合成(gydF4y2Ba李等，2020年gydF4y2Ba)、抗活性氧(gydF4y2BaZhou等，2022gydF4y2Ba)，以及多重药物耐药(gydF4y2Ba郭等，2020gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

EnvZ/OmpR TCS在革兰氏阴性菌中普遍存在，并调节孔隙蛋白基因以响应渗透压、pH值和饥饿的变化(gydF4y2Ba蔡和Inouye, 2002gydF4y2Ba；gydF4y2Ba袁等，2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaChhabra等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaChakraborty和Kenney, 2018gydF4y2Ba；gydF4y2Ba肯尼,2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaGerken等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba昆克尔等人，2020年gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba， EnvZ/OmpR TCS的沉默影响了100多个基因的表达，导致细菌的多种生理特性发生变化，如趋化性、粘附性、生物膜形成、耐受力，甚至致病性(gydF4y2Ba大岛渚等，2002年gydF4y2Ba)．EnvZ/OmpR TCS还可以控制其他病原体的毒力，包括gydF4y2Ba一种希瓦氏菌，福氏志贺氏菌gydF4y2Ba，gydF4y2Ba鼠疫杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba霍乱弧菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba贝尔纳迪尼等人，1990gydF4y2Ba；gydF4y2Ba袁等，2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaReboul等人，2014年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba昆克尔等人，2020年gydF4y2Ba)．在gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba， EnvZ/OmpR双组分调控系统最近被报道参与细胞内存活(gydF4y2BaDu等人，2022gydF4y2Ba)．有趣的是，我们之前的研究证实了EnvZ/OmpR是唯一在诱导中显著上调的TCSgydF4y2BaA.嗜水菌WCX23gydF4y2Ba变成耐粘菌素菌株gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba，并通过调节多种基因的表达(gydF4y2BaLiu等，2021agydF4y2Ba)．然而，EnvZ/OmpR TCS的其他功能很少gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba已经描述过了。沉默gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2BaOmpR损害细菌毒力，但不代表EnvZ/OmpR TCS的整体功能(gydF4y2BaZhang et al.， 2020agydF4y2Ba)．因此，对EnvZ/OmpR TCS的其他功能进行了研究gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba是必要的。gydF4y2Ba

由于EnvZ/OmpR TCS在gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba因此，深入了解EnvZ/OmpR在这种微生物中的作用对于预防、控制和治疗是至关重要的gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba感染。在本工作中，EnvZ/OmpR在粘菌素耐药中的生物学功能gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba通过比较亲本菌株和EnvZ/OmpR敲除株进行鉴定。我们证明EnvZ/OmpR TCS有助于细胞生长、毒力和应激反应gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba，增强了我们对EnvZ/OmpR TCS在调控中的认识gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba致病性和抗逆性。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

菌株、质粒和生长条件gydF4y2Ba

本研究使用的菌株和质粒来自我实验室(湖南省兽药工程研究中心，湖南长沙;gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)．突变体(gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba)和互补突变体(gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba)在我们之前发表的研究(gydF4y2BaLiu等，2021agydF4y2Ba)．关于这些菌株的信息已在我们以前的文章中描述过。所有菌株在色氨酸大豆琼脂(TSA;Oxoid, Basingstoke，英国)或在色氨酸大豆肉汤中培养(TSB;Oxoid，贝辛斯托克，英国)在28°C。粘菌素(Macklin, Shanghai, China)以以下浓度使用:4 mg/L用于gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba，为128 mg/LgydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

生长曲线gydF4y2Ba

用TSB液体培养基调节过夜培养至外径gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba分别取各200 μL的菌悬液分装到96孔板中，于28℃自动微孔板仪(BioTek，美国)中孵育。的ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba每1 h实时监测每个培养物，持续16 h，以检测其生长情况。gydF4y2Ba

转录组分析gydF4y2Ba

总之，菌株被培养到对数相ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)，28°C，然后收集细胞，用灭菌PBS冲洗两次。使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Hilden，德国)提取总RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher, Waltham, MA，美国)定量。rRNA被耗尽，cDNA文库制备如前所述(gydF4y2BaLiu等，2021agydF4y2Ba)．利用Illumina Hiseq 2000系统(Majorbio, Shanghai, China)对cDNA文库进行测序。只有有对数的基因gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba折叠改变> 1(上调)或< - 1(下调)，和agydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05为显著差异表达基因(DEGs)。基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集途径分析使用R包进行。gydF4y2Ba

