中胞外多糖的组成和大小gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜gydF4y2Ba

简介gydF4y2Ba

在自然界中，估计大多数微生物以絮凝体、污泥或膜(称为生物膜)的“连续的聚集体”形式存在(gydF4y2BaMoshynets和Spiers, 2016gydF4y2Ba；gydF4y2Ba弗莱明和乌尔茨，2019年gydF4y2Ba)．它们被定义为通常在界面处聚集或自身聚集的微生物聚集体，并被包裹在自产的水化细胞外聚合物(EPS)基质中(gydF4y2Ba弗莱明和温恩德，2010年gydF4y2Ba)．EPS由生物聚合物组成，如胞外多糖(PS)、蛋白质、糖蛋白、核酸和脂类。gydF4y2Ba

总的来说，EPS基质构建了生物膜结构的支架，并实现了表面粘附、结构和机械稳定性和内聚以及细胞的近距离接触。作为一个保护性的“生物膜细胞屋”(gydF4y2Ba弗莱明等人，2007年gydF4y2Ba)它能提高细胞对抗菌剂和其他环境压力(例如pH值或温度变化)的耐受性，以及对有机溶剂的耐受性(gydF4y2BaKoerdt等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaBenninghoff等人，2021gydF4y2Ba)．每个EPS组件都有助于矩阵的功能性和稳定性，并且每个组件都被分配到一组不同的功能。PS在生物膜基质中普遍存在。据报道，细菌PS是同源的，更常见的杂多糖，分子量约为2.0 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba到1.9 × 10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba达(gydF4y2BaMata等，2006gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba；gydF4y2Ba萨瑟兰2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba王等，2019gydF4y2Ba)．PS在中性和带电碳水化合物残基的组成上显示出高度的多样性，这些残基可以包含有机和无机取代基(gydF4y2Ba萨瑟兰2017gydF4y2Ba)．PS的多种功能包括将细胞粘附在界面上(生物膜的初始定植和长期附着)，细胞聚集，通过形成决定生物膜结构和结构的水合聚合物网络将生物膜内聚，以及保护细胞免受各种外部压力，如干燥、抗菌化合物、宿主免疫防御或原生动物捕食(gydF4y2Ba弗莱明和温恩德，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba利莫里等人，2015gydF4y2Ba)．EPS蛋白与PS蛋白有一些相同的功能，并表现出独特的特性，例如，它们的酶活性可以修饰EPS和消化细胞外大分子以获取营养物质(gydF4y2Ba弗莱明和温恩德，2010年gydF4y2Ba)．eDNA支持粘附、聚集和内聚(gydF4y2BaWhitchurch等人，2002年gydF4y2Ba)，使基因水平转移(gydF4y2Ba弗莱明,2016gydF4y2Ba)．生物膜的结构、完整性和生物学不仅取决于EPS的组成，还取决于PS、蛋白质和eDNA之间的功能相互作用，有时还与生物膜基质中的其他物质(如信号分子、多价无机离子)共同作用。功能相互作用的结果，例如，促进细胞聚集，增强EPS基质的稳定性，或保留和稳定细胞外基质酶(gydF4y2Ba弗莱明和温恩德，2010年gydF4y2Ba；gydF4y2BaTielen等，2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba萨瑟兰2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaReichhardt等人，2020年gydF4y2Ba)．功能的相互作用本质上有助于生物膜的突现特性的产生(gydF4y2Ba弗莱明等人，2016gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

关于EPS的分子组成、化学和物理性质的信息有限，大多数报道是临床相关的细菌单种生物膜(gydF4y2BaSeviour等人，2019年gydF4y2Ba)．在这里，EPS生物聚合物的多样性以及提取和分析它们的难度显示了需要克服的挑战性障碍。此外，EPS聚合物的比例及其组成都随环境条件的变化而变化。细胞在生物膜生命周期中积极修改其基质排泄的EPS，随着时间和环境条件的变化重塑其封闭环境(gydF4y2Ba弗莱明,2011gydF4y2Ba；gydF4y2BaSeviour等人，2019年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

虽然高通量蛋白质鉴定方法已经很成熟，但由于碳水化合物的高度结构多样性(gydF4y2BaSeviour等人，2019年gydF4y2Ba)．由于一个菌株可能产生不同的PS分子，因而增加了PS分析的复杂性(gydF4y2BaRyder等人，2007年gydF4y2Ba)．最初，EPS基质组成通常通过生化(主要是比色法)测定来确定，从而能够计算组分和参数及其比值(gydF4y2Ba费尔兹等人，2019年gydF4y2Ba)．对EPS成分的深入分析可能需要复杂的样品制备和大量的“足够纯的化合物”(gydF4y2BaSeviour等人，2019年gydF4y2Ba)．用于测定PS尺寸的凝胶渗透色谱/尺寸排除色谱(GPC/SEC) (gydF4y2Ba西蒙等人，2009年gydF4y2Ba；gydF4y2BaRas et al.， 2011gydF4y2Ba)。测定成分需要将PS裂解成单体，这通常是通过酸水解来完成的。已发表的方法有许多，例如高效液相色谱法(HPLC) (gydF4y2BaQamar等人，2021年gydF4y2Ba)、高效阴离子交换色谱法(gydF4y2BaZhang等，2019gydF4y2Ba)、毛细管电泳(CE) (gydF4y2BaGao等，2010gydF4y2Ba)和衍生化后的GC (gydF4y2BaParra-Riofrío等，2020gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与细菌生物膜相比，关于古菌生物膜的形成、调控、EPS合成以及组成的信息要少得多。古生菌在自然界中无处不在，据报道以形成生物膜为主要生活方式(gydF4y2Bavan Wolferen等人，2018gydF4y2Ba)．迄今为止，大多数可培养的古菌种都是嗜极生物，能够适应极端的环境条件，如极端的温度、pH值、盐或其组合。产甲烷古菌的聚集物，gydF4y2BaHalobacteriumgydF4y2Ba，gydF4y2BaHaloferaxgydF4y2Ba和Sulfolobales的成员显示了研究得最好的古细菌生物膜(gydF4y2Bavan Wolferen等人，2018gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba适应高温(75-80°C)和低pH值(pH值2-3)，并形成复杂、密集的地毯状生物膜，具有塔状结构(gydF4y2BaKoerdt等人，2010gydF4y2Ba)．的细胞外蛋白质组gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaDSM639生物膜被证明包含多种酶类，包括蛋白酶、脂肪酶、酯酶、磷酸酶和葡萄糖苷酶(gydF4y2BaJachlewski等人，2015gydF4y2Ba)．相反，关于。的资料有限gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS.用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞外碳水化合物(gydF4y2BaKoerdt等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaBenninghoff等人，2021gydF4y2Ba)．在这里，荧光团标记的凝集素与PS结构的相互作用表明存在葡萄糖和/或甘露糖，以及少量的半乳糖和/或gydF4y2BaNgydF4y2Ba-acetyl-D-galactosamine残留。然而，完整和精确的单体组成和尺寸gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba迄今为止，还没有使用化学分析技术对PS进行研究。gydF4y2Ba

这项研究填补了在gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaEPS基质组成，特别关注排泄PS的大小以及其组成单糖的身份，作为研究古菌生物膜发育和完整性的PS功能的基础。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

