极地微生物Picrophilus torridus携带DNA腺嘌呤甲基化酶m . pti，是I型限制性修饰系统的一部分

1.介绍

DNA甲基化通常发生在腺嘌呤和胞嘧啶残基上。而腺嘌呤的甲基化发生在第6位(N⁶-甲基腺嘌呤:m6A)，胞嘧啶的甲基化发生在第4位(N⁴-甲基胞嘧啶:m4C)，或内环作用于第5位(5-甲基胞嘧啶:m5C)。真核生物中主要的DNA甲基化标记是m5C，而在细菌中m6A甲基化标记是最普遍的。甲基化标记DNA有两个独特的作用:其一，它调节DNA与蛋白质的相互作用，从而影响DNA复制、DNA错配修复和基因表达;其二，它保护细菌和古菌基因组免受自身限制系统的自我破坏(Pingoud等人，2014；安东和罗伯茨，2021年)．

在细菌和古生菌中介导DNA甲基化的酶使用s -腺苷蛋氨酸(AdoMet)作为甲基供体，要么是孤儿甲基转移酶，要么是限制性修饰系统的组成部分。孤儿甲基转移酶(没有同源限制性内切酶)与调节dna相关交易(如复制和转录)的甲基化事件有关。Dam甲基化酶以5 ' -GATC-3 '序列中的腺嘌呤甲基化为靶点，是其中最著名的(Adhikari和Curtis, 2016年)．甲基化酶是限制性内切修饰(R-M)系统的一个组成部分，被设计用来保护基因组免受由生物体所携带的同源限制性内切酶的攻击。R-M系统与细胞对外来DNA的防御有关，限制性内切酶(RE)将未在其特定识别序列上甲基化的外源DNA裂解。由于基因组上的识别位点被同源修饰甲基化酶(MTase)甲基化，宿主基因组仍然对切割具有抗性。这种甲基转移酶可以是三种类型的R-M系统的组成部分:类型I-III (Loenen等人，2014b)．

I-III型R-M系统在亚基结构和组织、识别序列和裂解位点以及辅因子要求方面存在差异。在广泛发现的II型R-M系统中，修饰甲基化酶和限制性内切酶功能存在于识别相同回文序列的独立酶中，内切酶在(非甲基化的)识别序列内或在识别序列外切割DNA。I型和III型R-M系统是复杂的多亚基酶，修饰甲基化酶和限制性内切酶功能位于同一酶，尽管亚基不同(Rao等人，2014；Loenen等人，2014a)．III型R-M系统包括两个亚基:Mod和Res。Mod负责DNA上短的不对称识别序列的识别及其甲基化，而Res介导位点下游25-27 bp的DNA切割。I型R-M系统包括三个亚基:S、M和R，通常以1S、2M和2R亚基的五聚体形式存在。它们能识别一种特定的二部分DNA序列通过它们的S(特异性)亚基，在识别序列上修改DNA通过它们的M(修饰)亚基，并通过数百个碱基对外的R(限制)亚基切割DNA。限制性内切酶仅作为多亚基1S2M2R酶的一部分以活性形式存在，修饰甲基化酶也可以以独立于R亚基的活性形式存在，作为与S亚基的复合物，它依赖于DNA序列识别(M2S1)。

虽然DNA甲基化及其影响在细菌和真核生物中已被广泛研究，但在古生菌中仍是一个知之甚少的领域。古生菌的主要甲基化标记是m6A和m4C，而m5C迄今仍未在这些生物中检测到。单分子实时测序(SMRT)已经对几种细菌和古细菌的DNA甲基组进行了分析。在一次里程碑式的努力中，Blow等人(2016)分析了230种细菌和古细菌的DNA甲基化组。他们的研究确定了超过800个甲基化基序，强调了这些生物群体之间的多样性程度(Blow等人，2016年)．其他研究包括对嗜热太古菌DNA甲基化组的分析Thermococcus onnurineus在那里，除几个m4C位点外，还检测到超过2000个m6A位点(Lee等人，2016)，并鉴定了海洋thaumarchaeote基因组中超过99%的motif 5 ' -GATC-3 '和5 ' -AGCT-3 '的DNA甲基化亚硝基毛蚶SPOT01分别在腺嘌呤和胞嘧啶上(Ahlgren等人，2017)．高热嗜酸菌的DNA甲基化组硫化叶菌acidocaldarius在5 ' -AGATCC-3 '和5 ' -GGATCT/C-3 '两个不同的基因组环境中发现5 ' -GATC-3 '基序中携带m6A标记(女装设计师和琳达斯，2018年)，在先前被确定为SuaI/M靶位点的5’-GGCC-3’基序上也检测到m4C标记。SuaI限制修改系统(Prangishvili等，1985；甘,2003)．