实时荧光定量PCR分析gydF4y2Ba

总RNA提取于对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)，使用细菌RNA试剂盒(OMEGA, Norcross, Georgia, usa)，并使用Prime-Script®RT试剂盒(Takara, Tokyo, Japan)进行反转录。cDNA在qTOWER实时系统(Analytik Jena, Germany)中使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(Takara, Tokyo, Japan)进行扩增。所有实验都进行了三次。所有数据归一化至16S rRNA(内参基因)水平，并使用2gydF4y2Ba^{−ΔΔCTgydF4y2Ba}方法。用于定量实时PCR (qRT-PCR)的转录特异性引物列于gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

代谢组学分析gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)，28℃，用预冷PBS缓冲液洗涤2次，10000 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4℃下放置10分钟。丢弃上清液后，加入预冷甲醇/乙腈/水(V/V, 2:2:1)，冰浴超声1 h。混合物在−20°C下孵育1小时，以14,000×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置20 min，然后收集样品。使用UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS系统(UHPLC, Shimadzu Nexera X2 LC-30 AD, Shimadzu, Japan)结合Q Exactive Plus (Thermo Scientific, San Jose, usa)对收集的样品进行分析。另外，用同样的方法制备和分析质量控制样品。该方法的详细信息可以在gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba．使用从OPLS-DA模型和双尾Student 's模型获得的投影(VIP)值的变量影响的统计显著阈值来获得差异代谢物gydF4y2BatgydF4y2Ba以及(gydF4y2BapgydF4y2Ba-value)在单变量分析水平上的归一化原始数据。VIP值> 1.0和gydF4y2BapgydF4y2Ba-value < 0.05为显著差异代谢物。采用Fisher精确测试进行KEGG富集分析，并进行多次测试的FDR校正。丰富的KEGG通路在名义上有统计学意义gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05水平。gydF4y2Ba

毒力测定gydF4y2Ba

健康昆明小鼠(KM) 40只，体重20±1 g(注册号:SCXK2019-0002)，购自湖南SJA实验动物有限公司。将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)，并调节到适当的浓度。小鼠随机分为四组，每组10只，分别腹腔注射0.1 ml (gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpR,gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba)，剂量为1 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2BaCFU。另一组仅注射0.1 mL无菌生理盐水。攻毒后每隔2小时对小鼠进行观察，记录临床症状和死亡率。gydF4y2Ba

生物膜形成试验gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)，在28°C，并调整到外径gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba，取200 μl培养液(1:100稀释)，分装96孔板，28℃孵育。在培养皿中加入200 μl新鲜TSB作为空白对照。孵育24 h后，丢弃培养液，用无菌PBS洗涤三次。生物膜用200 μl甲醇固定15 min，用200 μl 1%结晶紫孵育15 min。用ddH冲洗几次后gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba将干燥后的生物膜在200 μL 95%乙醇中溶解10 min。在595 nm处测定吸光度。gydF4y2Ba

运动性化验gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。将一微升细菌悬浮液置于0.3% TSA板上，在28°C下孵育24小时。测定细菌的运动直径。gydF4y2Ba

趋化性分析gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。一端关闭毛细管，充满粘液，另一端浸入细菌悬浮液中。1 h后，取毛细管内液体，加倍稀释计数。测定毛细管内细菌数量。gydF4y2Ba

温度应力gydF4y2Ba

在37°C和42°C下检测菌株的生存能力，以评估每个菌株的耐高温能力。将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。用TSB液体培养基调节培养至外径gydF4y2Ba_600gydF4y2Ba0.1，然后在28℃(作为对照)、37℃和42℃孵育24 h。然后用无菌PBS将培养物加倍稀释，涂在TSA板上计数。计算治疗组与对照组的菌落形成单位(cfu)之比，以评估生存率。gydF4y2Ba

酸碱胁迫gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。收集细菌悬液，用无菌PBS洗涤两次，在TSB中pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0(作为对照)，pH 8.0或pH 9.0, 28°C下处理30分钟。然后将活细胞镀于TSA板上，稀释后计数。计算治疗组cfu与对照组的比值，以评估生存率。gydF4y2Ba

氧化应激gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。收集细菌悬液，用无菌PBS洗涤两次，然后悬浮在0.1 M H的PBS中gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，且不含HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba作为对照。培养20 min后，在TSA琼脂板上计数活细胞。计算治疗组cfu与对照组的比值，以评估生存率。gydF4y2Ba