应变和生长条件gydF4y2Ba

硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2BaMW001用于生成生物膜。该菌株是一种缺失突变体gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaDSM639，缺失322 bpgydF4y2Ba火葬用的gydF4y2Ba（gydF4y2Ba瓦格纳等人，2012年gydF4y2Ba)，使遗传选择和工程通过尿嘧啶缺陷。在Brock基础培养基中进行有氧培养(gydF4y2Ba布洛克等人，1972年gydF4y2Ba)，并辅以0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ban - z -胺(NZA;酪蛋白酶解n - z -胺gydF4y2Ba^®gydF4y2BaAS, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)， 10 μg/mL尿嘧啶(min. 99%， Sigma-Aldrich)和不同的附加生长底物在76°C和pH 3.0(调整50% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)硫酸):(i) 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba(+)-葡萄糖(p.a.， ACS, Carl Roth，卡尔斯鲁厄，德国)，(ii) 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba-木糖(最低99%，Carl Roth)，和(iii) 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba(+)-麦芽糖(生化级，Gerbu，海德堡，德国)。在600 nm处通过浊度测量监测细胞生长。gydF4y2Ba

微量平板滴定法gydF4y2Ba

评价生物膜的形成gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba细胞依赖于不同的生长基质，在24孔微量滴定板(MTP)中生长(Cell+，平底，聚苯乙烯，Sarstedt, Nümbrecht，德国)。每个孔充满光密度为600nm (OD)的2ml培养液gydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba})为0.01。用铝箔(铝密封胶带，可穿透，Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)密封板，以限制介质蒸发。为了保证氧气供应，每口井都要用无菌针刺穿铝箔一次。在76°C静态条件下培养1-5天。孵育后，用一组MTP测定总浊度(OD)gydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba})大量混合培养后生物膜和浮游细胞的价值(生物光度计plus, Eppendorf，汉堡，德国)。用另一组MTP测量ODgydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba}仅浮游细胞值。每个孔中剩余的生物膜生物量用结晶紫(CV)染色定量。简单地说，用Brock培养基(pH值3.0)洗井一次以去除浮游细胞。然后，取2.5 mL 0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)分别加入结晶紫溶液，室温孵育30分钟，用2.5 mL dH洗涤5次gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO.风干后，每孔充入2 mL 95% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)乙醇，在室温下孵育30分钟，使染料从生物膜中释放到溶液中。在595 nm处测定晶紫的吸光度(生物光度计+，Eppendorf)。以培养基样品为阴性对照，用培养基对照的CV值减去gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。生物膜与浮游细胞的比值由晶体紫的吸光度(ODgydF4y2Ba_{595gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba})通过浮游细胞的生长(ODgydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba}值)(gydF4y2BaKoerdt等人，2010gydF4y2Ba)．所有实验均为四重复。gydF4y2Ba

细胞总数的测定gydF4y2Ba

测定…的细胞总数gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001培养和细胞悬液与细胞总数与OD的相关性gydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba}使用改进的纽鲍尔计数室(0.0025 mmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba， 0.020毫米深度，Brand, Wertheim，德国)相衬显微镜(徕卡DMLS台架显微镜，徕卡，Wetzlar，德国)。gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001液体培养基在pH为3.0的Brock培养基中培养，添加0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) nza, 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖，10 μg/mL尿嘧啶，75°C, 180 rpm。用70%稀释10- 40倍的培养液(gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)无菌甘油，以便在显微镜下可靠地计数细胞。对于每种稀释，计算六个不同方格中的细胞数量。细胞计数和相应的ODgydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba}数值被绘制出来。gydF4y2Ba

一代的gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜:膜过滤和培养gydF4y2Ba

生成gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜，细胞在含0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) NZA、10 μg/mL尿嘧啶和可选0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba葡萄糖,gydF4y2BaDgydF4y2Ba-木糖，或麦芽糖，pH 3.0, 180转，75°C。中指数生长期细胞(ODgydF4y2Ba_{600gydF4y2Ba纳米gydF4y2Ba}约。0.6 ~ 0.8)用Brock培养基稀释，总细胞数为5.45 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba细胞/毫升。十一毫升的这种培养稀释过滤通过过滤膜组成的不同材料(总结在gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)使用不锈钢过滤系统(Sartorius AG, Goettingen, Germany)连接到真空泵(Liquiport, KNF Neuberger, Trenton, NJ, USA)。最后，用亲水性聚四氟乙烯(PTFE)膜(聚四氟乙烯聚合物膜与高密度聚乙烯支架结合，Omnipore膜，孔径0.45 μm, Ref.no. JHWP04700, merke - millipore, Darmstadt, Germany)获得了最高的生物膜产量，并进一步用作生物膜培养的标准膜。过滤后，将膜放置在培养皿(92 mm × 16 mm，聚苯乙烯，无凸轮，Sarstedt)中30 mL液体Brock培养基表面或初步实验中固化的Brock培养基板上(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba；0.6% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)结冷胶，塞尔瓦电泳，海德堡，德国)补充了上述不同的糖。培养皿在76°C静态孵育4天。膜表面形成生物膜。为了进一步的EPS/PS提取和分析，收集了来自10个膜的生物膜块。RP-LC-MS和SEC分析的阴性对照是通过过滤培养基和随后的培养产生的。gydF4y2Ba

细胞外聚合物质的分离gydF4y2Ba

培养后，使用细胞刮板(无细胞毒性，无热原性，无菌，叶片宽度:1.70 cm，叶片材料:热塑性弹性体，Sarstedt)从膜上收获生物膜。EPS提取采用阳离子交换树脂(CER, DowexgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba马拉松gydF4y2Ba^®gydF4y2BaC钠型，Sigma-Aldrich;根据gydF4y2BaJachlewski等人，2015gydF4y2Ba)．简单地说，生物膜细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中(10 mg生物膜湿重/mL缓冲液;2 mM NagydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba× 12小时gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba哦，4毫米没有gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Bax 1 HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 9 mM NaCl, 1 mM KCl, pH 7.0)。10毫升生物膜悬浮液用2克水合CER在震动条件下处理20分钟。离心和无菌过滤上清液(聚偏氟乙烯(PVDF)过滤器Rotilabo，孔径0.22 μm, Carl Roth)得到总细胞外物质(TEM)的分数，其中含有无细胞的低分子量和高分子量化合物。为了获得高分子量化合物(EPS)的分数，TEM样品使用分子量截止值(MWCO)为3.5 kDa的膜管对milliq水进行透析(Spectra/Por3，标准RC管透析膜，ø11.5 mm, Spectrum Laboratories, Waltham, MA, USA) (gydF4y2BaJachlewski等人，2015gydF4y2Ba)．作为RP-LC-MS和SEC分析的阴性对照，使用了来自膜过滤的培养基样品(见“生成gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜:膜过滤和培养”)。尽管没有生物膜，但按照生物膜样品所述的方案进行EPS分离。gydF4y2Ba

EPS组分的量化gydF4y2Ba

碳水化合物和蛋白质在生物膜悬浮液、透射电镜和EPS样品中定量gydF4y2BaJachlewski等人(2015)gydF4y2Ba．蛋白质定量采用改良的Lowry法(gydF4y2Ba彼得森,1977gydF4y2Ba)以牛血清白蛋白为标准(Serva电泳;刻度范围为0 ~ 100 μg/mL) (gydF4y2BaWingender等人，2001年gydF4y2Ba)．碳水化合物采用苯酚/硫酸法(gydF4y2Ba杜布瓦等人，1956年gydF4y2Ba),gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖为标准(p.a.， ACS, Carl Roth;刻度范围0 ~ 200 μg/mL)。使用Qubit™dsDNA HS检测试剂盒和Qubit™3荧光仪(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)对eDNA进行定量。gydF4y2Ba