一些R-M系统已经在古菌基因组中被注释，但很少被描述。最早被纯化和研究的是II型限制性内切酶ThaI热原体属acidophilum（麦康奈尔等人，1978)， 3种II型限制性内切酶产甲烷球菌属aeolicus（Schmid等人，1984)的第II型R-M系统甲烷细菌属wolfei（Lunnen等人，1989年)、三套第II型R-M系统甲烷细菌属thermoformicicum压力(诺林和德沃斯，1992a，b)， PspG1 Type II R-M系统由a海床物种(摩根等人，1998年；Pingoud等人，2003年)和SuaI/M。苏艾II型R-M系统硫化叶菌acidocaldarius（Prangishvili等，1985；甘,2003)．在古生菌中研究过的其他II型R-M系统是pai /M。PabI在海床abyssi（石川等人，2005年；渡边等人，2006年)的II型限制性内切酶SuiI硫化叶菌islandicus（铃木和黑泽明，2016年)和TkoI和TkoII型IIG R-M系统Thermococcus kodakarensis（Zatopek等人，2021)．迄今为止在古生菌中研究的唯一I型R-M系统是在Haloferax volcanii（Ouellette等，2018)．

本研究旨在研究嗜热嗜酸太古菌的DNA甲基化Picrophilus torridus。最初被孤立于日本北部的一个盐田Picrophilus该物种是迄今为止分离到的最嗜酸的生物，在55-60°C的pH值为0.7时生长最佳，细胞内pH值为~4.6 (Schleper et al.， 1995)．当1.55 Mb的基因组Picrophilus torridus已测序(Futterer等人，2004年)，即使92%的基因组是编码序列，它也被发现富含at(64%)。我们的研究发现基因组中存在m6A甲基化，但未检测到dam介导的甲基化。本研究通过检测I型R-M系统基因组序列中的修饰甲基化酶进行了进一步研究，因为迄今为止所有I型R-M系统都表现出m6A甲基化活性。重组蛋白(m.pti)被发现在广泛的条件下介导DNA腺嘌呤甲基化在体外,并鉴定了对甲基化活性至关重要的残基。

2.材料与方法

2.1.Picrophilus torridus培养和基因组DNA分离

Picrophilus torridus(菌株DSM 9790)按前文所述进行培养(阿罗拉等人，2014年)．简单地说，细胞在55°C的曝气液体培养中生长，培养基pH为1.0，其中包括酵母提取物(0.2%，Difco，美国)、葡萄糖(1%，Sigma，美国)、磷酸二氢钾(0.3%)、硫酸镁(0.05%)、氯化钙(0.025%)和硫酸铵(0.02%)。为了进行生长分析，以1% (v/v)的接种量在不同pH值的培养基中开始培养，从pH值为1.0的发酵剂中开始培养₆₀₀~ 1.5。通过测量OD监测生长情况₆₀₀在14天内每24小时一次。并行设置三个实验，并将三个实验的平均值绘制成图形，用误差条表示标准偏差。从指数生长中分离出基因组DNAPicrophilus torridus如上所述的文化(阿罗拉等人，2014年)．简单地说，将收获的细胞重悬在TEN缓冲液[20 mM Tris-Cl (pH 8.0)， 1 mM EDTA, 100 mM NaCl]中，加入月桂酰肌氨酸钠(1.6%)和Triton X-100(0.12%)，用苯酚提取裂解液，用乙醇沉淀基因组DNA。

2.2.m . pome基因的克隆

编码S亚基的约1.3 kb基因被扩增掉Picrophilus torridus基因组DNA使用引物PtS-F (5 ' -TAAGATCTCATGAATAAAAAGGATTATAAT-3 ')和PtS-R (5 ' - tactcgagatcaccacttattttcap -3 ')，校对酶Phusion DNA聚合酶(NEB，美国)。将扩增子克隆到pUC19中，然后亚克隆到pETDuet-1载体的BglII-XhoI位点(Novagen，美国)，从而获得pET-Duet/PtS克隆。用引物PtM- f (5 ' - tagaattcgatggcagatttaaactg -3 ')和PtM- r (5 ' -TAGCGGCCGCTTC ATAGTAACCAAG-3 ')分别扩增出编码M亚基的约1.7 kb基因，将扩增子克隆到pUC19，再亚克隆到pET-Duet和pET-Duet/PtS的eci - noti位点，分别获得pET-Duet/PtM和pET-Duet/PtSM质粒。

2.3.PtM突变体的创建

所有诱变剂均采用Phusion DNA聚合酶PCR检测。以质粒pUC/PtM为模板制备PtM突变体。PtM- f引物与PtM结合PCR得到c端缺失突变体_{Δ537 - 576}- r(5“-TAGCGGCCGCTTTATTGTCTATATATAAAG-3”)。将得到的约1.6 kb扩增子克隆到pJET载体上，再亚克隆到pETDuet/PtS的EcoRI-NotI位点上，得到质粒pETDuet/PtSM_{Δ537 - 576}。采用重叠PCR法获得NPPW和xxGxxG突变体。为了使NPPW基序发生突变，使用引物PtM-F和PtM-N360A-W363A-R (5 ' -CTGGTTC)扩增该基因的n端部分GCTGGAGGCGCC用引物PtM-N360A-W363A-F (5 ' -GTTGC)扩增基因c端部分GGCGCCTCCAGCGAACCAG-3 ')和PtM-R。将PtM-F和PtM-R引物扩增得到的全长扩增子克隆到pJET载体上，亚克隆到pETDuet/PtS的EcoRI-NotI位点上，得到质粒pETDuet/PtSM_N360A-W363A。为了使xxGxxG基序发生突变，使用引物PtM-F和PtM-G284S-R (5 ' -CCTGCAGTT)扩增该基因的n端部分遗传算法使用引物PtM-G284S-F (5 ' -CCGGCATGT)扩增基因c端部分TCAACTGCAGG-3 ')和PtM-R。将引物PtM-F和PtM-R获得的全长扩增子克隆到pJET载体上，亚克隆到pETDuet/PtS的eci - noti位点上，得到质粒pETDuet/PtSM_G284S。

