嗜热太古菌两种转氨酶的生化和遗传检测gydF4y2BaThermococcus kodakarensisgydF4y2Ba

介绍gydF4y2Ba

氨基转移酶，或转氨酶，催化氨基从供体到受体化合物的酮基的可逆转移(gydF4y2BaToyokawa等人，2021年gydF4y2Ba；gydF4y2BaKoper等人，2022gydF4y2Ba）.该反应依赖于5 ' -磷酸吡哆醛(PLP)。许多转氨酶识别α-氨基酸的α-氨基和2-氧酸的酮基，但一些识别侧链上的氨基(gydF4y2BaKoszelewski等人，2010gydF4y2Ba；gydF4y2Ba马利克等，2012年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba郑等，2018gydF4y2Ba)或除α-氨基酸以外的底物(gydF4y2Ba戈姆和奥莱利，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba凯利等人，2020年gydF4y2Ba）.酶在各种生物的碳和氮代谢中起着关键作用。转氨酶是人们关注的焦点，因为它与多种疾病有关(gydF4y2BaKunutsor等人，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaMontioli等人，2021gydF4y2Ba)，在生物催化方面也是很有吸引力的酶(gydF4y2Ba马利克等，2012年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba戈姆和奥莱利，2018年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba凯利等人，2020年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

转氨酶可根据其主要结构分为四类(I至IV类)(gydF4y2Ba梅塔等人，1993年gydF4y2Ba）.另一方面，plp依赖酶可以根据它们的折叠(折叠类型I到VII;gydF4y2BaJansonius 1998gydF4y2Ba；gydF4y2BaSchneider et al.， 2000gydF4y2Ba；gydF4y2BaKoper等人，2022gydF4y2Ba）.一类转氨酶、二类转氨酶和IV类转氨酶与Fold I型有共同的祖先，而III类转氨酶是Fold IV型PLP酶的成员(gydF4y2Ba梅塔等人，1993年gydF4y2Ba）.I类酶构成了大多数的转氨酶，包括芳香族转氨酶、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶。II类包括能够识别氨基酸的α-氨基以外的氨基并利用诸如γ-氨基丁酸或GABA和鸟氨酸等底物的酶。具有不同折叠的IV型的III类酶利用d-氨基酸和支链氨基酸。IV类酶利用Ser，gydF4y2BaOgydF4y2Ba-磷酸丝氨酸或Asp作为氨基供体(gydF4y2Ba梅塔等人，1993年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMehta和Christen, 2000gydF4y2Ba；gydF4y2BaKoper等人，2022gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

热球菌由三个属组成，gydF4y2Ba海床gydF4y2Ba，gydF4y2BaThermococcusgydF4y2Ba,gydF4y2BaPalaeococcusgydF4y2Ba，而成员很容易利用氨基酸和多肽作为生长的碳和能量来源(gydF4y2Ba齐利格等人，1983年gydF4y2Ba；gydF4y2BaFiala和Stetter, 1986gydF4y2Ba；gydF4y2BaTakai等人，2000年gydF4y2Ba）.不同的酶和途径参与氨基酸分解代谢和生物合成已经在这些生物中进行了研究。特别是，酶的性质广泛的氨基转移酶gydF4y2Ba海床furiosusgydF4y2Ba（gydF4y2BaAndreotti等人，1995年gydF4y2Ba；gydF4y2BaWard等人，2000年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2002gydF4y2Ba)，gydF4y2Ba海床horikoshiigydF4y2Ba（gydF4y2Ba松井等人，2000年gydF4y2Ba；gydF4y2BaUra等，2001gydF4y2Ba；gydF4y2BaOkada等人，2012年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2014gydF4y2Ba)，gydF4y2BaThermococcus litoralisgydF4y2Ba（gydF4y2BaAndreotti等人，1994年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSakuraba等人，2004年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2008gydF4y2Ba)，gydF4y2BaThermococcusgydF4y2Basp. CKU-1 (gydF4y2Ba内田等人，2014gydF4y2Ba),gydF4y2BaThermococcus kodakarensisgydF4y2Ba（gydF4y2BaKanai等，2015gydF4y2Ba；gydF4y2Ba郑等，2018gydF4y2Ba)的报道。我们小组一直在研究氨基酸代谢gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba（gydF4y2BaShikata等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba；gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba）.除基因组序列外(gydF4y2BaFukui et al.， 2005gydF4y2Ba)，一个多功能的遗传系统(gydF4y2Ba佐藤等人，2003年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba；gydF4y2BaMatsumi等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaSantangelo et al.， 2008gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2010gydF4y2Ba)使我们能够评估个体基因在这个有机体中的生理作用。gydF4y2Ba

参与谷氨酸代谢的酶/基因的生化和遗传检查gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba证实谷氨酸脱氢酶(TK1431)的存在，催化谷氨酸和2-氧谷氨酸之间的nadp依赖性相互转化(gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.2-氧戊二酸盐:铁还蛋白氧化还原酶(TK1123-TK1125, TK1131)和adp形成琥珀酰辅酶a合成酶(TK1880, TK0943;gydF4y2BaShikata等人，2007年gydF4y2Ba)，构成了从Glu到琥珀酸的路径。后两个反应导致还原铁还蛋白和ATP的生成，并与2-氧酸降解耦合，提供还原物和化学能(gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.四种2-氧酸:铁氧还蛋白氧化还原酶和五种adp形成酰基辅酶a合成酶的存在gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba提示其他氨基酸通过类似的反应被分解。基于酰基辅酶a合成酶的底物特异性(gydF4y2Ba麦和亚当斯，1996年gydF4y2Ba；gydF4y2BaGlasemacher等人，1997年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMusfeldt等人，1999gydF4y2Ba；gydF4y2BaShikata等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba)，认为下列氨基酸是分解代谢的产物;Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr, Trp, Glu/Gln, Cys和His (gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba）.然而，作用于谷氨酸以外的氨基酸的脱氢酶，如天门冬氨酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶，在遗传上已被证实不存在gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba（gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.这意味着氨基酸生成2-氧酸依赖于转氨酶。为了更好地了解哪些氨基酸参与了分解代谢降解，哪些转氨酶参与了代谢降解，我们对植物中两种转氨酶进行了生化和遗传检测gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba由TK0548和TK2268编码。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