定位板gydF4y2Ba

生物膜在膜过滤器上生长4天，温度为76℃。然后，使用细胞刮板(Sarstedt)从过滤器中收集生物膜，并如“细胞外聚合物质的分离”一节所述，重新悬浮在磷酸盐缓冲液中。生物膜悬浮液在10倍稀释系列(10gydF4y2Ba^1gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba)使用pH 5.0 ~ 5.5的布洛克介质。在含0.6% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba结冷胶(Gelzan, Sigma-Aldrich)， 0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) nza, 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖和10 μg/mL尿嘧啶。76℃孵育5天。可培养性由相机记录。gydF4y2Ba

胞外多糖的酸水解gydF4y2Ba

对水解方法进行了改进gydF4y2Ba德·斯瓦夫等人(2001)gydF4y2Ba．水解前，将1 mL提取的EPS溶液在真空离心机(Concentrator Plus, Eppendorf)中在45°C的真空下蒸发至干燥。干燥后的EPS溶于150 μL的2 M三氟乙酸(TFA) (HPLC级，AppliChem)中，在95°C的加热柜中培养3小时。然后，使用平行蒸发浓缩器(振动器:Syncore;泵:Vac V-500;控制器:真空控制器V-800;Büchi Labortechnik，埃森，德国)50°C, 100毫巴和200 rpm。中和和洗涤用1 M NH 100 μLgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba加入OH溶液(Suprapur, Merck)，旋涡10秒后，如上所述蒸发至干燥。最后，将样品溶于500 μL超纯水中，涡旋10 s。未直接分析的样品保存在-20°C，直到进一步使用。gydF4y2Ba

聚糖标记和荧光辅助碳水化合物电泳gydF4y2Ba

聚糖通过还原胺化反应在其还原端被标记(gydF4y2BaRuhaak等人，2010gydF4y2Ba)使用2-氨基萘三磺酸(ANTS;Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)。25 mM ANTS / milliq水/醋酸溶液(17:3 (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba）;99.8-100%， Bernd Kraft，杜伊斯堡，德国)和1 M氰化硼氢化钠(Sigma-Aldrich)在二甲基亚砜(DMSO;99.7%， Acros Organics, NJ, USA)。作为聚糖标准0.15% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba(+)-葡萄糖(p.a.， ACS, Carl Roth)， 0.15% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba(+)-麦芽糖(生化级，Gerbu)和20% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)糊精(纯，卡尔罗斯)溶液。EPS和酸水解EPS样品浓缩30倍(SpeedVac, Concentrator Plus, Eppendorf)。将25微升样品/聚糖标准溶液或milliq水(阴性对照)与90 μL 25mm ANTS溶液和100 μL 1m氰化硼氢化钠混合。将反应混合物旋涡化，在37°C的黑暗中孵育过夜。使用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)显示ants标记的聚糖。30%的FACE凝胶使用Rotiphorese丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液40 (37,5:1;卡尔罗斯)，10x三乙酸- edta缓冲液，10% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)过氧二硫酸铵(卡尔罗斯)，TEMED(卡尔罗斯)，和dHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf)在60℃下去除标记反应混合物中的O. DMSO。用milliq水调整样品体积至100 μL，然后是10 μL标记样品，90 μL 50% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)甘油溶液混合。每个样品5微升用于FACE。电泳(Mini-PROTEAN Tetra cell系统，Bio-Rad)在TAE缓冲液中施加300 V恒定电压30分钟。以ANTS的负电荷为基础，通过电泳将标记的聚糖按照分子大小进行分离。使用分子成像仪观察蚂蚁介导的紫外线吸收gydF4y2Ba^®gydF4y2BaGel Doc™XR系统(Bio-Rad)。gydF4y2Ba

单糖的衍生化gydF4y2Ba

在进行液相色谱分析之前，将参考文献和水解PS样品中的单糖用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生。衍生化方法是对前人报道的衍生化方法进行了改进gydF4y2BaHonda等人(1989)gydF4y2Ba而且gydF4y2BaRühmann et al. (2015)gydF4y2Ba．0.1 M PMP溶液(≥99%，Sigma-Aldrich)甲醇(LC-MS级，VWR)和0.4%氢氧化铵(Suprapur, Merck)作为衍生化剂，以2:1的体积比混合。取25微升样品与75 μL衍生剂混合，268 ×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba室温下2分钟(MiniSpin Plus, Eppendorf)。然后在加热柜中70°C孵育100 min。然后加入25 μL 0.5 M醋酸(冰醋酸，VWR)和875 μL超纯水。每个样品过滤(孔径0.2 μM，纤维素，cs - chromatography Service, Langerwehe, Germany)并转移到LC小瓶中。未直接分析的样品保存在-20°C，直到进一步使用。有关详细信息，请参阅gydF4y2Ba梅耶等人(2022)gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

单糖组成分析gydF4y2Ba

EPS中单糖组成的分析gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba在多反应监测(MRM)模式下，使用反相液相色谱(RP-LC)耦合三重四极杆(TQ)质谱(MS)对生物膜进行了研究。安捷伦1290 Infinity II LC系统与安捷伦三重四极质谱仪耦合。LC/TQ系统包括一个1290高速泵(G7120A，安捷伦，加州，美国)，一个1290 Vialsampler (G7167B，安捷伦)，一个1290多柱恒温器(MCT G7116B，安捷伦)和一个LC/TQ (G6470B，安捷伦)。采用Kinetex C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 μm核壳颗粒)(Phenomenex, Torrance, USA)色谱柱，50℃分离。流动相含有5mm醋酸铵缓冲液，pH 5.6 (LiChropur LC-MS, Merck)， 15% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba乙腈(流动相A)和纯乙腈(流动相B) (LC-MS级，VWR)。优化后的梯度时间为15 min，流速为0.5 mL/min。梯度从0% B开始，2 min到1% B, 5 min增加到5% B，保持2 min;在1分钟内增加到18% B，在0.3分钟内进一步增加到40% B，并保持2分钟。在下一次注入之前，柱在初始条件下平衡2.7分钟。gydF4y2Ba