2.4.PtS突变体的产生

M.PtoI /秒_{211 - 222 (g)}是用重叠PCR创建的。利用引物PtS- f和PtS获得突变扩增子n端片段_{211 - 222 (g)}-R (5 ' -GGCCCCGGCCC cagctccacctgcccccccctgccaactgtatttcctt -3 ')和突变扩增子的c端片段使用引物PtS进行扩增_{211 - 222 (g)}-F (5 ' -GCAGGAGCAGGGGCAGGTGGAGCTGGGGCCGGGGCCTTCTGAAGGCATC-3 ')和PtS-R。利用PtS- f和PtS- r扩增全长突变基因，连接到pET-Duet载体的BglII-XhoI位点，生成pET-Duet/PtS质粒_{211 - 222 (g)}。随后将PtM基因克隆到pETDuet/PtS的EcoRI-NotI位点_{211 - 222 (g)}生成质粒pETDuet/PtS_{211 - 222 (g)}M。

2.5.重组m.pti的表达与纯化

mtopi酶在大肠杆菌BL21密码子+细胞(Stratagene，美国)，已转化与他们的pET-Duet克隆。野生型或突变型蛋白在指数生长的细胞中被诱导表达(OD₆₀₀= 0.6-0.8)在37°C使用1 mM IPTG。细胞在37°C下继续生长3小时，然后通过离心和裂解缓冲液(100 mM Tris。Cl pH8, 150 mM NaCl, 10%甘油)含有蛋白酶抑制剂和溶菌酶。然后将细胞悬浮液在冰上孵育20分钟，并通过超声裂解。通过高速离心澄清裂解物后，使用TALON金属亲和树脂(Clonetech)对其进行钴亲和层析。裂解物装载在色谱柱树脂上，色谱柱被广泛清洗(用100 mM Tris。Cl (pH 8)， 1 M NaCl, 10%甘油)，结合蛋白用100 mM Tris洗脱。Cl (pH 8)， 250mm咪唑，10%甘油。M. pti的M亚基同样从pET-Duet/PtM转化的细菌中纯化。

2.6.Picrophilus torridus基因组DNA甲基化分析

采用点印迹法分析分离出的基因组DNAp . torridus如上所述的文化。为此，1 μg基因组DNA用EcoRI酶切，然后用0.3 N氢氧化钠变性30分钟。然后用1 M醋酸铵中和，然后在Hybond N上染色⁺尼龙膜(GE医疗，美国)使用Bio-Dot设备(Bio-Rad实验室，美国)。膜在80°C下烘烤2小时，然后用抗m6a抗体(Sigma Aldrich, Cat。不。ab572)或抗m5c抗体(EpiGentek, Cat.No.;a - 1014 - 010)。这是通过用10%的脱脂牛奶(Difco Laboratories)在室温下堵塞烘烤的斑点印迹一个小时，用1X PBS- t清洗斑点两次，然后用抗m6a或抗m5c抗体(1:1000 dil在1X PBS中)在4℃下孵育过夜。在用1X PBS-T洗涤三次后，用酶标二抗(1:10000 dil, Jackson实验室，美国)孵育印迹1小时，并使用化学发光方法显影。

2.7.DNA甲基化试验

DNA甲基化分析使用点印迹法进行，其中lambda DNA(作为底物)从噬菌体颗粒中分离出来大肠杆菌大坝⁻扩张型心肌病⁻菌株(DNA购自美国Thermo;猫号:SD0021)。在含有100 μM s-腺苷蛋氨酸(AdoMet;(购自美国NEB公司)、2-巯基乙醇12mm、氯化钠20mm、DNA 1 μg、1.4 μM。pti，在55°C下放置1小时。用100 mM EDTA停止反应。如上所述，用斑点印迹法分析反应。用ImageJ分析对印迹进行定量，m6A比值参照大肠杆菌在同一斑点上发现的基因组DNA被确定。每个实验做三次。该图描述了三个实验的平均值，误差条表示标准偏差。

2.8.CD光谱分析

CD光谱学与之前一样进行(阿罗拉等人，2014年)．简单地说，用Jasco J-815分光光度计使用0.1 cm路径长度的比色皿分析蛋白质(100 μg在10 mM磷酸钾缓冲液(pH 5.8)中)。CD光谱在室温下记录在250-190 nm范围内，扫描速度为200 nm/min，扫描步长为1 nm。所展示的光谱是20次扫描的平均值。数据被描述为平均剩余椭圆度(MRE)。