热球菌中多组转氨酶同源物gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba显示了四个选定的热球菌物种的I类转氨酶同源物的系统发育树，gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba，gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2Ba，gydF4y2Bap . horikoshiigydF4y2Ba,gydF4y2Bat . litoralisgydF4y2Ba，其中多种转氨酶已被实验研究。包括编码半胱氨酸脱硫酶的IV类蛋白的代表TK1990 (gydF4y2BaHidese等人，2014gydF4y2Ba)，作为外组。有8个类群(G1-G8)，其中同源物出现在40个热球菌物种的10个或更多基因组中。在8个组中，G1的成员(40个基因组中有39个基因组存在同源性;39/40)、G2(40/40)、G3(40/40)、G6(40/40)和G8(35/40)存在于我们分析中使用的大部分或所有热球菌基因组中。G4(12/40)、G5(10/40)和G7(20/40)成员国的分布较少。gydF4y2Bat . litoralisgydF4y2Ba与其他三个物种相比，具有更多的I类转氨酶同源物。OCC_03517的同源物在其他任何热球菌基因组上都没有发现，但在其他物种中可以发现OCC_10965(3/40)、OCC_02240 (10/40, G5)和OCC_11814(5/40)的同源物。基于所有I类转氨酶同源物序列的详细系统发育树显示于gydF4y2Ba补充图S1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

我们首先考虑了这些氨基转移酶的基因位置和以前对热球菌成员氨基转移酶的生化研究，从而考虑了这些氨基转移酶的生理作用。在基因定位方面，我们观察到TK0250 (G7)包含在His生物合成基因簇(TK0242-TK0251)中gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba．我们还在热球菌成员中观察到TK0250同源物与His生物合成操纵子之间的完全共现(gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba）.在TK0260 (G4)中观察到类似的情况。该基因位于参与Phe/Tyr in生物合成的基因簇(TK0259-TK0261)中gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba， TK0260同源物与热球菌种的基因簇共现(gydF4y2Ba补充表S2gydF4y2Ba）.这些观察结果表明，G4和G7成员的生理作用分别与Phe/Tyr和His生物合成有关。来自热球菌的G8成员尚未鉴定，但显示30%与苏氨酸脱羧酶(由MM2060编码)相同gydF4y2Ba甲烷八叠球菌属mazeigydF4y2Ba（gydF4y2Ba塔瓦雷斯等人，2018gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2019gydF4y2Ba)，并与钴胺素挽救相关的基因聚在一起。相比之下，G1、G2、G3、G5和G6的成员没有表现出包含在特定生物合成操纵子或基因簇中的趋势。gydF4y2Ba

G1, G2, G3和G6的成员广泛分布在热球菌物种中，并且许多成员已被生物化学表征。特别是G1和G6的成员已经得到了相对较好的研究。在G1的情况下，PH1371蛋白的结构从gydF4y2Bap . horikoshiigydF4y2Ba最常见的氨基供体是Tyr, Phe, Glu, His和Trp (gydF4y2Ba松井等人，2000年gydF4y2Ba）.PF1253蛋白来自gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2BaAroAT II对Phe、Tyr和Trp表现出最高的偏好gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba朝向Phe (gydF4y2BaWard等人，2002年gydF4y2Ba）.OCC_04737蛋白gydF4y2Bat . litoralisgydF4y2Ba，被称为ArAT II，也表现出类似的性质，更倾向于Phe, Tyr和Trp (gydF4y2BaAndreotti等人，1994年gydF4y2Ba）.在G6的情况下，PF0121蛋白来自gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2Ba，即ArAT或AroAT I，对Phe、Trp和Tyr (gydF4y2BaAndreotti等人，1995年gydF4y2Ba）.OCC_04335蛋白gydF4y2Bat . litoralisgydF4y2Ba，被称为ArAT I，也识别Phe, Tyr和Trp (gydF4y2BaAndreotti等人，1994年gydF4y2Ba）.PH0207蛋白显示犬尿氨酸转氨酶活性，参与色氨酸的降解(gydF4y2BaOkada等人，2012年gydF4y2Ba)，并确定了晶体结构(gydF4y2BaChon等人，2005年gydF4y2Ba；gydF4y2BaOkada等人，2014gydF4y2Ba）.关于其他基团，PF1497蛋白来自gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2Ba(G3)，称为AlaAT，与Ala的活性最高。酶对Phe和Tyr (gydF4y2BaWard等人，2000年gydF4y2Ba）.植物TK1094的遗传分析gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba(G3)提示丙酮酸与Ala (gydF4y2BaKanai等，2015gydF4y2Ba）.PF1702蛋白(G4)被称为AspAT，对Asp和Glu表现出最高的活性，对广泛的氨基酸(gydF4y2BaWard等人，2002年gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

我们对TK2268和TK0548进行了进一步分析。TK2268蛋白是G2的成员，它没有任何已被实验表征的成员。确定其生化特性有助于我们对氨基酸代谢的理解gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba．我们还检测了TK0548蛋白，这是与TK2268蛋白最密切相关的蛋白(45.4%相同)。G1和G2基因均未进行基因检测。gydF4y2Ba