质谱使用电喷雾电离源(ESI)在正离子模式下进行，切断2.5分钟以去除早期洗脱过量的PMP。利用氮气作为护套气、干燥气和碰撞气。护套和干燥气体流速分别设置为8和6 L/min，温度为325℃。雾化器设置为40 psi，毛细管电压和喷嘴电压分别设置为4000和500 V。破碎器和细胞加速电压(CAV)分别设置为165和9 V。在[M-OH + 2PMP]过渡的MRM中进行MS/MS采集方式gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba到[PMP + H]gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在每个单糖的最佳碰撞能量(20和30 V)下，使用100 ms的停留时间。LC和MS系统由Agilent Mass Hunter Workstation Data Acquisition (Version C.01.00)软件控制，数据评价使用Agilent Mass Hunter定性分析Navigator (Version B.08.00)进行。制备了15个可分离单糖的混合物，并通过分析该混合物在15个校准水平下的稀释度(每个单糖为100、80、60、40、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02和0.01 μmol/L)来确定检测限(LOD)和定量(LOQ)。RP-LC-MS法的LOD最小为3×， LOQ最小为9×信噪比。分离得到的单糖的lod和loq(以μg/L为单位)，测定系数(rgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，保留时间(rt)和衍生物[M-OH + 2PMP]的质量gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba．采用RP-LC法对EPS样品进行三次块分析。在这些块之间，注射一个空白，此外，在每次注射之前，注射针要彻底清洗，以避免来自不同样品的分析物的携带和交叉污染。为了纠正EPS样品中潜在的污染影响和防止单体高估，阴性对照样品进行水解和衍生化处理并进行分析。对阴性对照中检测到的单糖进行定量，并从真实生物膜EPS样品的定量结果中减去，以排除非原产单糖的假阳性分配gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。gydF4y2Ba

RNaseA, DNaseI，蛋白酶K处理TEM样品gydF4y2Ba

为了减少EPS样品中非碳水化合物分子的数量，其他EPS成分，即细胞外核酸和蛋白质，被消化。TEM分数gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba用RNaseA处理MW001生物膜以消化细胞外RNA (eRNA)。10 μg/mL RNaseA (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany;将10 mg/mL的原液加入10 mM TrisHCl, 15 mM NaCl, pH 7.5)加入TEM样品中，在37°C下孵育过夜。随后进行进一步的酶处理或对RNaseA处理过的TEM样品进行透析，以生成RNaseA处理后的EPS分子(MWCO 3.5 kDa或12-14 kDa;光谱实验室)。用DNaseI处理消化TEM馏分中的eDNAgydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜。图中，10 μg/mL DNaseI (AppliChem, Darmstadt, Germany;原液10mg /mL, 20mm TrisHCl, 1mm MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 50% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)甘油，pH值7.5)和10 mM MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入TEM样品，37°C孵育1 h。为了去除共分离的(可能是糖基化的)EPS蛋白以及RNaseA和DNaseI，用蛋白酶K处理TEM样品。20 mg/mL)和1 mM氯化钙gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba的TEM馏分中gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。37°C孵育过夜。用3.5 kDa的MWCO对经酶处理的TEM样品进行milliq水透析。gydF4y2Ba

EPS蛋白的SDS-PAGE分析gydF4y2Ba

通过SDS-PAGE对EPS组分进行分析，以实现EPS蛋白的可视化。用三氯乙酸(TCA)沉淀处理和不加蛋白酶K处理的样品浓缩20倍。一个体积为20% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) ReagentPlusgydF4y2Ba^®gydF4y2Ba， 99%， Sigma-Aldrich)加入两体积样品，在冰上孵育20分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba， 4°C, 30 min)，弃上清液，满体积80% (gydF4y2Bav / vgydF4y2Ba)冰冷丙酮(分析试剂级，Fisher Chemical, Fisher Scientific)两次，风干30分钟，再悬浮在50 mM TrisHCl缓冲液(pH 8.0)中，得到20倍浓缩的蛋白质样品。将两微克EPS蛋白装入12%的SDS-PAGE凝胶中。电泳后，根据制造商说明使用银染色(Pierce silver Stain Kit, Thermo Fisher Scientific)观察EPS蛋白。使用分子成像仪进行凝胶记录gydF4y2Ba^®gydF4y2BaGel Doc™XR系统(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。gydF4y2Ba

尺寸排除色谱法gydF4y2Ba

采用高效液相色谱系统对PS的分子量分布进行了尺寸排除色谱的测定。在LC模式下工作的安捷伦1260 Infinity II SFC/UHPLC混合系统耦合到安捷伦1290 Infinity II蒸发光散射检测器(ELSD)。LC-ELSD系统包括一个1260 SFC双泵(G4782A，安捷伦)，一个1260 SFC多采样器(G4767A，安捷伦)，一个1260 MCT (G7116A，安捷伦)和一个1290 ELSD (G7102A，安捷伦)。所使用的色谱柱为BioSep SEC-s2000 (300 mm × 7.8 mm, 5 μm粒径)和BioSep SEC-s4000 (300 mm × 7.8 mm, 5 μm粒径)(Phenomenex)串联，根据制造商信息，粒度分级在1到1500 kDa之间。采用超纯水和脱盐水，电阻率18.2 MΩ cm, Sartorius)在恒定的0.5 mL/min流速下进行等距洗脱。检测器参数设置为蒸发器温度80℃，雾化器温度90℃，氮气流量2.00 SLM(标准升每分钟)。通过注射10种不同大小的多糖标准进行SEC柱的校准(普鲁兰标准组350-700,000，分析标准，Supelco，圣路易斯，密苏里州，美国:342 Da, 1030 Da, 6300 Da, 9800 Da, 22,000 Da, 49400 Da, 110,000 Da, 201,000 Da, 334,000 Da, 708,000 Da)。校准结果如下:log(MW) = -0.0004xgydF4y2Ba^3.gydF4y2Ba+ 0.0427倍gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba- 1.4439x + 21.425，分子量(MW)以Da表示，保留时间x以分钟表示。LC-ELSD系统由Agilent OpenLAB cds - acquisition (Version 2.3)控制，数据评价采用Agilent OpenLAB data Analysis (Version 2.3)进行。以线性聚合物为假设条件，计算了PS中单体残基的数量。糖苷键中单个单糖的质量减少了18个原子单位(用于水释放)，并且在计算中纳入了先前在LC-MS分析中确定的PS中不同单糖的份额。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba不同生长介质中生物膜的形成gydF4y2Ba

布洛克介质(gydF4y2Ba布洛克等人，1972年gydF4y2Ba)及0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba以n - z -胺(NZA)为复合基础培养基进行生长。在培养基中加入不同的糖，在24孔板中比较不同糖对生物膜形成和数量的影响。这项研究中使用的糖，gydF4y2BaDgydF4y2Ba葡萄糖,gydF4y2BaDgydF4y2Ba-木糖或麦芽糖，都能促进gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba在先前的研究中，液体培养的生长(gydF4y2BaChoi et al.， 2013gydF4y2Ba；gydF4y2Ba瓦格纳等人，2014年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba)．培养物接种到ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}取值为0.01。在76°C的静态条件下进行1至5天的培养。每天(i)总浊度(ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba})生物膜和浮游细胞的值，(ii) ODgydF4y2Ba_{600海里gydF4y2Ba}用结晶紫染色法测定浮游细胞悬液值和生物膜量(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)．0.1%的培养(gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) NZA及0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖导致了最高数量的牢固附着gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba静态培养4天(91 h)后的生物膜团(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．补充葡萄糖后，生物膜与浮游细胞的比例最高，比其他测试培养基观察到的比例至少高1.85倍(gydF4y2Ba补充图2DgydF4y2Ba)．因此，这种培养基成分主要用于随后的生物膜培养和PS分析。gydF4y2Ba