渗透压力gydF4y2Ba

将菌株培养至对数相(ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba= 0.6±0.05)在28°C。收集细胞，用0.5 M NaCl重悬于新鲜TSB中，并调整至ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba0.1。每种菌悬液各200 μl，分装于96孔板中，于28℃自动微孔板阅读器中孵育。的ODgydF4y2Ba_600gydF4y2Ba每1 h实时监测每个培养物，持续16 h，以检测其生长情况。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验都至少测试了三次。所有数据均以均数±标准差表示。学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba使用GraphPad Prism 8软件的检验和方差分析(ANOVA)对常规数据进行处理和分析。gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

Envz/OmpR缺失降低了的生长gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba

生长曲线初步检查，以调查envZ/ompR缺失菌株是否影响生长速率，比较gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba．生长曲线结果表明，EnvZ/OmpR缺失gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba导致生长速率显著下降，但与EnvZ/OmpR互补恢复了这一速率(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)，表明EnvZ/OmpR参与了对gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．转录组分析显示，共注释了4843个基因。与gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05和∣loggydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以Fold Change∣> 1为阈值，共鉴定出896个差异表达基因(DEGs)，其中上调基因607个，下调基因289个(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)．富集分析显示氧化石墨烯的72个生物过程发生了显著变化，其中前15个过程涉及三羧酸循环、碳水化合物代谢过程和细胞运动(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)．KEGG通路分析表明，这些DEGs主要与TCA循环、丙酮酸代谢、硫代谢、精氨酸生物合成和氧化磷酸化有关(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba)．有趣的是，这些下调的DEGs也参与了TCA循环、丙酮酸代谢、精氨酸生物合成和氧化磷酸化途径(gydF4y2Ba图1 egydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基于这些结果，我们进一步用qRT-PCR检测了13个代表性代谢基因的表达水平(gydF4y2Ba图1 fgydF4y2Ba)，从与TCA循环和精氨酸生物合成相关的显著富集的KEGG通路中选择。具体来说，我们发现在TCA周期和精氨酸生物合成中所有基因的mRNA表达都下调了gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba与父节点中的相比gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba株间无显著性差异gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba这与转录组分析结果一致。这些数据表明，envz - ompr介导的生长速率下降与TCA周期和精氨酸生物合成基因下调有关。gydF4y2Ba

此外，比较代谢组学揭示了EnvZ-OmpR对小鼠代谢的调节作用gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．根据代谢组学特征，OPLS-DA评分分开gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba和ΔEnvZ/OmpR，这意味着gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba和ΔEnvZ/OmpR并不相似(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba，gydF4y2BaBgydF4y2Ba)．与vip > 1.0和gydF4y2BapgydF4y2Ba以< 0.05为显著性阈值，共有402种显著差异代谢物，其中增加253种，减少149种(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)．KEGG途径富集分析(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)表明敲除EnvZ/OmpR TCS特异性地影响碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢，这强调了转录组数据。分析转录组和代谢组富集的常见显著通路(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)．此外，通过结合转录组和代谢组分析绘制了PPI网络(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)．综上所述，这些数据表明EnvZ/OmpR TCS影响了生长速率gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba通过调节细菌的代谢过程。gydF4y2Ba

EnvZ/OmpR缺失会损害毒力gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba

老鼠在gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba实验组在攻毒后2 h出现寒战、瑟瑟发抖、毛发竖起、闭眼等临床症状，攻毒后16 h死亡，生存率为0%。老鼠在gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba组在攻毒后2 h出现临床症状，攻毒后16 h发生死亡，生存率为20%。老鼠在gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba实验组在攻毒后14 h出现临床症状，攻毒后28 h出现死亡，生存率为80%。对照组小鼠没有临床效果，存活率为100% (gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)．这些数据表明EnvZ/OmpR参与了gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba毒性。gydF4y2Ba

为了进一步证实EnvZ/OmpR调控野生型菌株毒力的机制，gydF4y2Ba23-C-23:ΔenvZ / ompRgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔenvZ / ompRgydF4y2Ba比较。如gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba，敲除EnvZ/OmpR后，生物膜形成能力显著降低，互补后恢复，表明EnvZ/OmpR有助于生物膜形成gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．此外，与gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba， EnvZ/OmpR缺失株的细菌活力下降28.2% (gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)，细菌趋化性下降43.3% (gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

此外，EnvZ/OmpR的缺失显著降低了鞭毛组装相关基因的表达水平gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba（gydF4y2Ba图3 egydF4y2Ba)，这与转录组学结果一致。当补充EnvZ/OmpR后，这些基因的表达恢复。生物膜的形成、运动性和趋化性是重要的细菌毒力因素。综上所述，这些数据表明EnvZ/OmpR通过下调细菌鞭毛组装相关基因的表达来降低细菌的运动性、趋化性和生物膜的形成，从而削弱了细菌的毒力gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba压力。gydF4y2Ba