TK0548和TK2268基因的表达及重组蛋白的纯化gydF4y2Ba

为了获得重组蛋白，将TK0548和TK2268基因表达于gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba．以TK0548为例，得到可溶性蛋白，经热处理、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化重组TK0548蛋白。以TK2268为例，表达式在gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba导致包涵体的形成。因此，该基因在原生宿主中得到表达gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba在细胞表面糖蛋白基因强组成启动子的控制下(gydF4y2BacsggydF4y2BaTK0895;gydF4y2BaYokooji等人，2009年gydF4y2Ba）.组合一个His的序列gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba在TK2268蛋白的c端引入了-tag。可溶性TK2268蛋白gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba用镍亲和柱和凝胶过滤层析纯化细胞。对两种蛋白质进行SDS-PAGE检测，证实其明显的均质性(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

TK0548和TK2268蛋白的寡聚状态gydF4y2Ba

用凝胶过滤层析法检测纯化的重组TK0548和TK2268蛋白的分子量。TK0548蛋白分子质量估计值为85 kDa，考虑到单体分子质量估计值为43608 Da，说明TK0548蛋白为二聚体。以TK2268蛋白为例，我们一致观察到两个峰，对应于估计的分子质量为98 kDa和327 kDa。计算得到的单体分子质量为45116 Da，结果表明TK2268蛋白形成了一个二聚体单元，再进一步组装形成一个八聚体。gydF4y2Ba

TK0548和TK2268蛋白以依赖plp的方式催化转胺作用gydF4y2Ba

对纯化的TK0548和TK2268蛋白进行转氨酶活性检测。我们使用Glu (10 mM)作为氨基供体，丙酮酸(10 mM)作为氨基受体。我们观察到两种蛋白的转氨酶活性。当反应中不添加PLP时，我们观察到两种情况下的活性都有部分下降(TK0548:下降13%，TK2268:下降50%)，这表明TK0548和TK2268蛋白是PLP依赖的转氨酶。唯一的部分活性下降很可能是由于PLP在各自的宿主细胞中产生时与蛋白质结合，gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(TK0548)和gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba(TK2268)。为了进一步支持PLP在反应中的必要性，我们添加了PLP抑制剂羟胺(gydF4y2BaKito等人，1978年gydF4y2Ba)对酶的影响。在本例中，我们观察到加入羟胺后，TK0548蛋白的活性进一步降低了93%，TK2268蛋白的活性降低了78% (gydF4y2Ba补充图S2gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

与不同的氨基供体和受体化合物的转胺作用gydF4y2Ba

我们首先进行了初步筛选，以确定TK0548和TK2268蛋白识别的氨基酸。以2- oxglutarate或pyruvate为氨基受体，分别在15 min后检测Glu或Ala的产生情况。底物以10 mM的浓度存在于反应混合物中。如gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba， TK0548蛋白利用Phe、Tyr、His和Trp作为氨基供体，并在较低程度上利用Met、Glu和Leu。在TK2268蛋白中，Asp和Glu以及Tyr、Leu、Ala、Met和Cys (gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

专注于蛋白质识别的氨基酸，我们检测了酶的活性。氨基酸和氨基酸受体在10 mM不变。如gydF4y2Ba图4一gydF4y2BaTK0548蛋白对Tyr的活性最高，其次是Phe、Trp和His。对Leu、Met和Glu的活性要低得多。另一方面，TK2268蛋白对Glu活性最高，其次是Asp。使用Cys、Leu、Ala、Met和Tyr (gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

TK0548和TK2268蛋白的底物特异性gydF4y2Ba

对底物进行了动力学分析，结果产生了相对较高的活性水平。对于TK0548蛋白，首先测定了不同浓度的丙酮酸或2-氧戊二酸在10 mM Phe存在下的活性。如gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba， TK0548蛋白表达水平较高gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}和更低的gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba与丙酮酸相比趋向于2-氧戊二酸。的gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba2-氧戊二酸的值比丙酮酸高70多倍。接下来，我们检测了不同浓度的Phe, Tyr, Trp, His和Met在10 mM 2-羟戊二酸盐(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba）.最高的gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba苯丙氨酸含量较高，Tyr和Trp含量也较高。一个较低的gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2BaHis值，Met值极低。结果表明，TK0548蛋白主要利用芳族氨基酸Phe、Tyr和Trp作为底物，His也可能是底物。gydF4y2Ba

对于TK2268蛋白，使用Leu (50 mM)作为氨基供体，在不同浓度的丙酮酸和2-氧戊二酸盐下测定活性。的gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba2-氧戊二酸盐的含量高于丙酮酸盐(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba）.这主要是由于gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba价值，因为他们的gydF4y2BaVgydF4y2Ba_{马克斯gydF4y2Ba}价值具有可比性。由于转氨酶与2-氧戊二酸盐反应的产物不能以Glu作为氨基供体，因此以10 mM丙酮酸盐作为氨基受体，考察不同浓度Glu、Asp和Leu的活性，结果相对较高gydF4y2BakgydF4y2Ba_猫gydF4y2Ba/gydF4y2BaKgydF4y2Ba_米gydF4y2BaAsp和Glu的含量均高于Leu和Tyr。结果表明，TK2268蛋白是一种对酸性氨基酸Glu和Asp具有特异性的转氨酶。gydF4y2Ba

ΔTK0548和ΔTK2268株的基因破坏和生长gydF4y2Ba

了解TK0548和TK2268基因在大豆氨基酸分解代谢中的作用gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba，我们破坏了每个基因使用gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216(ΔgydF4y2BapyrFgydF4y2Ba)作为宿主菌株。每个基因断裂选择5个转化子，用PCR检测其位点。具有TK0548基因(gydF4y2Ba图5一个gydF4y2Ba)或TK2268基因(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)被打乱。对各自的基因座进行测序，证实基因破坏已按预期发生。gydF4y2Ba