优化gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜的培养gydF4y2Ba

到目前为止，古菌生物膜主要是在mtp、培养皿或载玻片中产生的，载玻片由不同类型的聚合物(如聚苯乙烯)或玻璃作为生物膜形成的基质(gydF4y2BaBenninghoff等人，2017gydF4y2Ba)．而生物膜的培养，例如在mtp中，是在高通量规模上分析生物膜特性的最佳方法(见“gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba在不同的生长介质中形成生物膜”)，接收大量的生物膜质量是次优的。培养gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜在结冷胶固化的布罗克介质板，报道gydF4y2BaJachlewski等人(2015)gydF4y2Ba，有可能使胶凝剂(一种阴离子杂多糖)同时分离(gydF4y2Ba杨松和林德伯格，1983年gydF4y2Ba)，在萃取EPS时。另外，合成过滤膜已被用于培养生物膜(gydF4y2BaVanysacker等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang et al.， 2014gydF4y2Ba；gydF4y2BaWaheed等人，2022年gydF4y2Ba)．我们对该方法进行了改进和优化gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001细胞悬液在膜上过滤。将膜置于液体或结冷胶固化的Brock培养基表面，76℃静态孵育4天。培养基组分被允许通过膜的孔隙，并确保膜上生物膜生长的养分可用性。比较了10种不同的市售膜的能力，以确保gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜的形成。其中包括不同化学成分的亲水和疏水圆形膜，孔径为0.2-0.45 μm (gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)．在生物膜质量产量方面表现最好的三种膜(gydF4y2Ba补充表1gydF4y2Ba)进行更详细的比较gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba在液体培养基上形成生物膜，比较每区域产生的生物膜湿重、细胞总数、可培养性和EPS馏分中的碳水化合物含量(gydF4y2Ba补充图3gydF4y2Ba)．当异质生物膜在聚碳酸酯轨道蚀刻过滤器或聚四氟乙烯过滤器上形成时，亲水性聚四氟乙烯膜(Omnipore，聚四氟乙烯聚合物膜结合到高密度聚乙烯支架上，孔径0.45 μm，直径47 mm, Merck)上形成了可重复均匀的融合生物膜。因此，该聚合物膜被用于生物膜培养。不同的接种剂，在10个范围内gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba细胞/膜，应用于膜上，并在76°C静态培养4天后比较生物膜形成情况。过滤低细胞数(10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba)培养4 d后可形成大菌落，而高细胞数(10gydF4y2Ba^7gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^8gydF4y2Ba)导致生物膜的形成，只是松散地附着在膜上(数据未显示)。接种量为10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba培养4天后，细胞/膜明显生长，并牢固附着在膜表面(gydF4y2Ba图1gydF4y2Ba)．在优化的培养方案中，6 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001细胞在亲水性聚四氟乙烯膜(Omnipore)上过滤，并在液态Brock培养基上静态漂浮(0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) nza, 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)葡萄糖，10 μg/mL尿嘧啶)，76℃保温4天。gydF4y2Ba

碳水化合物，蛋白质和eDNA在EPS分数的定量gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜gydF4y2Ba

用阳离子交换树脂(CER)从生物膜悬浮液中分离出细胞外聚合物质gydF4y2BaJachlewski等人(2015)gydF4y2Ba．经过CER处理后，无菌过滤的提取物中含有低分子量和高分子量化合物的总细胞外物质(TEM)。EPS馏分通过TEM样品透析得到，去除低分子量化合物(MWCO 3.5 kDa)。测定生物膜悬浮液(BF)中碳水化合物、蛋白质和eDNA的含量，测定4天生物膜的TEM和EPS分数(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

蛋白含量为5.0±0.5 fg/细胞gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜在膜上生长，其次是碳水化合物(2.8±0.6 fg/cell)和eDNA(0.6±0.1 fg/cell) (gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)．蛋白质:碳水化合物:eDNA的质量比约为。8:4:1在选定的生长条件下。gydF4y2Ba

外多糖单体组成分析gydF4y2Ba

以解开单糖的组成gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaEPS，样品gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜经酸水解处理。在初步实验中，比较了三氟乙酸(TFA)、硫酸或盐酸三种不同的水解方法，并确定了相应的单糖浓度(gydF4y2Ba补充图4AgydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)．使用TFA进行酸水解观察到EPS水解物中碳水化合物浓度最高。此外，该方法需要较少广泛的中和步骤和总体较低的样品制备时间，因此在整个过程中不易丢失分析物。较低浓度的个别糖，以及整体较低产量的碳水化合物部分，确定使用硫酸或盐酸。TFA水解PS的成功，意味着单糖的形成，也通过ANTS碳水化合物标记和FACE (gydF4y2Ba补充图4BgydF4y2Ba)．虽然该方法的灵敏度不允许显示PS，但TFA水解导致标记反应中还原性末端的可用性增加，并且在FACE中出现单糖信号。水解2 h后，水解EPS样品中出现了强烈的单糖信号。单糖信号强度在水解3小时后没有进一步增加(gydF4y2Ba补充图4BgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

采用反相液相色谱-质谱联用技术对单体PS成分进行分析。为了确定RP-LC方法对PS成分分析的适用性，从一组15个单糖中选出单组分标准品，这些单糖是最常见的天然单糖之一，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生，并分配每个组分的保留时间。所有单糖均可通过保留时间或质量差(gydF4y2Ba补充图5gydF4y2Ba；gydF4y2Ba补充表3gydF4y2Ba；gydF4y2Ba梅耶等，2022年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

EPS样品gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba采用TFA水解和PMP衍生化处理MW001生物膜。除了FACE分析外，LC-MS在全扫描模式下以更大的m/z(质荷比)范围确认了剩余多糖和寡糖结构的成功水解和排除。m/z = 600以上未检测到信号，因此，所有PS结构均水解为单糖(数据未显示)。对生物膜样品的水解EPS部分进行分析，检测出甘露糖(Man)、核糖(Rib)、葡萄糖胺(GlcN)、鼠李糖(Rha)、gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)和半乳糖胺(GalN) (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

EPS中检测到的主要单糖成分是甘露糖(35%)、葡萄糖(29%)和核糖(26%)，按摩尔比计算，它们占单糖成分的90%以上(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)．次要成分为葡萄糖胺(5%)和鼠李糖(3%)。半乳糖胺和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰葡萄糖胺，各占总浓度的1%左右，检测到超过定量限(LOQ)，因此可以定量。由于在酸水解过程中，乙酰化碳水化合物通常大部分是去乙酰化的，因此半乳糖胺和葡萄糖胺部分可能来自于酸水解gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰化的物种，如gydF4y2BaNgydF4y2Ba-acetylgalactosamine和gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖。脱乙酰化研究gydF4y2BaNgydF4y2Ba-acetylgalactosamine和gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰葡萄糖胺在相同的酸水解条件下用于EPS导致GalNAc脱乙酰率为100%，GlcNAc脱乙酰率为98%(数据未显示)。还发现了一种来自糖醛酸基团的未知化合物gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaEPS提取物，未包含在所开发的RP-LC-MS方法中(没有保留时间匹配)，目前无法鉴定。gydF4y2Ba