2.9.同源建模和结构分析

M. pti的M和S亚基结构用Phyre2 (proteinhomology /模拟y r绝大多数识别eNgine 2.0版)在线服务器(凯利等人，2015年)．¹预测模型的可靠性通过QMean和LG评分(Benkert et al.， 2009)．²在这两种情况下，所考虑的模型都对各自的模板显示了较高的覆盖率。所有的结构都是可视化的，并使用PyMOL创建插图^3.（Mooers 2016)．

3.结果

3.1.Picrophilus torridus基因组携带甲基化腺嘌呤残基

研究开始于检查生物在不同ph介质中的生长模式。获得的数据显示，而p . torridus在pH值为0.7和1.0时，生长相当缓慢;在pH值为2.0时，生长相当缓慢;在pH值为3-5时，没有生长迹象(图1一个)．为了确定这种微生物在其生长的极端条件下是否存在DNA甲基化，从其基因组DNA中分离出来p . torridus细胞生长在pH值在0.7到2之间的培养基中，DNA用如上所述的斑点斑点法进行分析。得到的结果清楚地表明Picrophilus torridus基因组携带甲基化腺嘌呤残基(m6A)，无论其生长的pH值如何，尽管在pH值0.7时甲基化水平较低(图1 b)．未检测到m5C甲基化(图1 c)，由于缺乏高质量的抗体，我们无法评估m4C甲基化。

之前的一项研究小池等人(2005)已经确立了存在的大坝基因在几种古生菌中包括p . torridus通过计算分析，但大坝介导的腺嘌呤甲基化没有实验验证p . torridus。以检查甲基化状态p . torridus在Dam靶位点(5 ' -GATC-3 ')的基因组中，我们利用DpnI限制性内切酶的特性，该酶可以裂解甲基化的GATC位点，但不裂解未甲基化的GATC位点。基因组DNA分离自Picrophilus因此，在pH为1.0的培养基中生长的细胞被DpnI消化，观察到当大肠杆菌基因组DNA被酶切割p . torridus基因组DNA不是(图1 d)，也不是S.pombe基因组DNA(缺乏m6A甲基化，从图1 b)．这些数据表明，虽然p . torridus基因组携带m6A标记，生物体没有dam介导的腺嘌呤甲基化。

对p . torridus基因组序列(KEGG数据库)⁴透露出除了大坝基因，欧律古菌具有编码II型R-M系统和I型R-M系统的基因。迄今为止鉴定的所有I型修饰甲基化酶都是m6A甲基化酶，因此我们研究了m6A的修饰甲基化酶p . torridusI型R-M系统。这三个基因p . torridus编码R、M和S亚基的I型R-M系统位于环状基因组较低链的单个操纵子中(图1 e)．修饰甲基化酶(以下简称M. pto)的研究从克隆编码M和S亚基的基因开始。

3.2.m . pti携带典型I型修饰甲基化酶的所有基序

M. pti基因(M和S亚基分别命名为PtM和PtS)使用针对已发表的p0078和p0077序列(分别编码M和S亚基)设计的引物进行扩增，如材料和方法所述。对获得的pUC克隆进行测序验证。利用Clustal Omega和BLASTp分析，将M. pti的M和S亚基序列与典型的I型修饰甲基化酶EcoKI和EcoR124I以及鉴定出的古菌Hvo MTase (HVO_2270-71)的序列进行比较(西弗斯等人，2011)．⁵虽然M亚基与其他酶的M亚基在55-85%的覆盖范围内具有~ 25-28%的序列同一性(图2)，其S亚基在23-25%的范围内与相应的S亚基(补充图S1)．使用相同的工具将M亚基序列与典型II型系统的修饰甲基化酶序列进行比较，发现尽管它们都含有下面讨论的特征基序(补充图S2)，总体上没有明显的序列一致性(数据未显示)，反映了I型和II型修饰甲基化酶在结构和亚基组成上的差异。

m6A和m4C甲基化酶有9个保守基序，25年前通过分析40多个DNA mtase (马龙等人，1995年)．通过在已发表的mtase结构的背景下检查这些motif，现在知道motif I-III和X参与甲基供体s -腺苷蛋氨酸(AdoMet)的结合。有人认为，Motif I和Motif X形成了一个口袋，容纳了AdoMet的蛋氨酸基团，而Motif II和III参与了与核糖和腺嘌呤部分的相互作用。在结构和生化分析的基础上，还了解到Motifs IV-VIII是活性位点口袋的一部分，参与甲基转移反应的催化，而目标识别域(TRD)负责识别特定的DNA (马龙等人，1995年；Bheemanaik等人，2006)．在I型酶中，DNA识别不是M亚基功能的一部分，TRD位于S亚基中。I型酶的识别序列是两部分的，因此，S亚基包含两个TRD结构域。根据这些特征基序在其主要序列中的顺序，mtase被分为六类:α， β， γ， δ， ε和ζ (Bujnicki 2002)．大多数m6A和m4C甲基化酶属于α， β和γ类。所有的I型修饰甲基化酶和一些II型甲基化酶都是γ甲基化酶，其基序为X-I-II-III-IV-V-VI-VII-VIII，其中m . pti符合此顺序，见图2。mtopi中没有明确的母题II和母题III。