ΔTK0548和ΔTK2268破坏株首先在营养丰富的ASW-YT-m1-S中生长gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba含有酵母膏及色氨酸的培养基(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba）.两株破坏株的生长与宿主株KU216的生长无显著差异。因此，为了增加菌株生长对氨基酸分解代谢的依赖性，将菌株在ASW-AA-m1-S中培养gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba(+Ura)中(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba）.这种介质是一种合成介质，氨基酸是唯一主要的碳和能量来源。在这种情况下，我们观察到两个基因破坏菌株的生长迟缓。培养物的细胞产量最终达到相似的水平，但基因破坏菌株需要4小时的时间才能达到最大细胞密度。结果表明，这两种蛋白质都参与了对氨基酸的利用gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

转氨酶活性gydF4y2BaThermococcus kodakarensisgydF4y2Ba细胞提取gydF4y2Ba

已经确定了来自热球菌成员的多种转氨酶的底物特异性gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba．然而，每种蛋白质在特定氨基酸转化中的作用gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba不能仅通过生化性质来确定，因为在细胞中存在多种转氨酶，在某些情况下具有重叠底物特异性或不同的表达水平。因此，我们测量和比较了转氨酶活性的细胞提取物gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba宿主株和基因破坏株。作为gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究表明，TK0548蛋白对Trp、Phe、Tyr和His具有较好的识别能力，而TK2268蛋白对Asp和Glu具有较好的识别能力，测定了细胞提取物中Trp、Phe、Tyr、His、Asp和Glu的活性。我们也使用Ile作为氨基供体。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究表明TK0548和TK2268蛋白对Ile的识别程度都很低(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)，因此TK0548和TK2268的破坏对Ile的胞内转氨酶活性的影响可能较低。如gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba在KU216细胞提取物中，所有7种氨基酸的转氨酶活性都清晰地观察到。我们观察到转氨酶对不同氨基酸的活性水平有很大差异。对苯丙氨酸或谷氨酸的活性特别高，而对Asp的活性则明显低，比苯丙氨酸或谷氨酸低两个数量级。当我们检测基因破坏的影响时，TK0548和TK2268的破坏对Ile的细胞内转氨酶活性没有影响，这与我们的研究结果一致gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba结果表明，两种酶都不能识别Ile (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba）.接下来，我们检查了在基因破坏中观察到的差异，重点是那些具有gydF4y2BapgydF4y2Ba值低于0.01。我们观察到，TK2268的破坏导致对Asp的转氨酶活性降低35%，Asp是该蛋白首选的底物之一gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验。TK2268的破坏不影响细胞提取物中Glu转氨酶的活性，表明该蛋白对这种活性的贡献相对较小。这并不奇怪，因为gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba分析表明，TK2268蛋白对Glu和Asp的活性相当(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba）.由于总谷氨酸转氨酶的活性gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba在细胞提取物中，谷氨酸转氨酶活性的降低与Asp水平相当，但只对应于Glu总活性的很小一部分。我们还观察到His转氨酶活性下降，但这不能用实验结果解释gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba分析。当TK0548被破坏时，观察到Trp(32%)、Tyr(64%)和His(89%)的活性下降。TK0548蛋白似乎是Tyr和His转氨酶活性的主要贡献者gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

生物化学研究已经从热球菌种进行了丰富的转氨酶。蛋白质gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba，gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2Ba，gydF4y2Bap . horikoshiigydF4y2Ba,gydF4y2Bat . litoralisgydF4y2BaI类至IV类转氨酶在gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba．一些蛋白质已被证明催化转胺作用以外的反应，包括消旋酶、脱羧酶、脱硫酶、羟甲基转移酶等。对于已被生物化学检测的转氨酶，指出了氨基供体和受体分子。TK0548蛋白更倾向于芳族氨基酸Phe, Tyr和Trp，这与G1的其他成员一致。在较低的程度上，蛋白质也识别了His。PH1371蛋白也显示对His的活性(gydF4y2Ba松井等人，2000年gydF4y2Ba）.PF1253的活性(gydF4y2BaWard等人，2002年gydF4y2Ba)及OCC_04737 (gydF4y2BaAndreotti等人，1994年gydF4y2Ba)朝向His的蛋白质还没有被研究过。以TK2268蛋白为例，它是G2的第一个特征代表，并对酸性氨基酸Asp和Glu表现出特异性。虽然在不同的研究中检测的底物范围不同，但属于同一组的酶显示出相似的底物特异性，例如G1中的四种酶和G6中的三种酶。因此，我们对TK2268蛋白的研究结果提高了G2成员识别酸性氨基酸作为氨基酸供体的可能性。gydF4y2Ba

为了了解每种酶对特定氨基酸的转胺作用的贡献gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba，我们检测并比较了宿主株KU216与ΔTK0548和ΔTK2268破坏株细胞间的特异性转氨酶活性。这不仅考虑了每种酶的底物特异性和活性水平，还考虑了它们在细胞中的表达水平。结果表明，TK0548对苯丙氨酸和色氨酸的氨基转移酶活性有一定的促进作用，对Tyr酶活性有较高的促进作用。在破坏菌株中观察到的相当高的活性水平很可能反映了TK0186蛋白的活性，它是G6 (gydF4y2Ba表3gydF4y2Ba）.有趣的是，TK0548蛋白似乎是主要的His转氨酶gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba，约占细胞提取物活性的90%。gydF4y2Ba