初步实验表明，基质对生长的影响gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜的形成(见“gydF4y2Ba硫化叶菌acidocaldariusgydF4y2Ba不同生长介质中生物膜的形成”;gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．因此，我们还研究了EPS和单糖组成对不同生长底物的依赖性。布洛克介质含0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) NZA作为基础培养基，并与另外添加0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba）gydF4y2BaDgydF4y2Ba葡萄糖gydF4y2BaDgydF4y2Ba-木糖或麦芽糖。我们的数据表明，EPS成分(即碳水化合物、蛋白质和eDNA)的比例取决于生长介质中不同糖的存在(gydF4y2Ba补充图6gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充表4gydF4y2Ba)．碳水化合物含量在添加gydF4y2BaDgydF4y2Ba-葡萄糖到培养基中。总的来说，在所有测试的培养条件下，生物膜EPS样品中鉴定出相同的糖单体物种，而单个成分的摩尔比根据添加的碳水化合物基质略有变化(gydF4y2Ba补充图7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba补充表5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过酶处理减少EPS馏分中的RNA, DNA和蛋白质含量gydF4y2Ba

在水解EPS样品中检测到较高比例的核糖(26%)gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)，提出了其起源的问题。一般来说，在微生物EPS基质中，除eDNA外，eRNA也被认为是相关的结构核酸(gydF4y2BaKarygianni等人，2020年gydF4y2Ba)．为了检验检测到的核糖部分是否来源于eRNA分子，TEM样品进行了RNaseA处理。随后对样品进行透析，去除低分子量核糖分子(MWCO 3.5 kDa和12-14 kDa)。在测试条件下，与未处理相比，RNaseA处理后核糖与单糖组成的比例没有变化(数据未显示)。此外，蛋白质是蛋白质的主要化合物gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaEPS矩阵(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba；gydF4y2BaJachlewski等人，2015gydF4y2Ba)．的许多细胞外蛋白质gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba例如，FlaB(菌头细丝的亚基)和s层蛋白SlaA和SlaB已知是糖基化的(由Glc组成的六糖)gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba男人。gydF4y2Ba_2gydF4y2BaGlcNAcgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加6-磺基喹啉糖)(gydF4y2BaPeyfoon等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba关等，2016gydF4y2Ba)．排除糖基化EPS蛋白对gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS分析，蛋白用蛋白酶K消化，EPS无蛋白样品用RP-LC-MS分析(gydF4y2Ba补充图8gydF4y2Ba)．蛋白酶K处理EPS样品gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba显示出与未处理样品相同的碳水化合物浓度和单糖组成。因此，糖基化EPS蛋白对应用的PS成分分析没有影响。gydF4y2Ba

胞外多糖大小的测定gydF4y2Ba

为了确定PS大小，建立了用RNaseA对EPS部分进行酶预处理，然后用bv DNaseI和蛋白酶K分别降解eRNA、eDNA和蛋白质，以避免其他聚合物的干扰。RP-LC-MS分析证实，EPS样品的酶处理没有改变单糖的特性和组成(数据未显示)。采用尺寸排除层析法(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)．作为碳水化合物尺寸测定的参考，使用了一套普鲁兰标准(gydF4y2Ba补充表6gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

从未处理样品中的EPS提取物中获得的色谱剖面显示，在大约30分钟的保留时间内出现了一个峰值，随后在31至40分钟之间出现了一个额外的强前信号(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)．酶处理样品(RNaseA, dnnasei，蛋白酶K)的色谱图显示只有一个峰，且大小分布狭窄(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba、黑色)。因此，假设未处理样品中的第二个信号是由大分子干扰(如蛋白质或eDNA)引起的似乎是合理的，并且由于对这一特定物质类别的非优化SEC方法而显示出强烈的前沿行为。因此，酶处理对于用SEC测定PS部分的大小至关重要。在保留时间29.6至31.4 min之间出现了明显的PS峰，峰尖在30.5 min，对应的洗脱体积为15.3 mL，对于示例性生物复制，分子质量为~ 44 kDagydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba．因此，这个复制的平均PS分数大约包括。287个单糖残基(关于不同鉴定的单糖的摩尔分数)。此外，另外4个生物重复gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba用SEC对MW001生物膜PS样品进行分析，发现排泄PS的大小存在生物学差异，介于~ 44 ~ ~ 92 kDa之间。290-600个单糖残基)，导致平均约71 kDa(约。460单糖;gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)。对于所有重复，在SEC色谱图中只发现了一个狭义的PS尺寸分数。gydF4y2Ba

为了排除酶预处理对PS大小测定的影响，对培养基/缓冲液对照进行等效酶处理，并通过SEC(阴性对照，阴性对照，阴性对照)分析。gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba,红色)。由于用不同的酶处理样品以去除大分子干扰，所使用的酶本身及其分子量必须考虑在内。根据制造商的信息DNAseI，蛋白酶K和RNAseA的分子量分别为30、28.9和13.7 kDa。因此，在SEC分析中发现的质量分数与所使用的酶的任何分子质量不一致;对应地，同样酶处理的阴性对照在SEC分析中没有显示任何相关信号(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba,红色)。gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在这里，我们报告了一个工作流程的发展，以产生高生物膜质量，EPS分离和化学分析单体组成和从EPS生产的胞外多糖的大小gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。gydF4y2Ba

与其他已发表的著作相比gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜，使用mtp或培养皿进行培养(gydF4y2BaKoerdt等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2BaBenninghoff等人，2017gydF4y2Ba)，建立了另一种栽培方法，以产生后续EPS分析所需的大量生物量。测试了不同的聚合物膜对形成均匀、厚的生物膜的适用性。纤维基膜不太适合生物膜的产生，聚碳酸酯膜的使用导致形成肉眼可见的大菌落，而不是均匀的生物膜。生物膜产量最高(5.25 mg/cmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)由纤维聚四氟乙烯聚合物膜生成，结合到聚乙烯载体(Omnipore膜，Merck)，产生可重复均匀的融合生物膜。与在培养皿底部培养生物膜相比，从膜中收获的生物膜湿重为48倍(0.11 mg/cm)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba根据gydF4y2BaBenninghoff等人，2021gydF4y2Ba)．与我们的研究相似，也有报道称，细菌生物膜的附着和成熟在纤维膜上增加，如PTFE膜(gydF4y2BaWaheed等人，2022年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

一般来说,gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜的数量通过向生长培养基中添加糖而增加，其中最显著的是添加葡萄糖(与NZA结合，在24孔板中培养4天后)。在葡萄糖存在的情况下，与生物膜数量的增加一致，碳水化合物的最高含量被检测到gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba在此条件下EPS分数。因此，葡萄糖的加入有利于产生大量的EPS用于进一步的PS分析。生长培养基中葡萄糖的存在与PS或EPS的产生之间的类似相关性也有报道gydF4y2BaHaloferax volcaniigydF4y2Ba生物膜(gydF4y2BaFröls等，2012gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba能源acidiphilumgydF4y2Ba生物膜(gydF4y2BaZhang et al.， 2014gydF4y2Ba)，gydF4y2BaHaloferax mediterraneigydF4y2Ba（gydF4y2BaAntón等，1988gydF4y2Ba),gydF4y2BaHaloterrigena turkmenicagydF4y2Ba（gydF4y2BaSquillaci等人，2016gydF4y2Ba),分别。除了葡萄糖作为能量来源的明显功能外，它还可以作为糖的前体gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS合成。葡萄糖既可以被激活并整合到胞外多糖(PS中葡萄糖的29%)中，也可以转化为其他PS糖单体，特别是甘露糖作为PS的主要成分gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS(35%)。虽然甘露糖是PS和蛋白质的主要成分gydF4y2BaNgydF4y2Ba糖基化(gydF4y2BaPeyfoon等人，2010gydF4y2Ba)，其合成途径尚不清楚gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