EnvZ/OmpR缺失降低了植物的耐受力gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba

探讨EnvZ/ompR对植物抗应力能力的影响gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba，我们比较的生长特征gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23-C-23:ΔenvZ / ompR,gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔenvZ / ompRgydF4y2Ba不同应力条件下的应变。37℃孵育时，野生型和EnvZ/OmpR缺失菌的存活率无显著差异(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba)．然而，在42°C时观察到显著差异(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)．根据这一结果，我们推测存在一个激活EnvZ/OmpR TCS的临界温度信号值。生存率和耐受性较低gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba，相比之下gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba，在酸性和碱性pH值(gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba，gydF4y2BaDgydF4y2Ba)．相比之下，生存的gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba被恢复。此外，我们还发现gydF4y2Ba23-C-23:ΔenvZ / ompRgydF4y2Ba对酸性pH的耐受性低于对碱性pH的耐受性gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba， pH = 5时EnvZ/OmpR缺失菌株的存活率分别降低62.5%和42.1% (gydF4y2Ba图4 cgydF4y2Ba)和pH = 6 (gydF4y2Ba补充图3AgydF4y2Ba)，在pH = 8时，分别减少21%和27.1% (gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)和pH = 9 (gydF4y2Ba补充图3BgydF4y2Ba),分别。处理后用0.5 M HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba时，观察到较低的生存率gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba比for紧张gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba．总的来说，55%的gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba细胞被杀死，而72%和67%的gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba细胞分别存活(gydF4y2Ba图4 egydF4y2Ba)．渗透胁迫分析表明gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba对NaCl胁迫的敏感性高于gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba23-C-23: CΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba菌株和在高渗透压下不生长(gydF4y2Ba图4 fgydF4y2Ba)．与EnvZ/OmpR互补gydF4y2Ba23-C-23:ΔEnvZ / OmpRgydF4y2Ba恢复抗渗透胁迫能力。综上所述，这些结果表明EnvZ/OmpR TCS的表达促进了植物的生长gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba在各种恶劣的环境中。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

虽然粘菌素是临床治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后手段，但粘菌素耐药菌的不断出现严重威胁了抗生素治疗的疗效(gydF4y2Ba拉普兰特等人，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaHuang等，2021gydF4y2Ba；gydF4y2BaJang等人，2021gydF4y2Ba)．此外，细菌可以通过压力触发的调节系统适应不利和有害的环境(gydF4y2BaYin等，2021gydF4y2Ba；gydF4y2Ba达万和安，2022年gydF4y2Ba)，如TCS等，增加了致病菌防治的难度。大量研究已经确定EnvZ/OmpR是细菌在各种恶劣环境下生存和发育的一个因素(gydF4y2BaChakraborty和Kenney, 2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaGerken等人，2020年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba昆克尔等人，2020年gydF4y2Ba)．我们之前的研究证实EnvZ/OmpR TCS与此密切相关gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba对粘菌素的抗药性(gydF4y2BaLiu等，2021agydF4y2Ba)．在本研究中，我们发现ΔEnvZ/OmpR显著降低了粘菌素抗性的生长速度、毒力和应激反应gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba，表明EnvZ/OmpR TCS不仅参与了gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba对粘菌素的抗性，还能调节其生长、毒性和耐受力。这些结果值得注意，因为EnvZ/OmpR TCS可能是预防、控制和治疗粘菌素耐药的重要靶点gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

首先，我们观察到EnvZ/OmpR的缺失显著降低了gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba即使在无压力条件下，这一结果也与以往的报道一致gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba（gydF4y2Ba大岛渚等，2002年gydF4y2Ba)，但与gydF4y2Ba美国oneidensisgydF4y2Ba（gydF4y2Ba袁等，2011gydF4y2Ba)，这表明EnvZ/OmpR TCS在不同细菌种中的功能并不总是相同的。EnvZ/OmpR TCS作为全球监管机构，可以直接和/或间接参与其他重要的与增长相关的途径。为了进一步了解EnvZ/OmpR TCS的调控作用，我们比较了ΔEnvZ/OmpR突变株和野生株的转录组和代谢组学特征。我们确定EnvZ/OmpR在gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba细胞严重破坏了几个重要的代谢途径，特别是TCA循环和精氨酸代谢。TCA循环和精氨酸生物合成是重要的碳和能量代谢途径，是细菌生存的主要能量获取来源。qRT-PCR分析进一步证实了这一观察结果，在ΔEnvZ/OmpR中，参与这些代谢过程的基因表达水平显著降低。这些数据表明EnvZ/OmpR在gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba通过下调主要代谢途径中的基因来限制其营养吸收，从而减少能量可用性，导致生长缓慢。虽然结果很有趣，但我们仍然没有阐明EnvZ/OmpR调节细菌代谢的机制。为了探索EnvZ/OmpR调控细菌代谢的机制，有必要构建代谢基因的缺失突变体并检测其相关性，这是我们下一步工作的重点。gydF4y2Ba