氨基酸分解代谢在热球菌的成员进行gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba氨基酸、2-氧酸、酰基辅酶a和酸(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba）.关于氨基酸向2-氧酰酸的转化，我们小组之前已经证明，Glu是唯一由脱氢酶转化的氨基酸，由TK1431编码的谷氨酸脱氢酶。所有其他氨基酸转化为2-氧基酸都必须依赖转氨酶(gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.2-氧基酸转化为酰基辅酶agydF4y2Ba通过gydF4y2Ba2-oxoacid:铁氧还蛋白氧化还原酶。有7组编码2-氧酸的潜在基因:热球菌成员中的铁氧还蛋白氧化还原酶，以及来自热球菌的4种蛋白质复合物gydF4y2Bap . furiosusgydF4y2Ba已进行生物化学检查;丙酮酸:铁还蛋白氧化还原酶(POR)， 2-酮异戊酸:铁还蛋白氧化还原酶(VOR)，吲哚丙酮酸:铁还蛋白氧化还原酶(IOR)， 2-酮戊二酸:铁还蛋白氧化还原酶(KGOR) (gydF4y2Ba布莱米和亚当斯，1993年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba麦和亚当斯，1994年gydF4y2Ba；gydF4y2BaHeider等人，1996年gydF4y2Ba；gydF4y2Ba麦和亚当斯，1996年gydF4y2Ba）.KGOR同系物在gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba已进行基因检测，证实其在谷氨酸代谢中的作用，将2-氧谷氨酸酸酯转化为琥珀酰辅酶a (gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.最后，酰基辅酶a被形成ndp的酰基辅酶a合成酶水解。热球菌中有5种形成ndp的酰基辅酶a合成酶;ACS I, ACS II, ACS III，琥珀酰辅酶a合成酶(SCS)和2-(咪唑-4-基)乙酰辅酶a合成酶(ICS)。ACS I和ACS IIgydF4y2Bap . furiosusgydF4y2BaACS II, ACS III, SCS和ICSgydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba已进行生物化学检查(gydF4y2Ba麦和亚当斯，1996年gydF4y2Ba；gydF4y2BaGlasemacher等人，1997年gydF4y2Ba；gydF4y2BaMusfeldt等人，1999gydF4y2Ba；gydF4y2BaShikata等人，2007年gydF4y2Ba；gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba）.经遗传学证实，SCS参与谷氨酸代谢(gydF4y2BaYokooji等，2013gydF4y2Ba）.由于形成ndp的酰基辅酶a合成酶催化发生底物水平磷酸化的反应，因此有可能根据酰基辅酶a合成酶的底物特异性来预测受这种分解代谢影响的氨基酸。五种酰基辅酶a合成酶联合识别的底物表明，受这种分解代谢模式影响的氨基酸有Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Glu/Gln、Cys和His (gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba）.已经报道了识别Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp和Glu/Gln的转氨酶，以及2-oxoacid:铁氧还蛋白氧化还原酶，在转氨化后作用于相应的2-oxoacid。然而，与Cys和His降解相关的氨基转移酶和2-oxoacid:ferredoxin氧化还原酶仍不清楚。特别是，ICS对2-(咪唑-4-基)-乙酸酯表现出非常高的特异性，这表明它仅参与His代谢(gydF4y2BaAwano等人，2014gydF4y2Ba）.本研究结果有力地表明，TK0548蛋白与ICS在His分解代谢中存在代谢关联(gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba）.在一定程度上，TK0548蛋白也参与芳香族氨基酸特别是Tyr的分解代谢。最后，五种酰基-辅酶a合成酶组合的特异性提高了Asp、Asn、Gly、Lys、Arg、Pro、Ser和Thr可能不定向于涉及2-氧酸的分解代谢降解:铁氧还蛋白氧化还原酶和ndp形成酰基-辅酶a合成酶，这可能与观察到的Asp转氨酶活性明显较低有关gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba细胞提取物和TK2268蛋白。正如我们之前所展示的gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba没有Asp脱氢酶，我们目前的知识表明Asp不是通过涉及2-氧酸的途径分解的:铁氧还蛋白氧化还原酶和形成ndp的酰基辅酶a合成酶。我们也没有在基因组上找到一个天门冬氨酸解氨酶同源物，这将导致富马酸的产生。此外,gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba具有富马酸酶同源物，但缺乏柠檬酸循环的许多同源物，包括琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合成酶。除了TK2268蛋白外，可能与草酰乙酸代谢相关的酶有一种假定的富马酶、苹果酶(gydF4y2Ba福田等人，2005年gydF4y2Ba)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(gydF4y2Ba福田等人，2004年gydF4y2Ba）.gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba可能会表现出与细菌中发现的不同的c4化合物代谢。进一步了解草酰乙酸代谢为阐明Asp代谢和TK2268的生理功能提供了有价值的线索。然而，我们想要指出的是，我们不能排除TK2268蛋白识别与本研究中考虑的完全不同的底物的可能性。gydF4y2Ba