3.3.M. pti的M和S亚基的结构与其他I型修饰甲基化酶的结构广泛保守

虽然在几种酶的情况下，I型R-M系统的单个亚基的结构已经得到解决，但迄今为止只有两种I型修饰甲基化酶的全酶(M2S1)结构是可用的。EcoKI修饰的甲基化酶结构(pdb id: 2Y7C和2Y7H)是基于18 Å分辨率的单粒子电镜结构(Kennaway等人，2009年)．最新的EcoR124I修饰甲基化酶和限制性内切酶结构是基于单颗粒低温电镜(4.54 Å分辨率)提出的(Gao等，2020)．两种mta酶的M和S亚基的基本结构以及不同亚基之间相互作用的界面在很大程度上是保守的。利用Phyre2模型预测了M. pti的M和S亚基的结构。使用PyMOL查看建模结构，它允许我们将获得的结构叠加到各自的模板上，以分析结构对齐。

最可靠的M亚基模型使用EcoR124I酶作为模板(pdb ID: 7BTQ;Gao等，2020)．预测的M亚基结构与7BTQ cryo-EM结构中M亚基结构的相似性为27% (4.54 Å)，覆盖率为83%(残基89 ~ 153和164 ~ 569)。如在图3，在主序列中排列的7个motif (图2)也在结构上对齐。I型RM系统的M亚基是典型的c端螺旋结构，参与与S亚基的相互作用，M. pti的M亚基也包含这个保守的螺旋c端结构域(图3)．

得到的最可靠的S亚基结构使用了的S亚基Methanocaldococcus jannaschiiI型R-M系统(pdb ID: 1YF2;Kim等人，2005年)作为模板。m . pti的S亚基与m . pti的1YF2 x射线晶体结构具有30%的同源性m . jannaschiiS亚基(2.4 Å)，超过~97%的覆盖率(氨基酸6-106和121-437)。I型系统的S亚基包含两个trd(目标识别域)，它们的方向相互颠倒。每个TRD携带一个球状结构域和一个螺旋二聚结构域(Loenen等人，2014a)．球状结构域(TRDI和TRDII)图4)负责DNA的结合，n端与二部识别位点的5 '段(特定序列)结合，c端与三部识别位点的3 '段(特定序列)结合。两个trd的α -螺旋结构域(称为中央保守区或CCR，远端保守区或DCR;看到图4)相互关联，使两个球状域在固定的距离上分开，从而固定了二部识别位点中非特异性间隔序列的长度。m . pti的S亚基结构被预测为相似的，有两个trd，每个trd包含一个球状结构域和一个α螺旋结构域(图4)．

I型酶的S和M亚基通过一个四螺旋束相互作用(无论是在M2S1中还是在R2M2S1复合体中)，该四螺旋束由两个M亚基的c端螺旋结构域组成(在CTD中描述)图3)和S亚基的两个α -螺旋结构域(描述为CCR和DCR)图4)．由于这些区域在M. pti的M和S亚基中是保守的，因此使用基于模板的对接来预测M. pti全酶(M2S1)的结构，通过M. pti的M和S预测三维结构的叠加(图3，4M.EcoR124I全酶结构(pdb:7BTQ)。M2S1全酶的M亚基与M2S1全酶的M亚基相互作用通过它们的n端结构域，以及M和S子基相互作用通过四螺旋束(图5)．

通过创建M: M. pti /M的c端缺失突变体，实验验证了M的c端螺旋结构域在介导与S亚基相互作用中的作用_{Δ537 - 576}，并分析其与s相互作用的损失。为此，重组m . pti蛋白被纯化大肠杆菌。重组m . pti(全长)在大肠杆菌使用pET-Duet表达载体，允许同时表达来自两个独立T7的两个蛋白质虫胶启动子，其中一个蛋白在n端与His标签融合表达。M和S亚基在BL21密码子+中同时表达大肠杆菌来自pETDuet/ psm克隆的细胞(如方法中所述)，使M被his标记。细胞裂解液进行钴亲和层析。SDS-PAGE分析显示洗脱液在化学计量量上携带两种亚基，使我们得出结论，M. pti全酶(M2S1)在宿主细菌中组装，允许S亚基与his标记的M (图6)．在创建M的c端缺失时，排除了537-576氨基酸(方法中详细的诱变)和M_{Δ537 - 576}在pETDuet/PtSM的BL21密码子+细胞中与S共表达_{Δ537 - 576}克隆。当这些细胞裂解物被放入TALON珠中时，洗脱液只携带截断的M亚基，清楚地表明M. pti /M中失去了与S的相互作用_{Δ537 - 576}（图6 b左面板，第四车道)。根据纯化的M的CD谱图的比较，该缺失没有引起M亚基的任何重大结构变化。图6 b，右面板，第四车道)和m.pti /M_{Δ537 - 576}（图6 c)．综上所述，这些结果表明M的c端螺旋结构域在m.pti中是功能保守的。

通过创建突变S亚基，研究了S亚基的中央螺旋区在介导M-S相互作用中的作用，其中中央保守区(CCR)的12个氨基酸被交替的甘氨酸和丙氨酸残基的12个氨基酸延伸所取代，从而生成m . pti /S_{211 - 222 (g)}(详见“方法”)。当重组m.pti /S_{211 - 222 (g)}蛋白质是从大肠杆菌用钴亲和层析法发现，洗脱馏分中M:S的比例显著增加(图6 d(4车道)，表明被替换区域在M-S相互作用中起着重要的中介作用。野生型和突变型M. pti蛋白CD谱的差异很可能反映了两者M:S化学计量的差异(图6 e)．

野生型和突变型m . pti蛋白的M-S相互作用也使用纯化蛋白进行了检测。为此，M和S亚基分别表达于大肠杆菌携带M或S基因的pET/Duet克隆细胞。所有M亚基的n端均带有His标记，用共亲和树脂固定。将含有重组S亚基的全细胞裂解液(野生型或突变型)加入反应中，洗去未结合的部分后，用咪唑洗脱结合部分(M亚基加上任何相互作用的S亚基)并进行分析。如在补充图S3S亚基与野生型M亚基(5巷)互作，与突变型M互作失败_{Δ537 - 576}突变体S_{211 - 222 (g)}亚基与M亚基相互作用的程度明显低于野生型S(比较7巷和5巷)。这些数据证实了M亚基c端和S亚基211-222残基在维持M-S相互作用中的作用。

3.4.m . pti在腺嘌呤残基上甲基化DNA在体外

利用从噬菌体中分离出来的未甲基化的lambda DNA，分析了纯化的m . pti在腺嘌呤残基处甲基化DNA的能力大坝⁻扩张型心肌病⁻大肠杆菌压力。使用抗m6a抗体在斑点印迹法中分析反应，如方法中所述。活性测定在pH值超过3 - 7的Tris-acetate缓冲液中，在0-100 mM的氯化钠存在下，在55°C下进行1小时。如在图7m . pti能够在pH值为4至7的范围内甲基化lambda DNA(产生m6A)，在pH值为5时检测到最佳活性，接近生物体的细胞内pH值4.6。较高的盐浓度不利于活性，0-20 mM NaCl时活性最佳。因此，所有进一步的实验都在含有20 mM NaCl的Tris-acetate缓冲液(pH为5)中进行。在0-50 mM的醋酸镁溶液中，确定了支持DNA甲基化反应的最佳镁离子浓度。研究发现，虽然甲基化反应需要镁，但浓度超过5-25 mM的镁对甲基化反应的支持程度或多或少相当，浓度高于50 mM的镁对甲基化反应具有抑制作用(图7 b)．甲基化反应在大约前45分钟几乎线性进行之前显示出初始滞后，超过60分钟后趋于平稳(图7 c)．mpti甲基化DNA的能力与浓度有关，在200 ~ 600 nM之间几乎呈线性增加，之后趋于稳定(图7 d)．高浓度的酶(2000 nM及以上)被证明是有害的，可能是由于蛋白质聚集发生在这样的高浓度。在37-70°C的不同温度下进行分析时，发现m.p oti在37-65°C的温度下具有活性，在55 - 60°C时活性最大，这与它生长的条件一致(图7 e)．AdoMet支持甲基化反应的浓度范围为10-500 μM，以50-100 μM为最佳(图7 f)．有趣的是，当AdoMet浓度为1 mM时，酶表现出底物抑制。此外，即使在没有外源添加AdoMet的情况下，该酶也能够甲基化DNA，尽管程度要小得多，这表明内源AdoMet通过纯化过程仍然与M亚基结合。这对于这类酶来说并不罕见，在BpmI、BseMII和EcoR124II (德雷尔等人，1996年；Jurenaite-Urbanaviciene等人，2001；巴斯等人，2002年)．不出所料，ATP的加入对甲基化活性没有影响(数据未显示)。综上所述，结果在图7建立m6A mti酶活性。

3.5.mpti中的NPPW和xxGxxG基序对甲基化活性至关重要

I型修饰甲基化酶，像大多数腺嘌呤甲基化酶一样，由它们在M亚基中所包含的两个主要结构域所代表:AdoMet结合结构域(motifs X, I- iii in图2，3.)，以及负责甲基从供体转移到将要甲基化的核苷酸的催化结构域(图IV-VIII)图2，3.)．两个特别重要的基序是adomet结合基序I (FxGxxG)和催化基序IV (NPPY/F/W)。催化第四主题在于表面的口袋里的米子单元和甲基化的时候具体腺嘌呤残渣翻转的双螺旋DNA衬底与芳香的口袋栈残留以及与第一个氨基酸之间形成氢键的主题(可以用D S或N),稳定直接接收的甲基转移到目标上的氨基腺嘌呤(Bheemanaik等人，2006)．基于与其他I型酶的序列比对(图2)， M中的FxGxxG基序位于残基282 ~ 287,NPPW基序位于残基360 ~ 363 (图8)．通过开发突变酶并分析其活性，评估了这两个基序对m.p oti甲基转移酶活性的重要性。据此，第284位的甘氨酸残基突变为丝氨酸，第360位和第363位的天冬酰胺残基和色氨酸残基突变为丙氨酸(见方法)。突变的M亚基与S亚基共表达大肠杆菌细胞来自pETDuet/PtSM_G284S和pETDuet / PtSM_N360A-W363A,分别。突变酶M. pti /M_G284S和M.PtoI /米_N360A-W363A被净化(图8 b)，并使用CD光谱学评估任何总体结构变化;没有发现明显的结构变化(图8 c)．

我们评估了这两种突变酶在pH值为5、氯化钠浓度为0-50 mM的Tris-acetate缓冲液中甲基化DNA的能力。M.PtoI / M_N360A-W363A在所有测试条件下都几乎不活跃，而m.pti /M_G284S在所有测试条件下，活性均低于野生型酶(图8 d)．M. pti /M_G284S在不同浓度AdoMet处理下，与野生型m.pti进行比较。研究发现，野生型酶在50-500 μM AdoMet范围内对DNA甲基化的支持程度大致相当，而突变型酶在100-200 μM AdoMet范围内对DNA甲基化的支持程度最高(图8 e)．这些数据表明m . pti中NPPW和xxGxxG基序对m . pti活性至关重要。

4.讨论

DNA甲基化在细菌和古生菌中广泛存在，已知它可以调节各种细胞过程，并作为生物体抵御外来DNA的防御机制的一部分存在。Picrophilus torridus在极端pH值条件下生长，在pH值0.7至2时生长旺盛(图1一个)，到目前为止，还没有在这种极端条件下生长的其他微生物被分离出来。我们开始这项研究是为了检查是否Picrophilus基因组被甲基化，并发现它携带m6A修饰标记，但没有m5C标记(图1 b，C)．有趣的是，与在pH值1或2下生长相比，在pH值0.7下生长时，腺嘌呤甲基化的程度显著降低。原核生物腺嘌呤甲基化最常见的中介物是Dam甲基化酶。的大肠杆菌水坝甲基化酶调节复制起始发射的时间通过甲基化的GATC位点OriC地区。dam介导的GATC甲基化也调节甲基定向错配修复(Adhikari和Curtis, 2016年)，并已被确定为基因表达的调节因子大肠杆菌，鼠疫,鼠伤寒沙门氏菌（福克等人，2007年；布鲁内等人，2020年；Keceli Oguz等人，2022)．在细菌中广泛流行的一些古生菌也藏匿着大坝。Halobacterium saccharovorum而且甲烷细菌属菌株伊万诺夫据报道是大坝⁺早在1984年(巴贝龙等人，1984年)，以及在体外Dam甲基化酶的甲基化活性海床horikoshii已检查(梅纳德-史密斯等人，2011)．小池等人(2005)通过基因组序列注释，鉴定了多个古菌物种中的Dam甲基化酶。他们的实验分析发现热等离子体火山，热等离子体嗜酸菌,Pyrocococcus物种OT3基因组携带甲基化5 ' -GATC序列，而硫化叶菌solfataricus而且硫化叶菌shibatae未显示5 ' -GATC甲基化的证据。随后的一项研究女装设计师和琳达斯(2018)中5 ' -GATC位点的甲基化硫化叶菌acidocaldarius。Dam甲基化酶经序列注释鉴定p . torridus在研究中小池等人(2005)， 5 ' -GATC甲基化在该研究中未得到实验验证。我们的结果表明，5 ' -GATC甲基化缺乏p . torridus基因组(图1 d)，提示在这种生物体中缺乏一个活跃的Dam，并暗示R-M系统在调节生物体中腺嘌呤甲基化的可能作用。

编码单个I型R-M系统组成部分的基因通过序列注释被鉴定p . torridus基因组呈簇状，位于基因组的较低链，位置在85,223和91,251之间(图1 e)，并研究了该系统的修饰甲基化酶组分m.p oti对腺嘌呤残基甲基化的能力。M. pti的结构以及M和S亚基的相互作用界面与其他I型R-M系统(图3- - - - - -5)，并通过创建和分析合适的M和S突变蛋白(图6)，证实M亚基通过其c端螺旋结构域(CTDs)与S亚基的中央保守区(CCR)相互作用。利用重组蛋白对mpti甲基化DNA的能力进行了评价在体外化验。研究发现，在反映生物体生活方式和生理状态的pH值和温度条件下，活性最佳(数字7，E)．m . pai II型修饰甲基化酶海床abyssi已发现在95°C时甲基化DNA与在65°C时一样多，但在85°C时最优，并且在pH值5.8至6.7时表现出最佳活性，类似地反映了超嗜热生物的生长和细胞内条件(渡边等人，2006年)．研究发现镁离子对m.pti活性(图7 b)．镁离子(但不是钙或锰离子)也被发现对m.e ecop15i甲基转移酶活性至关重要。对M.EcoP15I的CD光谱分析显示，随着镁离子浓度的增加，酶的二级结构发生了变化，这表明镁离子诱导的构象变化发生在催化反应之前。镁结合基序突变导致酶失活(比斯特和饶，2003年)．早期对EcoBI和MmeI甲基转移酶的研究表明，镁离子的存在虽然不是甲基化反应所必需的，但却刺激了甲基化反应(Lautenberger和Linn, 1972；Tucholski等人，1995年)．m . pti在AdoMet浓度25 ~ 500 μM范围内具有活性，在AdoMet浓度为1 mM时表现出底物抑制作用。纯化的蛋白质很可能含有内源性AdoMet，因为即使反应中没有添加AdoMet，它也表现出甲基化活性(图7 f)，这也是其他一些甲基转移酶的特征(德雷尔等人，1996年；Jurenaite-Urbanaviciene等人，2001；巴斯等人，2002年)．