采用所述的CER提取方法对水溶性EPS进行分离gydF4y2BaJachlewski等人(2015)gydF4y2Ba．与其他提取方法相比，CER法最适合于gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜与EPS产量、对细胞活力的影响及其与后续(生物)化学分析的兼容性(gydF4y2BaJachlewski等人，2015gydF4y2Ba)．EPS分数为gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba在膜上生长的MW001生物膜以5.0±0.5 fg/细胞蛋白质为主，其次是2.8±0.6 fg/细胞的碳水化合物和0.6±0.1 fg/细胞的eDNA (0.1% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) nza, 0.2% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba) Glc介质)。除了总生物膜的形成外，EPS的组成以及蛋白质、eDNA和碳水化合物的比例也因添加不同的糖而发生变化。gydF4y2Ba

关于古菌生物膜PS组成的现有信息主要采用无损分析方法，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)结合荧光团标记的凝集素来可视化EPS基质中的生物膜结构和糖部分。综合荧光凝集素结合分析可用于gydF4y2Ba硫化叶菌metallicusgydF4y2BaDSM 6482gydF4y2Ba^TgydF4y2Ba（gydF4y2Ba张荣等，2015gydF4y2Ba),gydF4y2BaAcidianusgydF4y2Ba第29099号条例(gydF4y2Ba张荣银等，2015gydF4y2Ba)，而只有两个荧光团标记的凝集素，刀豆素A (ConA)来自gydF4y2BaCanavalia ensiformisgydF4y2Ba与Glc或Man结合，与IB4分离gydF4y2BaGriffonia simplicifoliagydF4y2Ba(GS-IB4)结合Gal或GalNAc残基，用于细胞外糖的可视化gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜(gydF4y2BaHenche等人，2012gydF4y2Ba；gydF4y2BaOrell等人，2013gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2018gydF4y2Ba；gydF4y2BaRecalde等人，2021年gydF4y2Ba)．CLSM分析可以作为某些细胞外碳水化合物存在的定性指示，但它不能提供任何关于总糖组成以及定量数量和比例的信息。此外，据报道，ConA与(1→4)-连接的β-组成的细菌海藻酸盐相互作用gydF4y2BaDgydF4y2Ba-甘露糖酸和α-gydF4y2BalgydF4y2Ba-古鲁酸盐残基(gydF4y2BaStrathmann等人，2002年gydF4y2Ba)．EPS分离所需的破坏生物膜完整性的工作流程和先进的化学分析方法有利于EPS胞外单糖组成的全面分析。gydF4y2Ba

采用酸水解-高效阴离子交换层析-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)或气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析古菌PS组成gydF4y2BaLü等，2017gydF4y2Ba；gydF4y2BaZhang等，2019gydF4y2Ba)．最近，我们进行了一项比较研究，评估不同的色谱方法，以分析生物样本中的单糖(gydF4y2Ba梅耶等，2022年gydF4y2Ba)．本研究表明，单糖衍生化后的RP-LC-MS在分离性能、灵敏度和方法标准差方面均优于超临界流体色谱(SFC)、亲水相互作用液相色谱(HILIC)和GC等方法。与HPAEC相比，RP-LC-MS在灵敏度方面的优势也很明显(gydF4y2Ba安德斯等人，2015年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSquillaci等人，2016gydF4y2Ba)．此外，RP-LC-MS提供质谱信息，允许将未知物种分配到物质类别，例如己糖、戊糖、糖醛酸。衍生化后的RP-LC已应用于细菌EPS的分析(gydF4y2BaRühmann等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2BaQamar等人，2021年gydF4y2Ba的PS组成的详细分析，在我们的研究中显示了它的优势gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜。gydF4y2Ba

与细菌相比，关于古菌PS单体组成的信息有限，目前只研究了少量的颌古菌和骨古菌的例子。关于克伦古菌的研究gydF4y2BaAcidianusgydF4y2Ba第29099号条例gydF4y2Ba美国metallicusgydF4y2BaDSM 6482gydF4y2Ba^TgydF4y2Ba（gydF4y2BaZhang等，2019gydF4y2Ba),gydF4y2Ba硫化叶菌solfataricusgydF4y2BaMT3和MT4生物膜(gydF4y2BaNicolaus等人，1993年gydF4y2Ba)．例如,gydF4y2Ba美国solfataricusgydF4y2Ba据报道，MT4从Glc/Man/GlcN/Gal中以1.2:1.0:0.18:0.13的比例生长时，以0.3% (gydF4y2Baw / vgydF4y2Ba)葡萄糖(HPAEC-PAD和TLC检测)(gydF4y2BaNicolaus等人，1993年gydF4y2Ba)．多糖的单糖比例略有不同gydF4y2Ba美国solfactariusgydF4y2BaMT3与Glc/Man/GlcN/Gal的比例为1.2:1.0:0.77:0.73。对胶体型和囊型EPS进行了区分gydF4y2BaAcidianusgydF4y2Ba第29099号规例及gydF4y2Ba美国metallicusgydF4y2BaDSM6482gydF4y2Ba^TgydF4y2Ba生物膜(gydF4y2BaZhang等，2019gydF4y2Ba)．这里，胶体EPS定义为可溶性EPS部分，存在于EDTA提取后的上清液中，而囊状EPS与微生物细胞颗粒结合，分别提取和分析。对PS (>3.5 kDa)进行酸水解和HPAEC-PAD分析，发现胶体EPS中Glc和Man(74.4和25.6%)，荚膜EPS中GalN:Gal:GlcN:Glc:Xyl:Man [0.9:2.1:0.2:49.8:2.9:44.2 (%)]gydF4y2BaAcidianusgydF4y2Basp. DSM 29099(生长于SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba)．为gydF4y2Ba美国metallicusgydF4y2BaDSM6482gydF4y2Ba^TgydF4y2BaGal:Glc:Man在胶体EPS中检出的比例为8.7:63.4:25.1(%)，在荚膜EPS中检出的比例为1.0:50.7:48.3 (%)gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba） (gydF4y2BaZhang等，2019gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在本研究中，鉴定了戊糖(Rib)、己糖(Man, Glc)、氨基糖(GalN, GlcN)、脱氧己糖(Rha)和乙酰化种(GlcNAc)gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaEPS样品采用RP-LC-MS分析(Man/Glc/Rib/GlcN/Rha/GlcNAc/GalN比例为42:35:31:6:4:1:1)。甘露糖、葡萄糖和核糖的摩尔比例最高，约占检测到的单糖的90%。鉴定出的氨基糖(GalN和GlcN)可能来源于原系gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰化的物种在PS水解过程中去乙酰化。这是一个众所周知的机制，在文献中经常被研究和讨论(gydF4y2BaEinbu等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaEinbu和Varum, 2008gydF4y2Ba；gydF4y2BaKnirel等人，2019年gydF4y2Ba)．根据我们的数据，观察GalNAc和GlcNAc的去乙酰率分别为100和98%的糖标准，我们不能排除在gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS起源于gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰化的物种。与CLSM分析比较gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜，使用荧光团标记的凝集素，通过RP-LC-MS在EPS中鉴定出几个额外的单糖。比较了不同种类的EPS单体组成，很明显，葡萄糖和甘露糖是在不同种类的EPS样品中检测到的优势单体gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001。核糖在PS样品的发生也报道了细菌EPS，包括gydF4y2BaHahella chejuensisgydF4y2Ba（gydF4y2BaLee et al.， 2001gydF4y2Ba)，细菌/古菌共培养gydF4y2BaThermotoga maritimagydF4y2Ba而且gydF4y2Ba产甲烷球菌属jannaschiigydF4y2Ba（gydF4y2Ba约翰逊等人，2005年gydF4y2Ba)以及古菌EPSgydF4y2BaHalorubrumgydF4y2Basp. TBZ112 (HPAEC-PAD) (gydF4y2Ba哈米迪等人，2019年gydF4y2Ba),gydF4y2Ba甲烷八叠球菌属mazeiigydF4y2BaDsm6300 (gc-ms) (gydF4y2Ba维加等人，1997年gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