材料与方法gydF4y2Ba

菌株和培养条件gydF4y2Ba

Thermoccocus kodakarensisgydF4y2Ba从日本鹿儿岛柯达原岛分离出来(gydF4y2BaMorikawa等人，1994gydF4y2Ba；gydF4y2BaAtomi等人，2004年gydF4y2Ba）.gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216 (gydF4y2Ba佐藤等人，2003年gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2005gydF4y2Ba)和衍生菌株在85°C的严格厌氧条件下，在富含营养的培养基(ASW-YT-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba或ASW-YT-m1-pyruvate)或合成介质(ASW-AA-m1-S)gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba）.ASW-YT-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba、ASW-YT-m1-pyruvate和ASW-AA-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba是ASW-YT-S的修改版本吗gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba、ASW-YT-pyruvate和ASW-AA-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba媒体,分别。ASW-YT-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba由0.8 ×人工海水(ASW)组成(gydF4y2Ba《Robb and Place》，1995年出版gydF4y2Ba)， 5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}酵母提取物，5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}色氨酸，2 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}单质硫。在ASW-YT-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba， 20 μm ki, 20 μm hgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 10 μM镍gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10 μM NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba我们gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba是补充。在ASW-YT-m1-pyruvate介质中，用5 g L取代单质硫gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}丙酮酸钠。ASW-AA-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba由0.8 × ASW、20种氨基酸的混合物、改性的Wolfe微量矿物质和维生素的混合物(gydF4y2Ba佐藤等人，2003年gydF4y2Ba）.在ASW-AA-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba， 20 μm ki, 20 μm hgydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba薄gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba， 10 μM镍gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 10 μM NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba我们gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba的浓度进行了补充gydF4y2BalgydF4y2Ba-精氨酸盐酸盐和gydF4y2BalgydF4y2Ba-缬氨酸增加(从125 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}至250 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}从50毫克LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}至200mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}分别)。当细胞没有gydF4y2BapyrFgydF4y2Ba培养基因，10 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}加入尿嘧啶合成ASW-AA-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba(+ Ura所言)。去除介质中的氧，5% (w/v) NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba加入S溶液，直至培养基变为无色。利沙尿(0.5 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})也添加到所有介质中作为氧指示剂。用于分离转化体的固体介质为10 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}凝胶，7.5 g LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}5-氟山莨菪酸(5-FOA)， 10 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}尿嘧啶，4.5 mL 1 M NaOH和0.2% (v/v)多硫化物溶液(10 g NagydF4y2Ba_2gydF4y2Ba年代9 hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO和3克硫花在15毫升HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaASW-AA-m1培养基中添加的是O)而不是单质硫。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α (Takara Bio, Kusatsu, Japan)和BL21-Codonplus(DE3)-RIL菌株(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)在37°C的溶源肉汤(LB)培养基中培养，培养基中添加氨苄西林(100 mg L)gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}）.gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α用于重组质粒的构建gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba用BL21-Codonplus (DE3)-RIL进行异源基因表达。化学品从Wako Pure Chemicals(日本大阪)或Nacalai Tesque(日本京都)购买，除非另有说明。gydF4y2Ba

TK0548和TK2268基因的表达gydF4y2Ba

本研究采用pET21a(+)作为TK0548的表达载体，TK0548是从基因组DNA中扩增而来的gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216使用底漆套装TK0548F/TK0548R (gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba）.限制性内切酶位点gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2BaBamgydF4y2Ba在PCR过程中，HI分别被纳入片段的5 ' -和3 ' -端。扩增产物与pET21a(+)酶切gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2BaBamgydF4y2BaHI，结扎采用高结扎Ver. 2，并引入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5α细胞。PCR检测阳性菌落，DNA测序确认。质粒被引入gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaBL21-Codonplus (DE3)-RIL用于基因表达。gydF4y2Ba

TK2268基因扩增自大鼠的基因组DNAgydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216使用底漆套装TK2268F/R (gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba萨尔gydF4y2BaI位点以及序列引入一个c端HisgydF4y2Ba_6gydF4y2Ba-标签在扩增过程中被合并。放大产物被消化gydF4y2Ba濒死经历gydF4y2Ba我和gydF4y2Ba萨尔gydF4y2Ba我又插进了一个gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba-gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba先前用于TK2101和TK1211异源表达的穿梭质粒(gydF4y2Ba郑等，2018gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2021gydF4y2Ba）.在通过DNA测序确认没有意外突变后，将质粒引入gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKPD2(ΔgydF4y2BapyrFgydF4y2Ba,ΔgydF4y2BapdaDgydF4y2Ba,ΔgydF4y2Ba贾gydF4y2Ba)进行基因表达。gydF4y2BapdaDgydF4y2Ba对应于TK0149，该基因的破坏导致胍丁胺营养不良(gydF4y2Ba福田等人，2008年gydF4y2Ba）.的转换,gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKPD2在ASW-YT-m1-S中生长gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba添加胍丁胺(1.0 mM)的培养基，85°C孵育12小时。细胞通过离心(12000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 5 min, 4℃)，再用200 μL 0.8 × ASW-m1重悬，冰孵育30 min。加入3.0 μg表达质粒后，冰孵育1 h。细胞接种于20 mL asw - y -m1- s中gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba媒介。85℃孵育24 h后，取200 μ l接种于20 mL asw - y -m1- s中gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba媒介。85°C孵育24 h后，将细胞扩散到固体asw - y -m1- s上gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba媒介。85℃孵育24 h后，在asw - y -m1- s中分离培养显示胍丁胺原质体的转化子gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba．PCR和DNA测序分别证实了重组质粒的存在和未发生意外突变。gydF4y2Ba

重组蛋白的纯化gydF4y2Ba

TK0548表达质粒在LB (100 mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氨苄西林30mg LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}氯霉素)37°C至ODgydF4y2Ba_660gydF4y2Ba达到0.6。将异丙基-1-硫代-β- d -半乳糖苷(IPTG)添加至0.1 mM, 18℃培养20 h，诱导异源基因表达。收集细胞gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba离心(12000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 15分钟，4°C)，重悬在50 mM HEPES缓冲液(含150 mM NaCl, pH 7.5)中。超声裂解细胞，12000 ×离心分离不溶性细胞碎片gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置15分钟。可溶性细胞提取物在85°C下热处理15 min，通过离心(12,000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 15分钟，4°C)。上清液被加载到一个阴离子交换柱(资源Q)，与50 mM HEPES缓冲液(pH 7.5)平衡。用0 ~ 1.0 M NaCl线性梯度洗脱蛋白。收集含有TK0548蛋白的组分，并用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO 10000)进行浓缩。所得到的蛋白质溶液应用于Superdex 200 10/300 Gl凝胶过滤柱(GE Healthcare)，流动相为50 mM HEPES缓冲液(含150 mM NaCl, pH7.5)，流速为0.7 mL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