在本研究中，ΔEnvZ/OmpR菌株在小鼠中表现出较长的致死时间和较低的致死率，提示EnvZ/OmpR缺失削弱了病毒的毒力gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．研究表明，运动性和趋化性是许多病原体毒力的重要特征(gydF4y2Ba托马斯,2012gydF4y2Ba)．与补充菌株相比，ΔEnvZ/OmpR的细菌运动性和趋化性显著降低。这可能是因为EnvZ/OmpR缺失下调了鞭毛组装蛋白基因。已证明鞭毛具有运动功能，并常与大多数细菌病原体的毒力有关(gydF4y2BaLuo等，2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba朱等，2019gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2021gydF4y2Ba)．我们的结果表明，EnvZ/OmpR通过控制鞭毛组装基因的表达介导细胞活力和毒力。此外，先前的研究表明，生长最快的细胞比生长较慢的细胞具有更强的毒性，因为它们可以迅速达到宿主的致病浓度(gydF4y2Ba马什等，1994年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba蒂普顿和拉瑟，2017年gydF4y2Ba)．细菌通常利用代谢信号来调节其代谢和毒力功能。因此，我们推测EnvZ/OmpR缺失导致的生长减慢也可能是致病力降低的原因gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

在感染期间,gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba菌株通过伤口或胃肠道侵入血液循环。因此，它们必须适应极端和快速变化的环境条件，如高温、极端pH值、渗透压和氧化应激。我们对ΔEnvZ/OmpR突变体在各种胁迫条件下的生长特性的研究结果证实，ΔEnvZ/OmpR突变体在高温、低pH值、高pH值、高渗透压和氧化应激等极端胁迫条件下的生存能力明显不足gydF4y2Ba23-C-23gydF4y2Ba．ΔEnvZ/OmpR突变株抗应力能力下降可能是由于EnvZ/OmpR TCS缺失所致gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba这削弱了对复杂环境变化的接收、传输和反应。此外，生物膜的形成被认为是细菌在压力环境中生存的一种常见机制(gydF4y2BaGao等人，2019gydF4y2Ba；gydF4y2BaMasmoudi等人，2019年gydF4y2Ba)．我们证实EnvZ/OmpR的缺失减少了生物膜的形成gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba这表明EnvZ/OmpR TCS调节生物膜的形成以响应环境变化。其他研究表明，沉默或敲除EnvZ/OmpR TCS可减少生物膜的形成(gydF4y2Ba林等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaShi等，2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang et al.， 2020agydF4y2Ba)．鉴于ΔEnvZ/OmpR突变株对不同环境胁迫的耐受性减弱，该突变株细胞在宿主中存活的可能性很低，这可能是致病力减弱的主要原因gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．gydF4y2Ba

综上所述，在本研究中，我们确认EnvZ/OmpR TCS有助于gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba细胞生长、毒力、生物膜形成和环境应激耐受性，表明EnvZ/OmpR TCS是必不可少的gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba生存繁殖和疾病爆发因此，进一步筛选以EnvZ/OmpR TCS为靶点的抑制剂作为潜在的粘菌素辅助剂，可能是开发新型抗菌疗法预防和控制粘菌素耐药的新思路gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．然而，我们的研究未能阐明EnvZ/OmpR调节细菌代谢的机制，以及代谢变化对粘菌素耐药菌毒力和应激耐受性的影响gydF4y2Ba答:hydrophilagydF4y2Ba．因此，我们未来的工作将集中研究EnvZ/OmpR TCS的作用机制。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提供的数据集可以在在线存储库中找到。存储库/存储库的名称和存取编号可在以下网址找到:gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba， PRJNA706457和gydF4y2Bahttps://www.ebi.ac.uk/metabolights/gydF4y2Ba, MTBLS5805。gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

动物实验由湖南农业大学动物伦理委员会审核通过。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

ZS, GX, JuL和XZ设计了这项研究。GX进行主要实验并撰写手稿。YY、JiL、JY、NX四种软件协助收集、分析和解释数据。YY, JY, NX协助修改稿件。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到湖南省自然科学基金(2021JJ40234)的资助。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2022.1032969/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba