在太古菌中假定存在核仁的超微结构和蛋白质组学证据

1.简介

核仁是纤维颗粒状的亚细胞结构域，是核糖体基因表达、成熟和调控的部位。核糖体生物合成包括真核生物基因表达的50%以上，并决定核仁的形成(Hernandez-Verdun 2006；Pederson 2011)．真核生物中核仁的破坏和形成(核仁发生)发生在有丝分裂期间，特别是在末期，当核仁前体(PNBs)形成，然后在称为核仁组织区(NORs)的染色体域重新启动rDNA转录时被招募。当pre-rRNA开始合成时，可见的核糖核蛋白聚集形成核仁(Jiménez-García等人，1989，1994；Dundr等人，2000年；Hernandez-Verdun 2006)．成熟核仁具有明显的、动态的、多功能的隔室。它们由rDNA、不同类型的rna和300多种蛋白质组成，这些蛋白质参与核糖体生物合成的微调，与程序性细胞死亡、代谢调节、细胞分化、应激和衰老等过程协调。安德森等人，2005年；Grummt 2013)．鉴于这种成分的复杂性，大多数物种核仁的鉴定和研究最初依赖于超微结构特征和细胞化学，诊断的首选是在超微结构水平上存在电子密集的纤维颗粒结构域，该结构域与核仁组织区(AgNOR)的高度特异性氨银染色呈阳性(斯麦塔纳,2011)．尽管在不同谱系的核仁之间存在高度的形态异质性，但这些诊断仍然有用，并已成为跨系统发育的核仁特征(希斯,1980；Thiry和Lafontaine, 2005)．因此，我们对核仁分子生理学的主要理解来自于在一小群模式生物(哺乳动物、两栖动物、酵母和植物)中进行的功能研究，在这些生物中可以获得特定的抗体和细胞周期标记(哺乳动物、两栖动物、酵母和植物)，留下了许多谱系和物种的巨大新研究领域有待探索(Islas-Morales等人，2021年)．

与此相一致，尽管核糖体基因的表达和成熟在所有活细胞中都是常见的，但到目前为止，核仁的存在仅限于真核细胞。尽管有这样的观点，一些真核核仁几十年来仍然难以捉摸。例如，原生动物的超小核仁兰伯氏贾第虫直到2008年通过经典的超微结构观察和互补的分子方法才得到证实(Jiménez-García等，2008)．没有核仁g . lambia是真核生物起源争论的核心问题，即原真核生物的起源假说(Cavalier-Smith 2002)．根据早期分支真核生物核仁的超微结构证据，目前公认真核生物最后共同祖先(LECA)中存在核仁(Jiménez-García等，2008)．

随着时间的推移，生命之树(ToL)发生了彻底的变化，确定核仁起源于何处和何时可能成为进化细胞生物学的一个新研究领域。Islas-Morales等人，2021年)．在双域ToL中，真核生物和古生菌形成单一生命域(Gribaldo等人，2010)，核仁可能在姐妹谱系之间和内部逐渐进化，而不是只在真核生物内部进化(来自LECA)。例如，最近强调的asgard -古菌是真核生物的近亲，包括许多不可培养的和新发现的古菌群，如所谓的Lokiarchaea，可能显示真核细胞特征(Spang等，2015；Liu等，2021)．此外，在阿斯加德古菌最接近的可培养亲戚，TACK古菌中，发现了大量的真核同源性在网上（盖伊和埃特玛，2011年)．据此，在TACK古菌中发现了主要核仁元素如纤原蛋白和小核仁rna的同源物(Omer等人，2000年)．例如，核仁同源物已经被研究过了在网上在美国solfataricus，一种可培养的塔克古菌。此外，当在转染的青蛙细胞中表达时，一些小的核仁rna从美国solfataricus在(真核)核仁(Omer等人，2000年)．随着酵母和人类核仁蛋白质组的可用性(安德森等人，2005年)，目前的研究支持大部分原核谱系的核仁同源物主要存在于古生菌(Staub等人，2004年)．此外，核糖核蛋白复合物的同源基因簇，如SSU过程体，也存在于古生菌中，但不存在于细菌中(冯等，2013)．然而，先前的研究提出，核仁样区隔化也可能发生在细菌的转录中大肠杆菌，基于DNA聚合酶与细菌核仁同源物NusB的共定位(Jin等，2017；马塔·马丁等，2018年)．然而，使用实验和超微结构方法在古生菌和细菌中寻找假定的核仁超微结构在现有文献中仍然未被探索。我们假设，当在纳米水平上使用组学定向显微镜时，可以发现许多关于古细菌细胞结构和进化的理解(Islas-Morales等人，2021年)．基于上述的动机，我们在齿槽古生子中寻找假定的核仁超微结构的初步证据美国solfataricus．我们选择美国solfataricus因为它是一种来自TACK古菌超门的可培养生物。我们的方法遵循超微结构检查，随后探索和整合分子数据。虽然我们的数据支持太古宙中存在核仁，但技术限制和其他方面仍有待在未来的研究中解决。

2.材料与方法

2.1.Saccharolobus solfataricus培养

按照标准程序进行栽培(罗伯逊,2007)．简单地说，就是型菌株美国solfataricusP1 DMSZ 1616摘自德国微生物和细胞培养集¹生长在80°C的培养基DSMZ88²和DSMZ182。^3.从一个两升生物反应器中，样品在透射电子显微镜(TEM)中进行处理。在log期收获细胞美国solfataricus细胞密度为> 10⁹细胞/mL，用分光光度计在600 nm处测量光密度。

2.2.显微镜

我们检查了美国solfataricus使用光学和透射电子显微镜(TEM)。在缺乏特异性抗体的情况下，我们重点研究了核仁细胞化学、形态学和细胞遗传学，如AgNOR染色阳性、纤维颗粒纳米结构域和rDNA聚类(古德普拉瑟和布鲁姆，1975年；希尔等人，1993年；Hernandez-Verdun 2006；Pederson 2011)．

2.2.1.光学显微镜

的观察美国solfataricus在Olympus BX41直立显微镜上对亮场、相位对比和暗场显微镜下的细胞进行观察，用DAPI染色法确认细胞的培养能力。为了使用光学显微镜进行AgNOR染色的视觉评估，细胞按照先前描述的方案固定并在载玻片中处理(Jimenez-Garcia 1998；安德森等人，2005年)．我们独立地重复这项技术10次，每次重复计算3000个细胞。在此之后，AgNOR染色的细胞总数是阳性的，这变得明显取决于焦平面。

2.2.2.透射电子显微镜(TEM)

进行了修改后的标准TEM样品制备美国solfataricus细胞(罗伯逊,2007；Segura-Valdez等人，2013)．将300-500 mL过滤后(Millipore 5 μm)的细胞培养物固定于2.5%戊二醛和4%多聚甲醛中1小时。固定物直接加入培养物中。中间洗涤在由DMSZ182介质盐组成的缓冲液中进行，调整到pH值4以防止渗透损伤。固定后，将细胞在2800 g下轻轻离心，并重新悬浮在1 mL过滤的1%琼脂糖中。将悬浮液倒入2毫米高的小培养皿中。用DMSZ88介质缓冲液将细胞垫固化，防止干燥。席子被切成2毫米²每块用乙醇:30%脱水;50%;70%;80%;90%;95%;3 × 100%，间隔10分钟低温。预包合在100%环氧丙烷中进行三次洗涤，每隔5分钟，环氧丙烷和Epon 611的最终混合物(1:1 v/v) 48小时，随后在纯树脂中在60°C聚合。使用UranyLess EMS染色(电子显微镜科学#22409)和柠檬酸铅在CO下进行一般对比染色₂有限条件(罗伯逊,2007)．成像使用JEOL 1010透射电子显微镜在80千瓦。

2.2.3.AgNOR银浸渍的超微结构

这种特殊的染色技术核仁组织区(NOR)是在美国solfataricus细胞根据先前描述的方案，单细胞提供优越的结果(Jimenez-Garcia 1998；Jiménez-García等，2008)．简单地说，细胞在2.5%戊二醛中双固定1小时，然后在Carnoy溶液(冰醋酸和75%乙醇，1:3 v/v)中洗涤5分钟。细胞在70%和50%的乙醇和双蒸馏水中每隔10分钟再水化一次。如第3节所述，将细胞嵌入1%的琼脂糖立方中，以防止样品丢失。AgNOR反应开始时，加入50%硝酸银溶液(用1g AgNO配制)_3.在2毫升蒸馏水中)，在热水(70°C)中孵卵10分钟，然后用冰水洗涤5次，然后加入4滴NH₄试剂溶液(4 g AgNO_3.；5 mL双蒸馏水;5毫升浓缩nhh₄OH (pH值12-13)和四滴催化剂。所使用的催化剂由3%的甲醛溶液组成，该溶液已被醋酸钠晶体中和，并用甲酸调节到pH值5-6。在这些立方体呈现出淡黄色后，他们在冰水中洗了五次。随后，我们进行了标准的EM脱水和嵌入Epon 600，如TEM部分所述。我们独立地重复此过程三次，每次重复随机采样30个细胞。我们从的平均值计算出AgNOR平均信号密度为80%n= 24±2个细胞显示阳性信号。值得注意的是，由于焦平面的原因，一些阳性细胞可能没有被我们观察到。

2.2.4.超微结构的原位核糖体16S和23S区杂交

我们进行了超微结构检查原位16S和23S rDNA基因的杂交(UISH)，因为核仁是核糖核蛋白区室。按照标准程序(Segura-Valdez等人，2013)，固定方法如下:过滤后的(Millipore 5 μm)细胞培养物300-500 mL在2.5%戊二醛和0.5%多聚甲醛的混合物中固定1小时。在一般形态下进行中间洗涤和脱水。用低氯基K4M和乙醇(1:2;1:1;2:1;v/v)和绝对树脂在−20°C下放置24小时。K4M聚合是在低温下，在紫外光源下进行的。成像使用JEOL 1010透射电子显微镜，工作功率为80千瓦。

为了制备探针，等份1.5 mL古生菌培养物在10000 g下离心10分钟，细胞球用200 μL无菌水洗涤两次，并重悬在100 μL ATL裂解缓冲液(Qiagen)中，使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)进行DNA提取。根据标准方案进行UISH (Segura-Valdez等人，2013)．引物27F和1492R (巷,1991)及189F及2490R (亨特等人，2006)用于扩增a . rRNA基因16S和23S区域美国solfataricus细胞培养，分别。扩增至rDNA扩增浓度为1 mg/mL。UISH探针是使用遵循标准协议的缺口转换混合生成的(Segura-Valdez等人，2013)．生物素dUTP的标记反应在16 μL无菌双蒸馏水中进行，水中含有1 μg等摩尔量的16S和23S扩增子rDNA和4 μL Biotin- nick Translation Mix (Sigma Aldrich)。划痕翻译混合物含有:5 ×浓缩反应缓冲液，50%甘油，DNA聚合酶1,DNase 1, dATP, dCTP, dGTP各0.25 mM, dTTP 0.17 mM，生物素- dutp 0.08 mM。短暂离心后，将混合物在15°C下孵育90分钟，并冷却至0°C。用1 μL 0.5 M EDTA (pH 8.0)终止反应，65℃加热10 min。探针的长度(200-500个核苷酸)使用带有DNA大小标记的琼脂糖凝胶进行检查。探针存储在−20℃的TE缓冲液(10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)中。杂交反应进行“后包埋”200目金网格携带部分从美国solfataricus低氯基K4M树脂。为了进行杂交，将金栅TEM切片中存在的原生DNA和杂交混合物(由12 μL探针(约170 ng/μL)、2.5 μL 20x SSC和12.5 μL甲酰胺组成)中的扩增子DNA分别在100℃的保温水中变性5 min。杂交是通过在TEM切片的网格上滴一滴杂交混合物，在37°C下孵育过夜，防止蒸发来进行的。随后，使用山羊抗生物素抗体偶联10 nm纳米金(EMS)进行免疫反应。在PBS(1:10)中孵育30分钟。在PBS和水中反复洗涤后，网格与UranyLess染色液(电子显微镜科学#22409)进行对比，并在FEI Tecnai孪生透射电子显微镜中观察，功率为80千瓦。我们独立地重复此过程三次，每次重复随机采样30个细胞。我们从平均值计算出平均杂交信号密度为82%n= 24.6±1.2个细胞显示阳性信号。值得注意的是，由于焦平面的原因，一些阳性细胞可能没有被我们观察到。

2.3.蛋白质组学

对于我们的蛋白质组学方法，我们使用了一个在体外AgNOR染色法的变体美国solfataricus蛋白质萃取物被SDS-PAGE蛋白凝胶分离(Lischwe等人，1979)．我们的策略是利用AgNOR方法用于TEM的条件和特异性。这导致SDS-PAGE蛋白凝胶中有显著对比的离散条带模式(补充图S4)与CBB染色对比(补充图S5)．我们切除了含有agnor标记肽的agnor阳性条带，并将其与MALDI-TOF测序耦合进行辅助质谱分析(谢瓦莱等人，2006年)．详细的程序如下所示。

2.3.1.SDS-PAGE凝胶AgNOR染色Saccharolobus solfataricus蛋白质的提取

SDS-PAGE凝胶AgNOR染色按既定程序进行(Lischwe等人，1979；拜斯和奥辛加，1984年；Trere 2000)．简单地说，将过滤过的(Millipore 5 μm)细胞培养物300-500 mL离心浓缩成颗粒。重悬颗粒在Laemmli缓冲液中加入含400 mM DTT (31 mg/500 μL)的4x SB，在100℃下变性3 min至终浓度为1×。然后将该溶液在90°C下孵育2分钟，并加载到10%的1-D聚丙烯酰胺凝胶上，并在~ 10-12 mA下运行。SDS-PAGE凝胶在Carnoy溶液中固定1小时，用去离子水清洗，在硼酸盐缓冲液(0.1 M Na₂S0₄0.005 M Na₂B₄0₇pH 9.2)。用50%硝酸银溶液在50°C孵育过夜。在这一步之后，带已经很明显了。凝胶放置在3%的福尔马林中，以便更清晰地对比(古德普拉瑟和布鲁姆，1975年；Lischwe等人，1979)．此方法类似于细胞学制剂中核仁染色的情况(Trere 2000)．

2.3.2.质谱制备和分析

在MALDI-TOF的准备过程中，我们遵循了辅助的质谱银分离方案和随后的凝胶消化和肽提取标准程序(Gharahdaghi等人，1999；谢瓦莱等人，2006年；舍甫琴科等，2006年)．简单地说，凝胶带被30毫米的铁氰化钾C水溶液覆盖₆N₆FeK_3.和100毫米硫代硫酸钠钠₂年代₂O_3.用等量水冲洗，直到污迹去除约6分钟后。在200mm碳酸氢铵(NH)中浸泡₄) HCO_3.20分钟(每片凝胶约0.15 mL)，再次清洗，并在- 20°C干燥保存。凝胶内蛋白质消化如下:为了提取MALDI-TOF的蛋白质部分，在10 mM的二硫苏糖醇(DTT)中，在100 mM (NH₄) HCO_3.在37°C下30分钟，然后在50 mM的碘乙酰胺(IOA)中烷基化，在100 mM (NH₄) HCO_3.1小时，然后清洗，脱水，再补水。最后，用胰蛋白酶(12.5 ng/μL)在37℃下消化16 h。然后用5%乙酸和50%乙腈(ACN, CH₃CN)提取蛋白质。提取后，多肽在0.1%的三氟乙酸TFA (CF₃COOH)，用75% ACN洗脱，并用SpeedVac完全干燥。用0.1%的FA在hplc级H中重新溶解冻干的蛋白质提取物₂0，用NanoDrop在A280处定量。在DIA/SWATH-MS分析中，将样品的浓度归一化。将指数保留时间(iRT)标准品(Biognosys, Ki30021)以3:10的比例(v/w)添加到预注射肽混合物中，加入Ultraflex III MALDI-TOF/TOF MS (Bruker)。

2.4.基因组学

为了进行基因组分析，我们编制了一份候选核仁蛋白同源物的列表美国solfataricusP1基因组用于后续与真核核仁蛋白补体的比较。

此外，我们进行了基因本体论(GO)分析，以确定富集的生物过程和分子功能普遍存在于SDS-PAGE凝胶AgNOR染色肽的MS分析中。

2.4.1.中核仁相关基因Saccharolobus solfataricus

氨基酸翻译基因的基因组美国solfataricus菌株P1 (GenBank登录号NZ_LT549890.1)使用KEGG自动注释服务器(KAAS)进行注释(Moriya等人，2007年)使用BBH(双向最佳命中)方法对具有代表性的真核生物基因集进行筛选。在分析中只考虑了与“核糖体生物发生在真核生物”(ko03008)通路相关的KEGG配位基因特征。此外，使用HMMER3 v.3.1b2 (艾迪,2011)以识别先前报道的核仁的蛋白质结构域(Staub等人，2004年)．

2.4.2.SDS-PAGE提取agnor染色蛋白的基因本体(GO)富集

用MALDI-TOF提取和分析的蛋白的肽序列与翻译的基因特征相一致美国solfataricus菌株P1基因组(GenBank登录号NZ_LT549890.1)使用BLASTp算法(补充数据)．只有100%匹配的命中才被允许(没有不匹配)。所有蛋白质特征都在UniProtKB/SwissProt数据库(UniProt财团，2018年)并且只命中e值<10⁻³被认为是。GO注释是通过解析GOA基因关联文件从UniProt id中获得的。ftp.ebi.ac.uk /酒吧/数据库/ /果阿/ UNIPROT /)．使用R包TopGO v.2.42.0中实现的“weight01”方法对沉淀蛋白进行基因本体(GO)富集分析(Alexa和Rahnenfuhrer, 2022年)．结果p使用错误发现率(FDR)方法(Benjamini和Hochberg, 1995)，以及调整后的GO类别p（问-value)低于0.05为富集。

3.结果

通过光学显微镜，我们始终注意到在所有被检查的细胞中有强烈的AgNOR浸渍(图1 a1, A2)．在普通透射电镜下，我们经常观察到电子密集的细胞内体，具有突出的纤维颗粒形态美国solfataricus低、高倍率下的细胞(图1 b1、B2，2；补充图S1、S2)，与超小核仁高度相似g . lamblia（Jiménez-García等，2008)．此外，我们观察到一个明显的，具体的，强烈的AgNOR银浸渍美国solfataricus用电子显微镜观察细胞(图1 c1, C2)．这一结果是相关的，因为氨银浸渍核仁组织区(AgNOR)是一种与NOR相关的亲银蛋白的特定技术，并证明了NORs、核仁前体和核仁在超微结构水平上的存在(古德普拉瑟和布鲁姆，1975年；Jiménez-García等，1994；Pederson 2011；Grummt 2013)．因此，我们首次提供了纤维颗粒结构和AgNOR信号在古生菌中作为离散域存在的证据。

超微结构的原位在变性条件下，16S和23S rDNA的杂交(UISH)显示了预期的rDNA和rRNA的定位。核糖体基因及其转录本的分布美国solfataricus可能对应于单个和离散的亚细胞簇，其底层有电子密集区域(图1 d1, D2)．值得注意的是，对于非变性条件下的UISH (补充图S3)，预计只能检测到rRNA的信号。尽管信号分布更广，但离散的亚细胞簇的集中是明显的，与UISH下变性条件下的观察相对应。虽然不能断言rDNA和rRNA的共定位，但在变性和非变性条件下uish的观察结果是互补的，并表明核糖体转录本可能与亚细胞域在空间上相关。根据核仁发生学，虽然NORs与rDNA严格相关，但核仁前体(PNBs)和其他核仁起源的离散元件不一定包含核糖体基因(Jiménez-García等人，1989，1994)．从这个意义上说，我们UISH的观察结果与rDNA的单一位点的概念是一致的美国solfataricus基因组和补充观察到多个AgNOR银浸渍与离散的亚细胞结构域有显著的对比。根据以上，我们得出结论美国solfataricusagnor敏感蛋白积聚在特定的位置，并与真核NORs和核仁具有相似的组成。

除了基于agnor的染色，重要的是考虑使用一般对比技术而没有特定染色的超微结构观察的一致性。图2一个显示电子密集的亚细胞结构域美国solfataricus．图2 b，C显示亚细胞结构域核仁样纤维颗粒形态的高倍放大和细节美国solfataricus，类似于典型的核仁超微结构。尽管整个ToL的核仁形态高度异质，特别是在早期分支原生生物中，我们的观察结果与核仁具有两个主要形态组成部分一致:a帕尔斯fibrosa和一个帕尔斯颗粒，根据先前的研究，这是公认的羊膜外核仁的标准(Thiry和Lafontaine, 2005)．

为了探索新发现的核仁样结构下的分子元素，我们进行了染色美国solfataricus使用AgNOR方法提取蛋白质，然后在SDS-PAGE蛋白凝胶上分离它们。agnor阳性条带被切除并测序，得到1618个不同的多肽，其中1527个与376个蛋白质完全匹配(100%相似)美国solfataricusP1基因组，以下简称“沉淀蛋白”(补充表S1、S2)．这些蛋白包括核仁蛋白，如:NOP1(纤原蛋白)、NOP5、L7Ae、L30Ae、L31Ae和PUA(伪尿苷合成酶)，它们都参与核糖体RNA (rRNA)的成熟和小核仁RNA (snoRNA)的代谢。我们还发现了RNA聚合酶的证据，它是通过启动rRNA转录形成核仁组织者所必需的。基因本体论(GO)分析证实，沉淀蛋白中“翻译”、“核糖体结构成分”、“rRNA结合”和“未折叠蛋白结合”是显著富集的过程(FDR≤0.05，补充表S3)．这表明，假定的核仁样室中的蛋白质具有与核糖体表达和RNA结合相关的功能，并有可能形成大分子核糖核蛋白，这些大分子核糖核蛋白是非膜性细胞器的核心成分，如核仁和Cajal体(Dundr等人，2000年；Pederson 2011)．值得注意的是，正如真核核仁所知，并非所有核仁蛋白都是亲银的，因此对AgNOR染色敏感(Sirri等人，2000年)．此外，并非所有真核生物的核仁蛋白在古生菌中都有同源物。因此，一些已知的来自真核生物的agnor阳性蛋白，如核色素素和核仁素，如预期的那样，在我们的蛋白质组学分析中不存在(Lischwe等人，1979；埃尔南德斯-凡尔登等人，1980)．

为了获得古生菌核仁元素的全面视图，我们使用基因组学分析来补充基于AgNOR染色的识别蛋白。使用基于对齐的方法，我们确定了18个与KEGG途径“核糖体生物发生”相关的基因(补充表S4)和另外41个基因(补充表S5)通过先前报道的核仁相关结构域(Staub等人，2004年)．所鉴定的59个基因同源体编码36个不同的蛋白质。我们认为这36种蛋白质构成了核仁元件的“最小集合”(补充表S6)．其中10个蛋白被agnor染色的蛋白质组学测序证实(见上文)。

总之，各种证据证实了核仁元素的存在美国solfataricus这两个原位而且在网上（补充图S6)．首先，光学和透射电镜支持了折射、电子致密和agnor阳性的核仁样畴的存在。这一观察结果与基因组结构、16S/23S rDNA序列的非随机分布和累积rRNA的超微结构相一致原位杂交(值得注意的是，变性条件下的UISH可以检测rDNA和rRNA)。此外，agnor染色蛋白凝胶带的肽测序支持了这样一种观点，即在假定的核仁样区室中银色染色的蛋白质与核仁归属的结构和功能相关，如rna -蛋白质相互作用和rrna前成熟。此外，基因组学分析总结了我们对核仁元素的认识美国solfataricus通过将银染蛋白与核仁同源物核心集连接，包括未通过agnor肽测序的非亲银核仁蛋白。

4.讨论

我们全面的数据使我们能够概念化一个假定的核糖体生物发生途径美国solfataricus．这是一个初步和补充的建议，也应根据关于古生菌核糖体生物发生进化的广泛工作进行分析(Ebersberger等人，2014；Birikmen等人，2021年)．以KEEG通路ko03008(“真核生物中的核糖体生物发生”)为基础，并将其应用于古细菌细胞模型，我们假设所识别的蛋白质同源物共同存在于假定的核仁样结构域，这提供了额外的值得讨论的见解(图3)．例如，亲银蛋白L7Ae和纤原蛋白(NOP1)以及非亲银蛋白EMG1和NOP2因为它们是核仁组织体C/D和H/ACA盒核糖核蛋白(Pederson 2011)．该复合物以甲基化和伪尿基化的形式指导rRNA的高度动态转录后修饰(Hernandez-Verdun 2006；Pederson 2011)．作为这一过程的一部分，核仁元件如何移动和组织的研究有助于理解纳米级核酸-蛋白质相互作用及其与蛋白质疾病和衰老研究的关系(Jiménez-García等，1994；Grummt 2013)．我们认为，我们的发现可能提供了这种纳米尺度动力的原始观点，可以通过提供最小模型进一步促进核仁生物学和相关疾病的研究。