TK2268基因表达株在ASW-YT-m1-pyruvate培养基中85℃培养20 h，离心(6000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 15分钟，4°C)。用0.8 × ASW-m1洗涤后，将细胞重悬于结合缓冲液(50 mM HEPES缓冲液，20 mM咪唑，500 mM KCl, 10% (v/v)甘油，pH 7.5)中，超声干扰。不溶性细胞碎片通过离心(12000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 15分钟，4°C)。可溶性细胞提取物应用于His GraviTrap色谱柱(GE Healthcare)，该色谱柱已与结合缓冲液平衡。带有His的TK2268蛋白gydF4y2Ba_6gydF4y2Ba用洗脱缓冲液(50 mM HEPES缓冲液，500 mM咪唑，500 mM KCl, 10% (v/v)甘油，pH 7.5)洗脱C端-标签。浓缩洗脱液后，将其应用于Superdex 200 10/300 Gl凝胶过滤柱(GE Healthcare)。TK2268蛋白用含有500 mM KCl和10% (v/v)甘油的50 mM HEPES缓冲液(pH7.5)流动相洗脱，流速为0.7 mL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

为了检查蛋白质的分子质量，使用Blue 2000检查柱的空隙体积，以及核糖核酸酶A (13.7 kDa)、碳酸酐酶(29 kDa)、卵清蛋白(44 kDa)、联白蛋白(75 kDa)、醛缩酶(158 kDa)和铁蛋白(440 kDa;通用电气医疗保健公司)作为标准。流动相为50 mM HEPES缓冲液(pH7.5)，含500 mM KCl, 10% (v/v)甘油，流速为0.7 mL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．以牛血清白蛋白为标准，用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad, Hercules, CA)测定蛋白质浓度。gydF4y2Ba

基因破坏株ΔTK0548和ΔTK2268的构建gydF4y2Ba

基因破坏菌株构建使用gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216(ΔgydF4y2BapyrFgydF4y2Ba)，显示尿嘧啶营养不良，作为宿主菌株。在破坏TK0548基因时，删除了TK0548基因起始密码子到碱基编号1080的区域，而不是停止密码子，以避免干扰下游重叠基因的表达。以TK2268为例，整个编码区连同其3 ' -flanking区的9个碱基被删除。从该菌基因组中扩增出TK0548和TK2268基因及其5 '和3 '侧区(约1.0 kbp)gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2BaKU216使用引物组dTK0548F1/R1和dTK2268F1/R1 (gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba）.将扩增产物插入gydF4y2BaHincgydF4y2Ba质粒pUD3的II位点gydF4y2BapyrFgydF4y2Ba基因的gydF4y2Bat . kodakarensisgydF4y2Ba插入gydF4y2Ba美国心理学协会gydF4y2BaI址pUC118 (gydF4y2BaYokooji等人，2009年gydF4y2Ba）.采用引物组dTK0548F2/0548R2和dTK2268F2/2268R2进行反PCR (gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba)从重组质粒中去除序列。相关区域序列经DNA测序确认。gydF4y2Ba

Thermococcus kodakarensisgydF4y2BaKU216在ASW-YT-m1-S中培养gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba中火煮12小时。收集细胞，在200 μL 0.8 × ASW-m1溶液中重悬，冷藏30 min。加入3.0 μg破坏质粒，冰育1 h后，ASW-AA-m1-S培养细胞gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba85℃，不含尿嘧啶的培养基48小时。将200 μL接种于新鲜ASW-AA-m1-S中gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba培养基和在相同条件下进一步培养，以富集显示尿嘧啶原质体的转化子。将培养物分散于添加7.5 g L的ASW-YT-m1固体培养基上gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}5-FOA和60 mM NaOH。只有经历了弹出式重组的细胞才能在5-FOA的存在下生长。85℃培养48 h后，选择菌落，采用引物组dTK0548outF/0548outR和dTK2268outF/2268outR (gydF4y2Ba表4gydF4y2Ba）.在ASW-YT-m1-S中选择能扩增出预期大小DNA产物的转化子进行培养gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba媒介。DNA测序也证实了基因破坏。gydF4y2Ba

酶活性测定gydF4y2Ba

以谷氨酸和丙酮酸分别作为氨基供体和氨基受体，对TK0548和TK2268蛋白的转氨酶活性进行初步检测。除非另有说明，转氨酶活性在80°C下测定。TK0548蛋白的标准反应混合物为:20 μM PLP, 10 mM Glu, 10 mM pyruvate, 6.24 mM NaCl, 0.4 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}重组蛋白在50 mM HEPES缓冲液(pH7.4)。TK2268蛋白的标准反应混合物含有20 μM PLP、10 mM Glu、10 mM丙酮酸、8.8 mM KCl、0.18% (v/v)甘油和4 μg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}重组蛋白在50 mM HEPES缓冲液(pH7.4)。当测定PLP对活性的依赖性时，忽略PLP，测定添加或不添加10 mM羟胺时的活性。当省略PLP而不添加羟胺时，氨基供体和受体分别为10 mM Leu和10 mM 2-oxoglutarate。在羟胺存在下，用苯丙氨酸和2-氧戊二酸测定TK0548蛋白反应，用Asp和丙酮酸测定TK2268蛋白反应。将不含氨基给体和氨基受体的反应混合物在80℃下预孵育2 min，加入氨基给体和氨基受体开始反应。在80°C下进一步孵育5或15分钟后，通过将反应混合物在冰上冷却10分钟来停止反应。蛋白质用Amicon Ultra-0.5离心过滤单元与Ultracel-10膜(Millipore)去除。衍生化后用高效液相色谱法测定了Glu和Ala的生成。衍生化混合液(100 μL)中含有10 μL反应混合液、70 μL B溶液[硼酸氢氧化钠缓冲液(0.4 M, pH 10.4)]和20 μL A溶液(8 mggydF4y2BaogydF4y2Ba-酞醛和10毫克gydF4y2BaNgydF4y2Ba-乙酰半胱氨酸溶于1ml甲醇)。在室温下衍生化5 min后，用Nexera X2液相色谱系统，RF-20A XS荧光检测器(Shimadzu, Kyoto, Japan)，取10 μL溶液到COSMOSIL 5C18-PAQ填充柱(4.6ID × 250 mm)。化合物用20mm醋酸钠(pH 5.6)和甲醇溶液洗脱，流速为0.7 mL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}．激发波长为350 nm，发射波长为450 nm。gydF4y2Ba