m . pti具有腺嘌呤甲基转移酶的所有特征基序(图2)．通过对其他DNA甲基转移酶的结构和生化研究，揭示了这些基序的功能作用。甲基化反应是由碱基翻转机制介导的，其中目标腺嘌呤残基翻转出双螺旋结构进入催化口袋(Goedecke等人，2001年)．Motif IV (NPPW)是催化口袋的主要组成部分，翻转靶腺嘌呤与天冬酰胺残基的相互作用对催化至关重要。结构和生化研究的数据使我们相信N⁶NPPW基序的天冬酰胺侧链可能使氨基极化，促进甲基从AdoMet直接转移到腺嘌呤N上⁶位置(Pogolotti等人，1988年；Labahn等人，1994年；Goedecke等人，2001年；Bheemanaik等人，2006)．基序最后位置的色氨酸残基可以被任何其他芳香残基取代，对催化活性没有显著影响，但被其他残基取代对催化活性有负面影响(威尔科克等人，1994年；艾哈迈德等人，1995年；Pues et al.， 1999)．与这些发现相一致的是，M. pti /M_N360A-W363A基序IV突变体甲基化DNA严重受损(图8 d)．AdoMet结合酶的结构研究以及深入的突变分析和生化分析共同揭示了motif I在AdoMet结合中起着重要作用，尽管它没有直接参与催化作用本身（Labahn等人，1994年；威尔科克等人，1994年；艾哈迈德等人，1995年；罗斯等人，1998年；Goedecke等人，2001年)．有可能m.pti /M_G284A突变体显示出较弱的AdoMet结合，因为突变体(不像野生型酶)纯化时似乎没有内源性AdoMet大肠杆菌由于在0 μM的AdoMet中没有检测到催化作用(图8 e)．综上所述，这些数据表明，motif I和motif IV的功能在m.p opi中可能是保守的。

迄今为止，在古菌中只研究了一种I型R-M系统:古菌Haloferax volcanii。中注释了几个maseHaloferax基因组序列，单分子实时测序和基因敲除分析的结合，已经证明只有两个基序在基因组中甲基化，其中一个甲基化在胞嘧啶残基上通过第二种酶(5 ' -GCAm6BN6VTGC-3 ')被I型腺嘌呤修饰甲基化酶(Ouellette et al.， 2015，2018)．I型修饰甲基化酶含有这些酶的所有基序。有趣且不同寻常的是，腺嘌呤甲基化仅在二段识别序列的前半部分被检测到，这表明该序列的后半部分在较低的链上没有甲基化，或者甲基化在两条链上没有等价地发生，因此在测序过程中未被检测到。

综上所述，这里提供的数据表明，即使是在如此极端的条件下(如Picrophilus torridus)显示DNA甲基化。我们发现m6A而不是m5C甲基化的证据p . torridusGATC甲基化的缺失表明该生物缺乏活性坝。我们的结果表明，类型I R-M系统注释p . torridus基因组序列是活跃的，并介导m6A甲基化。我们无法分析在活的有机体内m . pti的作用Picrophilus物种不受基因操纵的影响。试图进行互补分析大肠杆菌大坝⁻菌株(来自印度CSIR-CCMB的Manjula Reddy实验室收集的礼物)没有成功，因为在该菌株中M和S亚基没有得到表达(来自pASKIBA43PLUS中的四环素驱动启动子系统)，该菌株缺乏argU，ileY称,leuWtRNA基因(补充图S4)．未来的研究将致力于鉴定M2R2S1的靶位点和鉴定M2R2S1。

数据可用性声明

支持本文结论的原始数据将由作者提供，毫无保留地提供。

作者的贡献

SS和MG设计了该项目。PG和AS进行了研究并准备了数据。PG、AS、MG和SS对数据进行分析。这篇论文是党卫军写的。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

致谢

我们感谢中央仪器设备，德里大学南校区的DNA测序和CD光谱仪的使用。我们感谢Manjula Reddy (CSIR-CCMB，海德拉巴，印度)为我们提供了一个大肠杆菌大坝⁻从她的实验室系列。

利益冲突

作者声明，这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这些关系可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意

本文中所表达的所有主张仅代表作者，并不代表他们的附属组织，也不代表出版商、编辑和审稿人。任何可能在本文中评估的产品，或可能由其制造商提出的声明，都不得到出版商的保证或认可。

补充材料

本文的补充资料可在以下网址找到://www.gosselinpr.com/articles/10.3389/fmicb.2023.1126750/full#supplementary-material

脚注

参考文献