除此之外，NOP1(纤原蛋白)与NOP2的系统发育关系值得进一步探讨。虽然在古生菌中编码古甘氨酸转糖基酶的NOP2不亲银，但它与agnor阳性的NOP1共享一个甲基转移酶结构域(罗德里格斯-科罗纳等人，2015)．基于此，我们假设在核仁进化的早期阶段，亲银蛋白可能聚集在酸性DNA环境周围，然后作为转录后rRNA修饰相关因子的后续募集位点。假定核仁中的许多蛋白质共享结构域，并可能执行不同的功能，随着时间的推移，这些功能变得更加专门化，即在具有不同细胞结构的物种中进一步适应。值得注意的是，我们对蛋白质在古菌细胞内如何组织以及细胞过程在空间上发生的理解仍然有限。因此，我们注意到信号识别粒子蛋白SRP19的蛋白质结构域出现在我们的数据中(补充表S6)．在真核生物中，srp与核仁相关，因为srp依赖的mRNA靶向蛋白注定要通过内质网(ER)进入分泌途径，随后在核仁中包装成高尔基体的囊泡(Pederson 2011)．然而，由于古生菌缺乏ER和高尔基体，我们假设SRPs参与了其他可能类似的功能，考虑到它们与核仁的空间关系，这将在它们的分泌信号功能之前，正如我们的数据所表明的那样。

值得注意的是，与核仁被核膜隔开的真核转译不同，美国solfataricusrRNA的转录和翻译同时发生，可以在空间上连接到一个非膜性隔室。作为未来研究的一个问题，推测固有于古菌细胞或基因组结构的蛋白质的积累和流动性可能导致核仁样多功能复合物作为亚细胞组织者。例如，如果假定的核仁是多功能的(例如，真核核仁参与程序性细胞死亡、代谢调节、细胞分化、应激和衰老)，那么这可能解释了我们发现的许多古生菌agnor敏感蛋白的存在，这些蛋白与真核核仁没有明显的功能关系。事实上，我们通过显微镜和分子方法的结合，在一个古生菌核仁样区域中共同识别了所有这些元素，这为假定的核仁与古生菌细胞组织的关系提供了初步的了解。它也为解决悬而未决的问题打开了大门，比如这里描述的核仁样结构在其他古生菌或细菌群中有多广泛，或者核体(例如核仁、卡哈尔体等)的进化是否早于核膜的存在。

综上所述，我们认为我们的发现可能是关于核仁、细胞核的进化起源以及原核-真核生物分裂中的细胞组织和复杂性的可能范式转变的开始。我们假设第一个核仁是离散的纤维颗粒和亲银结构域，其性质可能是蛋白质的、基于基因表达的亚细胞组织者，在以前随机分布的原核细胞质中结合了空间、结构和功能。

为了支持这一点，最近一种使用染色体捕获的方法(竹俣等人，2019年；Takemata和Bell, 2021年)表明，Crenarchaeotes显示出一种精细的染色体组织机制，通过聚结蛋白介导的远程位点分组，取决于基因表达水平。虽然我们在分析中没有发现聚结素，但推定古菌核仁也与亚细胞组织者和染色质组织形式有关。虽然聚结蛋白富集在含有较少活性基因的所谓B染色体区室中，但含有rDNA位点的转录活性A区室可能特别适合核仁相关基因的表达、组织和调控。类似于真核生物核结构的概念(即Cajal和Polycomb体和泡芙)，古生菌中的基因表达应该与亚细胞结构(如核体)有关，即使在没有核膜的情况下，也可以安排基因、rna和蛋白质。虽然过去的研究(Gaal等人，2016)声称，细菌中的转录活性区域是核仁的回忆，我们认为对假定核仁的搜索应该从古生菌开始，以一种综合的方法。如别处所述(Takemata和Bell, 2021年)，指导基于系统发育和整合显微镜的探索，特别是TEM和超分辨率，到基因组、蛋白质组或转录组方法，例如3C-Seq映射，有可能为从古生菌到真核生物的细胞生物学和核仁和核糖体生物发生的进化提供丰富的见解。同一作者还建议，假定核仁可能是在美国solfataricus从基因组结构的角度来看。

尽管我们有各种各样的证据，但我们要强调的是，仍然面临许多技术限制。例如，这里观察到的AgNOR染色的亚细胞结构是否与rDNA/rRNA共定位仍有待确定，因为AgNOR染色的细胞化学性质与同一样品中的UISH或抗体不兼容进行共定位。此外，使用放线菌素D等转录抑制剂可能是评估核仁发生的一种非常补充的方法，即从AgNOR信号的丢失推断核仁的形成和破坏。我们发现，这种功能实验，除了其他方法，如加入溴啶来确认转录活性或使用特异性抗体和RNA探针定位蛋白质和snorna原位，将成为进化细胞生物学界一个令人兴奋的视角。值得注意的是，放线菌素D报告的剂量是真核聚合酶I (Sirri等人，2000年)，以及抑制剂、抗体和原位探针在古生菌研究中仍然有限。特别是，需要开发一套针对古菌核糖体和核仁同源蛋白的特异性抗体来共定位每种蛋白。

在当代的双域生命树图中，真核生物是TACK古细菌(Gribaldo等人，2010)．原核仁在TACK古菌物种中的存在表明，核仁的起源和进化可以追溯到不同的古菌系统发育共同祖先，最初是真核生物和TACK古菌。我们没有忘记，这种蛋白质细胞器的存在或不存在应该在古生菌甚至细菌的更多代表中确定:这是出现进化细胞生物学的动机。通过绘制古生菌和细菌系统发育中核仁元素(分子和结构)的存在和不存在，我们可能会提出或拒绝核仁进化的渐进主义场景，并对纳米细胞结构有更深刻的理解。

数据可用性声明

评估结论所需的所有数据都在手稿中补充材料，以及其中的参考文献。氨基酸翻译基因的基因组美国solfataricus菌株P1 (GenBank登录号NZ_LT549890.1)可在https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/900/079/115/GCF_900079115.1_SSOP1/GCF_900079115.1_SSOP1_protein.faa.gz．所有蛋白质特征都在UniProtKB/SwissProt数据库中进行注释https://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/current_release/knowledgebase/complete/uniprot_sprot.fasta.gz．GO注释是根据UniProt id通过解析GOA基因关联文件获得的http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/GO/goa/UNIPROT/．

作者的贡献

PI-M在LJ-G和CV的指导下提出了这个研究的概念，参与了项目的各个阶段，是主要作者，并撰写了手稿。AC参与了基因组学和蛋白质组学的实验设计，支持PI-M进行相关的实验室流程，分析蛋白质组学和基因组学的结果，并撰写稿件。MM支持PI-M的标准化美国solfataricus在KAUST Danielle Daffonchio的实验室里。LJ-G是资深作者，作为PI-M的博士生导师参与了本研究的概念化和实验设计，特别支持PI-M对UISH和TEM的观测，并撰写了手稿。LJ-G的巩固研究方向是核仁的结构、功能和演化。CV在资金上支持了这个项目，为其完成提供了基础设施，在智力上参与了项目的各个阶段，并撰写了手稿。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

致谢

我们要感谢UNAM的机构支持和KAUST的机构和资金支持。我们还要感谢我们的同事:来自UNAM的Silvia Juárez-Chavero，来自KAUST的Martin Barrios-Llerena, Adriana Valenzuela, Fabia Simona和Danielle Daffonchio教授的技术援助;来自Biología-UNAM研究所的Jorge Nieto教授和来自Genómicas-UNAM科学中心的David Romero教授的批判性阅读。我们也要感谢南苏丹国立大学的Ana María Cetto教授，Susana Magallón教授，以及Omar Fayad, Lamán Carranza和Rosaura Ruiz教授对墨西哥科学研究的个人支持。特别感谢墨西哥驻利雅得大使馆和KAUST的David Yeh对墨西哥和沙特阿拉伯之间科学外交的支持。Parsifal Fidelio Islas-Morales作为墨西哥国立大学Autónoma (UNAM)“科学博士项目Biomédicas”的博士生开展了部分研究，并获得了CONACyT奖学金495217。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2023.1075071/full#supplementary-material

脚注

参考文献