为筛选TK0548和TK2268蛋白识别的氨基酸，以20个氨基酸为氨基酸供体，以2-羟戊二酸或丙酮酸为氨基酸受体。以Tyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Glu为氨基供体，以2-氧戊二酸或丙酮酸为氨基受体，分析TK0548蛋白的转氨酶活性。TK2268蛋白以Glu、Asp、Cys、Leu、Ala、Met和Tyr为氨基供体，以2-氧戊二酸或丙酮酸为氨基受体。将标准反应混合物在80℃下孵育3,5,7分钟(与His和Glu的反应混合物在80℃下孵育1,2,3分钟)，以确认产物生成随时间呈线性。gydF4y2Ba

对于TK0548蛋白反应的动力学分析，用10 mM 2-羟戊二酸盐检测了不同浓度的Phe, Trp, Tyr, Met和His的反应速率。用10 mM苯丙氨酸检测了不同浓度的2-氧戊二酸和丙酮酸的反应速率。为了分析TK2268蛋白，用10 mM丙酮酸盐或10 mM 2-氧戊二酸盐检测不同浓度Asp, Glu, Tyr和Leu的反应速率。用10 mM Leu检测不同浓度的2-氧戊二酸盐和丙酮酸盐的反应速率。动力学参数通过使用IGORPRO 6.03版(Wave-Metrics, Lake, Oswego, OR)将数据拟合到Michaelis-Menten方程得到。gydF4y2Ba

增长的测量gydF4y2Ba

在asw - y -m1- s中检测宿主株KU216和基因破坏株ΔTK0548、ΔTK2268的生长特性gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba和ASW-AA-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba(+ Ura所言)媒体。细胞在富含营养的ASW-YT-m1-S培养基中预培养gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba15 h至固定期，接种到ASW-YT-m1-S中gydF4y2Ba^0gydF4y2Ba介质或合成介质ASW-AA-m1-SgydF4y2Ba^0gydF4y2Ba(+ Ura所言)。的ODgydF4y2Ba_660gydF4y2Ba对培养物进行监测。gydF4y2Ba

无细胞提取物的活性测定gydF4y2Ba

Thermococcus kodakarensisgydF4y2BaKU216、ΔTK0548和ΔTK2268破坏株在ASW-YT-m1-pyruvate培养基中培养20 h，离心(6000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 15分钟，4°C)。超声干扰细胞，去除不溶性细胞碎片(12000 ×gydF4y2BaggydF4y2Ba， 30分钟，4℃)。用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO 10000)将缓冲液与50 mM HEPES(含150 mM NaCl, pH7.4)交换后，测定无细胞提取物中的转氨酶活性。对于His、Tyr和Asp的转氨酶活性，反应混合物中含有20 μM PLP、10 mM氨基供体(Tyr最终浓度为6 mM)、10 mM氨基受体(2-氧戊二酸或丙酮酸)、5.76 mM NaCl和0.384 mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}50 mM HEPES缓冲液中的无细胞提取物(pH7.4)。对于色氨酸，反应混合物含有20 μM PLP、10 mM氨基给体、10 mM氨基受体(2-羟戊二酸盐)、2.88 mM NaCl和0.182 mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}50 mM HEPES缓冲液中的无细胞提取物(pH7.4)。在Glu, Ile和Phe的情况下，反应混合物含有20 μM PLP, 10 mM氨基供体，10 mM氨基受体(2-氧戊二酸或丙酮酸)，0.576 mM NaCl和0.0384 mg mLgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}50 mM HEPES缓冲液中的无细胞提取物(pH7.4)。将不含氨基受体的反应混合物在80℃下预孵育2 min，加入氨基受体开始反应。在80℃进一步孵育1、2、3 min(以Asp和Ile为氨基给体时，反应混合物分别在80℃孵育4、6、8 min和2、4、6 min)。将反应混合物放在冰上冷却10分钟，停止反应。蛋白质用Amicon Ultra-0.5离心过滤单元与Ultracel-10膜(Millipore)去除。衍生化后用高效液相色谱法测定了Glu和Ala的生成。gydF4y2Ba

数据可用性声明gydF4y2Ba

该研究中提出的原始贡献已包括在文章/中gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba，可向通讯作者查询。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

HA设计了实验。YS进行生化和遗传实验。YM进行生物信息学分析。所有作者都参与了数据分析，撰写了手稿，并批准了提交的版本。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究部分由JSPS kakeni资助号JP19H05679 (Post-Koch Ecology)和JP19H05684资助给HA。这项工作得到了JST SPRING的部分支持，资助号JPMJSP2110和JST，为创建科学技术创新而建立的大学奖学金，资助号JPMJFS2123。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

本文的补充资料可在以下网址找到:gydF4y2Ba//www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2023.1126218/full#supplementary-materialgydF4y2Ba

参考文献gydF4y2Ba