据报道，来自细菌生物膜的PS是非常长的分子，其分子质量约为。10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba达(gydF4y2BaMata等，2006gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba；gydF4y2Ba萨瑟兰2017gydF4y2Ba；gydF4y2Ba王等，2019gydF4y2Ba)．euryarchaeal生物膜PS的分子质量也在10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-10年gydF4y2Ba^6gydF4y2BaDa，用尺寸排除色谱法(SEC)测定gydF4y2BaHalorubrumgydF4y2Basp. TBZ112 0.5 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba达(gydF4y2Ba哈米迪等人，2019年gydF4y2Ba)，gydF4y2BaThermococcus litoralisgydF4y2Ba4.1 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba达(gydF4y2BaRinker和Kelly, 1996gydF4y2Ba)，gydF4y2BaHaloferax mucosumgydF4y2Ba7.65 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2Ba-1.52 × 10gydF4y2Ba^5gydF4y2Ba达(gydF4y2BaLópez-Ortega等，2020gydF4y2Ba),gydF4y2BaHaloarcula hispanicagydF4y2Ba1.1 × 10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba达(gydF4y2BaLü等，2017gydF4y2Ba)．为gydF4y2BaHaloterrigena turkmenicagydF4y2Ba，分子量分别为80.1、20.6和3.8 × 10的3个大小组分具有显著差异gydF4y2Ba^4gydF4y2BaDa被确定为(gydF4y2BaSquillaci等人，2016gydF4y2Ba)．分子质量为一个PS，平均为7.1 × 10gydF4y2Ba^4gydF4y2BaSEC鉴定Da为齿槽菌株gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001在本研究中。该质量与报道的euryarchaeal胞外多糖大小相当。结合单体的定量测定结果，gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS由大约。平均有460个单体残基，假设为线性PS结构。为了确定可能的分支，进一步的分析，如FT-IR和NMR光谱，以及甲醇分解后的GC-MS (gydF4y2BaParolis等人，1996年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba1999gydF4y2Ba；gydF4y2Ba帕拉蒙诺夫等人，1998年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba李等，2018gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

关于胞外多糖的合成途径gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba，可能存在一种膜相关的合成、分泌和聚合机制。在这里，特别是PS大小的调节似乎是一个组织良好和可控的过程，导致分泌出明确长度的生物聚合物。先前的研究观察到lrs14样转录调控因子对gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba生物膜形成与细胞运动[古生菌生物膜调节剂1 (abfR1)] (gydF4y2BaOrell等人，2013gydF4y2Ba)．相应的蛋白(Saci_0446)被描述为生物膜转录阻遏物，控制着古菌菌柄操纵子、古菌黏附菌毛操纵子和一个附加基因簇(gydF4y2Basaci_1904-saci_1927gydF4y2Ba)，编码几种糖基转移酶和膜蛋白(gydF4y2BaOrell等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2Bavan Wolferen等人，2018gydF4y2Ba)．该基因簇可能编码参与的蛋白质gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaPS的合成和排泄。不同的糖基转移酶可能参与了PS的合成，以响应不断变化的环境条件和养分可利用性，从而导致单体比例随养分可利用性(即生长介质组成)的不同而不同。gydF4y2Ba

综上所述，本研究为EPS的组成和动力学提供了更深入的见解gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2BaMW001生物膜对能量和碳源的响应，特别关注单糖组成和PS大小。我们建立了一套培养方案gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba过滤膜上的生物膜以及PS组成分析和尺寸测定。所提出的方法为进一步研究PS在EPS基体中的作用以及PS的合成和导出奠定了基础gydF4y2Ba美国acidocaldariusgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

本研究中提出的原始贡献包含在文章/中gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba，如有任何查询，可向通讯作者查询。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

LK进行了微生物、显微、生化分析和聚糖标记实验，并进行了生物膜培养和EPS分离。LK和MM对EPS组分进行生化测定。MM进行了详细的分析分析，包括样品制备(酸水解)、RP-LC-MS和SEC。CB、JW、OS和BS获得了资金并监督了研究。LK和MM在CB, JW, OS和BS的指导下完成了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

这项工作得到了德国研究基金会(DFG, SCHM 1699/26-1 | SI 642/13-1 | WI 831/4-1;项目编号:393406057)。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

我们感谢本杰明·迈耶对这篇手稿的批判性讨论和阿斯特丽德·丹内尔对她的实验帮助。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2022.982745/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

2 dglc, 2-deoxyglucose;2-氨基萘三磺酸;Ara,阿拉伯糖;BF，生物膜悬浮液;CAV，电池加速电压;CE，毛细管电泳;CER，阳离子交换树脂;共聚焦激光扫描显微术;ConA, Concanavalin A来自gydF4y2BaCanavalia ensiformisgydF4y2Ba；CV，结晶紫;敏捷,糊精;DMSO，二甲基亚砜;一滴,2-deoxyribose;dsDNA，双链脱氧核糖核酸;eDNA，细胞外DNA;蒸发光散射检测器;EPS，细胞外聚合物质;eRNA，细胞外RNA; ESI, electrospray ionization; FACE, fluorescence-assisted carbohydrate electrophoresis; Fuc, fucose; Gal, galactose; GalA, galacturonic acid; GalN, galactosamine; GalNAc,NgydF4y2Ba-acetylgalactosamine;气相色谱;相关,葡萄糖;GlcA，葡萄糖醛酸;GlcN,葡萄糖胺;GlcNAc,gydF4y2BaNgydF4y2Ba乙酰氨基葡萄糖;GPC，凝胶渗透色谱;GS-IB4，分离素IB4gydF4y2BaGriffonia simplicifoliagydF4y2Ba；HILIC，亲水相互作用液相色谱;HPAEC，高性能阴离子交换色谱;(HP)LC，(高性能)液相色谱;LOD，检测限;LOQ，定量限;发作,麦芽糖;人,甘露糖;MRM，多重反应监测;质谱; MTP, microtiter plates; MWCO, molecular weight cut-off; m/z, mass-to-charge ratio; NMR, nuclear magnetic resonance; NZA, N-Z -amine; OD, optical density; PAD, pulsed amperometric detection; PMP, 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone; ProtK, proteinase K; PS, exopolysaccharides; PTFE, polytetrafluoroethylene; Rha, rhamnose; Rib, ribose; RP-LC, reversed-phase liquid chromatography; SDS-PAGE, sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SEC, size exclusion chromatography; SFC, supercritical fluid chromatography; TCA, trichloroacetic acid; TEM, total extracellular material; TFA, trifluoroacetic acid; TQ, triple quadrupole; Xyl, xylose.

参考文献gydF4y2Ba